Name: preparation steps for measurement of reactivity in mouse retinal arterioles ex vivo
Uploaded: 2018-05-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Ernst und Berta Grimmke Stiftung og Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (hunden).

Eksperimentell prosedyrene for denne studien ble godkjent av dyr omsorg komiteen av Rheinland-Pfalz, Tyskland. Dyr omsorg likedannet institusjonelle retningslinjer og foreningen for forskning i visjon og Oftalmologi (ARVO) erklæringen for bruk av dyr i ophthalmica og visjon forskning. Dyrene ble behandlet i henhold til EUs direktiv 2010/63/EU for dyreforsøk. Mannlige C57BL/6J mus (Jackson laboratoriet, Bar havn, meg, USA) i alderen 3-4 måneder ble brukt for eksperimenter. Dyrene ble plassert under standard betingelser...

<ol>
	<li>Toda, N., Nakanishi-Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide:+ocular+blood+flow,+glaucoma,+and+diabetic+retinopathy.">Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).</li><li>Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography-based+retinal+vessel+analysis+for+the+evaluation+of+hypertensive+vasculopathy.">Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy.</a> Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).</li><li>Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+perfusion+pressure+and+ocular+blood+flow+in+glaucoma.">Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma.</a> Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).</li><li>Faraci, F. M., Sigmund, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+biology+in+genetically+altered+mice+:+smaller+vessels,+bigger+insight.">Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight.</a> Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Retinal+Blood+Flow+Using+Fluorescently+Labeled+Red+Blood+Cells.">Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells.</a> eNeuro. 2 (2), (2015).</li><li>Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+free+measurement+of+retinal+blood+cell+flux,+velocity,+hematocrit+and+capillary+width+in+the+living+mouse+eye.">Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye.</a> Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).</li><li>Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+topography+of+retinal+pericytes+in+the+living+mouse+retina+using+in+vivo+adaptive+optics+imaging+and+ex+vivo+characterization.">Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtype+mediating+cholinergic+vasodilation+in+murine+retinal+arterioles.">Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+alpha1-adrenoceptor+subtypes+in+murine+ophthalmic+arteries.">Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).</li><li>Bohmer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha(1)B+-adrenoceptor+subtype+mediates+adrenergic+vasoconstriction+in+mouse+retinal+arterioles+with+damaged+endothelium.">The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium.</a> Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).</li></ol>

Måling av vaskulær svar i musen netthinnen er utfordrende på grunn av den lille størrelsen på netthinnen blodkar. Med presentert teknikken, er netthinnen arterioler visualisert ved overført * lys. Dette er mulig fordi isolert netthinnen er gjennomsiktig. Fordelen med teknikken er høy optisk oppløsning. Den beregnede romlig oppløsningen er 11 px/µm. Men er den virkelige oppløsningen for optisk system som bruker hvitt lys mellom 200 og 300 nm, som forklares ved Abbe Diffraksjon grensen. Siden den første grenen ...

Forstyrrelser i netthinnen perfusjon har vært innblandet i patogenesen av ulike øyet sykdommer, som diabetisk retinopati, Hypertensiv retinopati og glaukom1,2,3. Dermed studier måle vaskulær reaktivitet i netthinnen er viktig å forstå i Patofysiologien ved disse sykdommene, og for å utvikle ny behandling tilnærminger.
På grunn av muligheten for genet manipulasjon i murine genomet, har musen blitt en utbredt dyr modell for studier av kardiovaskulære systemet4. Men på grunn av den lille størrelsen på netthinnen blodkar (≤ 30 µm) er måling av vaskulær reaktivitet i musen netthinnen utfordrende. For eksempel stereomicroscopic teknikker for måling i vivo er begrenset i sin optisk oppløsning og derfor bare tillate å nøyaktig oppdage endringer i diameter eller blod flyte i små blod mindre enn ≤ 30 µm diameter når utstyrt med mer sofistikert enheter, for eksempel et AC confocal mikroskop med fluorescerende fargestoffer eller Adaptive optikk skanning lyset oftalmoskop5,6. Videre endringer tolkningen av i vivo mål som tar sikte på å identifisere lokale signalering mekanismer i netthinnen blodkar kan bli tilbakevist av anestesimidler, i systemisk blodtrykk og påvirkning av retrobulbar blodkar.
Derfor utviklet vi en metode for å måle svar av musen retinal blod fartøy med høy optisk oppløsning ex vivo. Teknikken presenteres her kan visualisering av netthinnen arterioler via overføres * lys. Denne metoden, som kan også brukes i rotter, gir tilgang til fordelene av genet målretting teknologi i okulær vaskulær forskning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Steel Scissors</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3576.1</td>
			<td>1x 140 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-19390</td>
			<td>1x straight, 10.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers, straight with fine tips</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>LH68.1</td>
			<td>2x type 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers, straight with extra fine tips</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>LH53.1</td>
			<td>2x type 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas capsulotomy scissors</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>19760</td>
			<td>1x straight, 77 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91501-09</td>
			<td>1x curved,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barraquer Needle Holder</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-17500</td>
			<td>1x curved, 120 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305128</td>
			<td>1x 30 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries (for producing micropipettes)</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>9-000-1211</td>
			<td>1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Suture</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>198001</td>
			<td>1x 10-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>1x 35 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td>1x 100 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discofix C</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16500C</td>
			<td>10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl adhesive</td>
			<td>B. Braun Surgical, S.A.</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyclic pump&#160; (CYCLO II)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>EP76.1</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller Model 700C</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Vanox-T AH-2)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera (TK-C1381)</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>self-made</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K928.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>261.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0965.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-(D)-(+)- Glucose monohydrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6780.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9,11-dideoxy-9&#945;,11&#945;-methanoepoxy prostaglandin F2&#945; (U-46619)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation steps for measurement of reactivity in mouse retinal arterioles ex vivo

Vaskulær insuffisiens og endringer i normal retinal perfusjon er blant de viktigste faktorene for patogenesen av ulike sight-truende øyet sykdommer, som diabetisk retinopati, Hypertensiv retinopati og muligens glaukom. Netthinnen mikrovaskulær forberedelser er derfor avgjørende verktøy for fysiologiske og farmakologiske studier for å avgrense de underliggende patofysiologiske mekanismene og design terapi for sykdommer. Til tross for den vide bruken av musen modeller i ophthalmica forskning er studier på netthinnen vaskulær reaktivitet mangelvare i denne arten. En viktig grunn til dette avviket er de utfordrende isolering prosedyrene på grunn av den lille størrelsen på netthinnen blodkar, som er ~ ≤ 30 µm luminal diameter. For å omgå problemet med direkte isolering av disse retinal microvessels for funksjonell studier, etablert vi en isolasjon og forberedelse teknikk som gjør at ex vivo studier av musen retinal vasoactivity under nær fysiologiske forhold . Selv om dagens eksperimentelle forberedelsene spesielt gjelder mus retinal arterioler, kan denne metodikken lett anvendes til microvessels fra rotter.

U-46619 produsert konsentrasjon-avhengige vasoconstrictor svar i netthinnen arterioler fra vill-type mus på C57Bl/6J bakgrunnen. I en konsentrasjon av 10-6 M var reduksjon i luminal diameter ≈50% fra hvile diameter. Figur 9A viser en representant konsentrasjon-respons kurve av en netthinnen arteriole. I arterioler preconstricted med U46619, kumulative administrasjon av acetylcholine fremkalles konsentrasjon-avhengige øker luminal diameter til ?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo at JoVE.com

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Mange visjon-truende øyet sykdommer er assosiert med dysfunksjonelle retinal microvessels. Måling av netthinnen arteriole svar er derfor viktig å undersøke de underliggende patofysiologiske mekanismene. Denne artikkelen beskriver en detaljert protokoll for musen retinal arteriole isolasjon og forberedelser for å vurdere effekten av vasoactive stoffer på vaskulær diameter.

Forberedelsene for måling av reaktivitet i musen Retinal arterioler Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

In vivo Måling av Mouse Pulmonal endotel Overflatesjikt

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F MR for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell for å studere Hormone Handling i Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterin Telemetri å måle Mouse kontraktile Trykk<em&gt; I Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

I Vivo og Ex Vivo tilnærminger til Study Ovarian Cancer Metastatisk Kolonisering av Milky Spot Structures i Peritoneal adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

In vivo Dynamics of Netthinne mikrogliaceller Aktivering Under Nevrodegenerasjon: Confocal oftalmoskopiske Imaging og Cell morfometri i Mouse Glaukom

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Nedbryting av museceller fra menneske tumorxenotransplantater forbedrer Nedstrøms Analyse av Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Echocardiographic Measurement of Right Ventricular Diastolic Parameters in Mouse

Echocardiographic måling av høyre ventrikkel diastolisk parametre i mus

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV ...