Name: preparation steps for measurement of reactivity in mouse retinal arterioles ex vivo
Uploaded: 2018-05-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo at JoVE.com

Detta arbete stöds av bidrag från det Ernst und Berta Grimmke Stiftung och Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (hunden).

De experimentella rutiner av denna studie godkändes av Animal Care kommittén av Rheinland-Pfalz, Tyskland. Djurvård överensstämde de institutionella riktlinjer och föreningen för forskning i Vision och oftalmologi (ARVO) redogörelse för användningen av djur i oftalmologiska och vision forskning. Djur behandlades enligt EU direktiv 2010/63/EU för djurförsök. C57BL/6J hanmöss (The Jackson Laboratory, Bar Harbour, mig, USA) som åldern 3-4 månader användes för experiment. Djur har varit inhysta under standa...

<ol>
	<li>Toda, N., Nakanishi-Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide:+ocular+blood+flow,+glaucoma,+and+diabetic+retinopathy.">Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).</li><li>Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography-based+retinal+vessel+analysis+for+the+evaluation+of+hypertensive+vasculopathy.">Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy.</a> Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).</li><li>Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+perfusion+pressure+and+ocular+blood+flow+in+glaucoma.">Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma.</a> Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).</li><li>Faraci, F. M., Sigmund, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+biology+in+genetically+altered+mice+:+smaller+vessels,+bigger+insight.">Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight.</a> Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Retinal+Blood+Flow+Using+Fluorescently+Labeled+Red+Blood+Cells.">Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells.</a> eNeuro. 2 (2), (2015).</li><li>Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+free+measurement+of+retinal+blood+cell+flux,+velocity,+hematocrit+and+capillary+width+in+the+living+mouse+eye.">Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye.</a> Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).</li><li>Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+topography+of+retinal+pericytes+in+the+living+mouse+retina+using+in+vivo+adaptive+optics+imaging+and+ex+vivo+characterization.">Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtype+mediating+cholinergic+vasodilation+in+murine+retinal+arterioles.">Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+alpha1-adrenoceptor+subtypes+in+murine+ophthalmic+arteries.">Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).</li><li>Bohmer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha(1)B+-adrenoceptor+subtype+mediates+adrenergic+vasoconstriction+in+mouse+retinal+arterioles+with+damaged+endothelium.">The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium.</a> Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).</li></ol>

Mätning av vaskulär svaren i mus näthinnan är utmanande på grund av den lilla storleken av näthinnans blodkärl. Med den presenterade tekniken visualiseras retinal arterioler av överförda ljusmikroskopi. Detta är möjligt, eftersom isolerade näthinnan är genomskinlig. Fördelen med tekniken är hög optisk upplösning. Den beräkna rumsliga upplösningen är 11 px/µm. Men är den verkliga upplösningen för detta optiska system som använder vitt ljus mellan 200 och 300 nm, vilket förklaras av Abbe diffrakti...

Störningar i retinal perfusion har varit inblandade i patogenesen av olika ögonsjukdomar, såsom diabetesretinopati, hypertensiv retinopati och glaukom1,2,3. Således, studier som syftar till att mäta vaskulär reaktivitet i näthinnan är viktigt att förstå patofysiologin av dessa sjukdomar och för att utveckla ny behandling närmar sig.
På grund av möjligheten att genen manipulation i murina genomet blivit musen en allmänt använd djurmodell för studier av det kardiovaskulära system4. Men på grund av den lilla storleken av retinala blodkärl (≤ 30 µm) är mätning av vaskulär reaktivitet i mus näthinnan utmanande. Exempelvis stereomicroscopic tekniker för i vivo mätning är begränsade i sin optisk upplösning och därför endast tillåta exakt upptäcka förändringar i diameter eller blod flöde i små blod understiger ≤ 30 µm diameter när utrustad med ytterligare sofistikerade enheter, till exempel confocal Mikroskop med fluorescerande färger eller adaptiv optik Scanning Light oftalmoskop5,6. Dessutom förändringar signalerar mekanismer i näthinnans blodkärl kan vara tvetydiga på grund av anestetika, tolkningen av i vivo mätningar syftar till att identifiera lokala i systemiska blodtrycket och påverkan av retrobulbär blodkärl.
Därför har vi utvecklat en metod för att mäta Svaren av mus retinala blodkärl med hög optisk upplösning ex vivo. Tekniken presenteras häri gör visualisering av retinal arterioler via överförs ljusmikroskopi. Metoden kan också användas hos råttor, ger tillgång till fördelarna med genmodifiering teknik i okulär vaskulära forskning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Steel Scissors</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3576.1</td>
			<td>1x 140 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-19390</td>
			<td>1x straight, 10.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers, straight with fine tips</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>LH68.1</td>
			<td>2x type 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers, straight with extra fine tips</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>LH53.1</td>
			<td>2x type 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas capsulotomy scissors</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>19760</td>
			<td>1x straight, 77 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91501-09</td>
			<td>1x curved,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barraquer Needle Holder</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-17500</td>
			<td>1x curved, 120 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305128</td>
			<td>1x 30 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries (for producing micropipettes)</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>9-000-1211</td>
			<td>1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Suture</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>198001</td>
			<td>1x 10-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>1x 35 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td>1x 100 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discofix C</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16500C</td>
			<td>10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl adhesive</td>
			<td>B. Braun Surgical, S.A.</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyclic pump&#160; (CYCLO II)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>EP76.1</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller Model 700C</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Vanox-T AH-2)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera (TK-C1381)</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>self-made</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K928.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>261.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0965.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-(D)-(+)- Glucose monohydrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6780.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9,11-dideoxy-9&#945;,11&#945;-methanoepoxy prostaglandin F2&#945; (U-46619)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation steps for measurement of reactivity in mouse retinal arterioles ex vivo

Vaskulär insufficiens och förändringar i normala retinal perfusion är bland de viktigaste faktorerna för patogenesen av olika synhotande okulär sjukdomar, såsom diabetesretinopati, hypertensiv retinopati och eventuellt glaukom. Retinal mikrovaskulära preparat är därför avgörande verktyg för fysiologiska och farmakologiska studier att avgränsa de bakomliggande patofysiologiska mekanismerna och design terapier för sjukdomar. Trots den utbredda användningen av musmodeller i oftalmologiska forskning är studier på retinal vaskulär reaktivitet knappa hos denna art. En viktig orsak till denna diskrepans är utmanande isolering förfaranden på grund av den lilla storleken av dessa retinala blodkärl, som är ~ ≤ 30 µm i luminala diameter. För att kringgå problemet med direkt isolering av dessa retinal microvesselsna för funktionella studier, etablerade vi en isolering och förberedelse teknik som möjliggör ex vivo studier av mus retinal vasoactivity nära-fysiologiska villkor . Även om nuvarande experimentell förberedelserna kommer att specifikt hänvisa till de mus retinal arterioler, kan denna metod lätt användas för att microvesselsna från råttor.

U-46619 producerade koncentrationsberoende vasokonstriktor svaren i näthinnans arterioler från vildtyp möss C57Bl/6J bakgrunden. Vid en koncentration på 10-6 M var minskningen av luminala diameter ≈50% från vilande diameter. Figur 9A visar en representativ koncentration-respons kurva av en retinal arteriole. I arterioler preconstricted med U46619, framkallat kumulativa administrering av acetylkolin koncentrationsberoende ökning av luminala ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo at JoVE.com

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Många syn-hotande okulär sjukdomar är associerade med dysfunktionella retinal microvesselsna. Mätning av retinal arteriole Svaren därför viktigt att undersöka de bakomliggande patofysiologiska mekanismerna. I artikeln beskrivs ett detaljerat protokoll för mus retinal arteriole isolering och förberedelse för att bedöma effekterna av vasoaktiva ämnen på vaskulär diameter.

Förberedelsesteg för mätning av reaktivitet i mus Retinal arterioler Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex vivo Infektion av levande vävnad med oncolytic Virus

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

In vivo Mätning av mus Pulmonary Endothelial ytskikt

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19 F MRI för Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell för att studera Hormone Action i Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

Intrauterin Telemetry att mäta Mouse kontraktila Pressure<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

In vivo och ex vivo Approaches att studera äggstockscancer Metastatisk Colonization av Milky Spot Structures i Peritoneal Fett

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

In vivo Dynamisk av näthinnan microglial Aktivering Under neurodegeneration: Confocal oftalmoskopiska Imaging och Cell morfometri i mus Glaukom

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Utarmning av musceller från humana tumörxenotransplantat avsevärt förbättrar Nedströms analys av målceller

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Echocardiographic Measurement of Right Ventricular Diastolic Parameters in Mouse

Ekokardiografisk mätning av höger kammar diastoliska parametrar i mus

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV ...