Name: preparation steps for measurement of reactivity in mouse retinal arterioles ex vivo
Uploaded: 2018-05-08T12:30:00
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Este trabalho foi apoiado por concessões do und Ernst Berta Grimmke Stiftung e da Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (cão).

Os procedimentos experimentais deste estudo foram aprovados pelo Animal conta Comissão de Renânia-Palatinado, Alemanha. Cuidados com animais em conformidade com as orientações institucionais e a associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) instrução para o uso de animais em oftalmologia e visão pesquisa. Animais foram tratados de acordo com a directiva da União Europeia 2010/63/UE para experiências em animais. Masculinos camundongos C57BL/6J (The Jackson Laboratory, Porto da barra, ME, EUA), com 3-...

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	<li>Toda, N., Nakanishi-Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide:+ocular+blood+flow,+glaucoma,+and+diabetic+retinopathy.">Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).</li><li>Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography-based+retinal+vessel+analysis+for+the+evaluation+of+hypertensive+vasculopathy.">Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy.</a> Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).</li><li>Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+perfusion+pressure+and+ocular+blood+flow+in+glaucoma.">Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma.</a> Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).</li><li>Faraci, F. M., Sigmund, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+biology+in+genetically+altered+mice+:+smaller+vessels,+bigger+insight.">Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight.</a> Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Retinal+Blood+Flow+Using+Fluorescently+Labeled+Red+Blood+Cells.">Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells.</a> eNeuro. 2 (2), (2015).</li><li>Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+free+measurement+of+retinal+blood+cell+flux,+velocity,+hematocrit+and+capillary+width+in+the+living+mouse+eye.">Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye.</a> Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).</li><li>Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+topography+of+retinal+pericytes+in+the+living+mouse+retina+using+in+vivo+adaptive+optics+imaging+and+ex+vivo+characterization.">Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtype+mediating+cholinergic+vasodilation+in+murine+retinal+arterioles.">Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+alpha1-adrenoceptor+subtypes+in+murine+ophthalmic+arteries.">Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).</li><li>Bohmer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha(1)B+-adrenoceptor+subtype+mediates+adrenergic+vasoconstriction+in+mouse+retinal+arterioles+with+damaged+endothelium.">The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium.</a> Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).</li></ol>

A medição das respostas vasculares na retina do rato é um desafio devido ao pequeno tamanho de vasos da retina. Com a técnica apresentada, arteríolas retina são visualizadas por microscopia de luz transmitida. Isso é possível, porque a retina isolada é translúcida. A vantagem da técnica é a alta resolução óptica. A resolução espacial calculada é 11 px/µm. No entanto, a resolução real para este sistema óptico que utiliza a luz branca é entre 200 e 300 nm, que é explicado pelo limite de difração d...

Distúrbios na perfusão da retina têm sido implicados na patogênese de várias doenças oculares, como retinopatia diabética, retinopatia hipertensiva e glaucoma1,2,3. Assim, estudos que visam medir a reatividade vascular na retina são importantes para compreender a fisiopatologia dessas doenças, e desenvolver novo tratamento se aproxima.
Devido à possibilidade de manipulação genética no genoma murino, o mouse tornou-se um modelo animal utilizado para estudos do sistema cardiovascular4. No entanto, por causa do pequeno tamanho dos vasos sanguíneos da retina (≤ 30 µm), medição de reatividade vascular na retina do rato é um desafio. Por exemplo, stereomicroscopic técnicas para a medição na vivo são limitadas em sua resolução óptica e, portanto, só permitem exatamente detectar alterações no fluxo de diâmetro ou sangue no sangue pequeno de menos de 30 µm de diâmetro ≤ quando equipado com dispositivos adicionais de sofisticados, tais como um microscópio confocal usando corantes fluorescentes ou a óptica adaptativa digitalização luz oftalmoscópio5,6. Além disso, a interpretação das medições na vivo vista identificar locais sinalização mecanismos nos vasos da retina podem ser confundidos por anestésicos, altera na pressão arterial sistêmica e a influência dos vasos sanguíneos de retrobulbar.
Portanto, nós desenvolvemos um método para medir respostas de rato dos vasos sanguíneos da retina com alta resolução óptica ex vivo. A técnica apresentada neste documento permite visualização das arteríolas retina através de transmitidas microscopia de luz. Esse método, que também pode ser usado em ratos, fornece acesso às vantagens do gene segmentação tecnologia na investigação vascular ocular.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Steel Scissors</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3576.1</td>
			<td>1x 140 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-19390</td>
			<td>1x straight, 10.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers, straight with fine tips</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>LH68.1</td>
			<td>2x type 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers, straight with extra fine tips</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>LH53.1</td>
			<td>2x type 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas capsulotomy scissors</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>19760</td>
			<td>1x straight, 77 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91501-09</td>
			<td>1x curved,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barraquer Needle Holder</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-17500</td>
			<td>1x curved, 120 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305128</td>
			<td>1x 30 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries (for producing micropipettes)</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>9-000-1211</td>
			<td>1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Suture</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>198001</td>
			<td>1x 10-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>1x 35 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td>1x 100 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discofix C</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16500C</td>
			<td>10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl adhesive</td>
			<td>B. Braun Surgical, S.A.</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyclic pump&#160; (CYCLO II)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>EP76.1</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller Model 700C</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Vanox-T AH-2)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera (TK-C1381)</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>self-made</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K928.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>261.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0965.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-(D)-(+)- Glucose monohydrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6780.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9,11-dideoxy-9&#945;,11&#945;-methanoepoxy prostaglandin F2&#945; (U-46619)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation steps for measurement of reactivity in mouse retinal arterioles ex vivo

Insuficiência vascular e alterações na perfusão retiniana normal estão entre os fatores principais para a patogênese de várias doenças oculares visão em risco, tais como retinopatia diabética, retinopatia hipertensiva e, possivelmente, glaucoma. Portanto, preparações microvasculares da retina são ferramentas cruciais para estudos fisiológicos e farmacológicos delinear os mecanismos fisiopatológicos subjacentes e a concepção terapias para as doenças. Apesar da ampla utilização de modelos de rato em pesquisa oftálmica, estudos sobre a reatividade vascular da retina são escassos nesta espécie. Das principais razões para esta discrepância é os desafiante procedimentos de isolamento devido ao tamanho pequeno destes vasos sanguíneos da retina, que é ~ ≤ 30 µm de diâmetro luminal. Para contornar o problema de isolamento direto destes microvessels da retina para estudos funcionais, estabelecemos uma técnica de isolamento e preparação que permite ex vivo estudos de vasoactivity da retina do rato sob condições fisiológicas perto . Embora as preparações experimentais presentes irão se referir especificamente as arteríolas retina do rato, esta metodologia prontamente pode ser empregada para microvessels de ratos.

U-46619 produziu respostas vasoconstritor dependente da concentração em arteríolas da retina de ratos do selvagem-tipo do fundo C57Bl/6J. Em uma concentração de 10-6 M, diminuição do diâmetro luminal foi ≈50% do diâmetro de descanso. Figura 9A mostra uma curva concentração-resposta representativa de uma arteríola retinal. Em arteríolas preconstricted com U46619, cumulativa administração de acetilcolina evocados dependente da concen...

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Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Muitas doenças oculares visão em risco estão associadas com microvessels da retina disfuncional. Portanto, a medição das respostas arteríola retinal é importante para investigar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes. Este artigo descreve um protocolo detalhado para isolamento de rato arteríola retinal e preparação para avaliar os efeitos de substâncias vasoativas no diâmetro vascular.

Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

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Medicina

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