Name: shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing
Uploaded: 2017-09-01T15:00:00
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Gostaríamos de agradecer a Chuck Kimmel para orientação, John Dowd para ajudar a desenvolver esta estratégia de reprodução, Macie Walker por seu trabalho em aperfeiçoar a mancha esquelética e Charline Walker e Bonnie Ullmann para conselhos úteis zebrafish. Este trabalho foi financiado pelo DE024190 K99/R00 para JTN.

todos os experimentos descritos neste protocolo foram concluídos em conformidade e cumprimento da Universidade do Colorado e a Universidade de Oregon institucional Animal cuidado e uso de comitês (IACUC).
 1. preparando o estoque desmarcado começando <ol><li>identificar heterozigotos portadores do alelo mutante de interesse pela barbatana clip- 11 e um estoque de animais completo-irmão de genotipagem por um método de escolha, tais como KASP 12...

<ol>
	<li>Nichols, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligament+versus+bone+cell+identity+in+the+zebrafish+hyoid+skeleton+is+regulated+by+mef2ca.">Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca.</a> Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).</li><li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ahsa1+and+Hsp90+activity+confers+more+severe+craniofacial+phenotypes+in+a+zebrafish+model+of+hypoparathyroidism,+sensorineural+deafness+and+renal+dysplasia+(HDR).">Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR).</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).</li><li>Cox, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+of+variant+histone+H3.3+for+ectomesenchyme+potential+of+the+cranial+neural+crest.">An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).</li><li>DeLaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mef2ca+in+developmental+buffering+of+the+zebrafish+larval+hyoid+dermal+skeleton.">Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton.</a> Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).</li><li>McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Craniofacial+Morphogenesis+in+Zebrafish+Using+4D+Confocal+Microscopy.">Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (83), e51190 (2014).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. (29), e1394 (2009).</li><li>Lush, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progeny+test+and+individual+performance+as+indicators+of+an+animal's+breeding+value.">Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value.</a> J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).</li><li>Lerner, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).</li><li>Shinya, M., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Highly+Homogeneous+Strains+of+Zebrafish+Through+Full+Sib-Pair+Mating.">Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating.</a> G3. 1 (5), 377-386 (2011).</li><li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCAPS,+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms:+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics.">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).</li><li>Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Efficient+Zebrafish+Genotyping+Using+PCR+with+High-resolution+Melt+Analysis.">Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).</li><li>He, C., Holme, J., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping:+the+KASP+assay.">SNP genotyping: the KASP assay.</a> Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).</li><li>Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+Kompetitive+Allele+Specific+PCR+(KASP):+overview+of+the+technology+and+its+application+in+crop+improvement.">Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement.</a> Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).</li><li>Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+high+throughput+and+cost+effective+SNP+genotyping+platforms+in+soybean.">Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean.</a> Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).</li><li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae.">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).</li><li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment.">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Schilling, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaw+and+branchial+arch+mutants+in+zebrafish+I:+branchial+arches.">Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches.</a> Development. 123, 329-344 (1996).</li><li>McCune, A. R., Carlson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+ways+to+lose+your+bladder:+common+natural+mutants+in+zebrafish+and+widespread+convergence+of+swim+bladder+loss+among+teleost+fishes.">Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes.</a> Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).</li><li>Mrakov&#269;i&#269;, M., Haley, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inbreeding+depression+in+the+Zebra+fish+Brachydanio+rerio+(Hamilton+Buchanan).">Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan).</a> J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).</li><li>Charlesworth, D., Willis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+inbreeding+depression.">The genetics of inbreeding depression.</a> Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).</li><li>McCune, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+genomic+number+of+recessive+lethals+in+natural+populations+of+bluefin+killifish+and+zebrafish.">A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish.</a> Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).</li><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+(Brachydanio+rerio).">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li><li>Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+social+behavior+in+young+zebrafish.">Development of social behavior in young zebrafish.</a> Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).</li><li>Eames, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FishFace:+interactive+atlas+of+zebrafish+craniofacial+development+at+cellular+resolution.">FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution.</a> BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).</li><li>Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=barx1+represses+joints+and+promotes+cartilage+in+the+craniofacial+skeleton.">barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton.</a> Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).</li><li>Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edn1+and+hand2+Interact+in+early+regulation+of+pharyngeal+arch+outgrowth+during+zebrafish+development.">edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development.</a> PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).</li></ol>

Reprodução seletiva revela sutilezas da função dos genes
Deslocando os fenótipos mutantes para ser mais ou menos grave por reprodução seletiva é uma maneira simples de ganhar novos insights sobre a função do gene. Quando comparado com os métodos padrão de reprodutores selecionados, o protocolo apresentado aqui pode render uma compreensão muito mais completa dos fenótipos mutantes. Especificamente, gerando tensões que são graves, a amplitude total dos fenótipos...

O peixe-zebra é um sistema poderoso modelo para a compreensão do desenvolvimento esquelético. Com cepas mutantes zebrafish, biólogos podem decifrar a função dos genes durante a skeletogenesis. No entanto, zebrafish esquelético fenótipos mutantes podem apresentar com penetrância variável1,2,3,,4 que pode dificultar as análises genéticas e do desenvolvimento. A finalidade desse método é triplo. Primeiro, gerar zebrafish linhas mutantes que consistentemente produzem fenótipos graves permite a jusante do desenvolvimento estudos como lapso de tempo de gravação transplantação de5 e6. Esses tipos de estudos podem ficar inválidos ao tentar estudar fenótipos que apenas manifestam inconsistentemente. Em segundo lugar, consanguinidade zebrafish cepas pode diminuir a variação do fundo genético, promovendo assim a reprodutibilidade e consistência experimental. Por exemplo, realizando todos os em situ podem reduzir variabilidade confundimento e reforçar conclusões análises de hibridação em uma estirpe seletivamente pura. Em terceiro lugar, gerar tensões graves e suaves irá revelar toda a série fenotípica que pode resultar de uma mutação específica.
À primeira vista, a reprodução seletiva de mutantes letais parece impossível. Como pode uma raça para penetrância quando os animais que são marcados para seleção estão mortos? Felizmente, métodos de reprodução seletiva por seleção de família, especificamente a descendência testes, demonstraram eficácia na pecuária programas para muitos anos7,8. Estes programas são usados principalmente para reprodução seletiva para os traços que só estão presentes em um sexo, como a produção de leite em vacas ou produção de ovos em galinhas. Os machos destas espécies não podem ser marcados diretamente, mas seus descendentes são marcados e um valor é atribuído aos pais. Endividamento a partir desta estratégia, o protocolo aqui apresentado envolve marcando o fixo e manchados mutante prole de um par de zebrafish que são heterozigotos para um gene mutante de interesse. A penetrância de um fenótipo na prole mutantes letais homozigotos é atribuída aos pais quando decidir quais indivíduos irão produzir a próxima geração da linha. Achamos que este método é um meio eficaz de deslocamento penetrância em zebrafish mutantes esquelética letal1.
Similar a outros estudos, este protocolo de reprodução seletiva leva sob critérios de consideração como tamanho da embreagem, sobrevivência da prole, normal desenvolvimento de embriões e uma relação de sexo9. No entanto, esses fatores são considerados no contexto de um fundo mutante com o objetivo de desviar a penetrância mutante. Portanto, este protocolo amplia paradigmas anteriores de reprodução seletiva, oferecendo um método para fortalecer as análises mutantes do desenvolvimento, bem como aumentar a homogeneidade de fundo.
Este protocolo requer genotipagem extensa, por isso é importante desenvolver um protocolo confiável, rápida genotipagem com antecedência. Existem muitos genotipagem protocolos disponíveis10,11, no entanto, encontramos o KASP genotipagem12,13,14 é mais rápido, de custo mais eficiente e mais confiável do que os métodos baseada na clivagem de enzima de restrição de sequências amplificadas10. Portanto, nós incluímos um protocolo KASP neste trabalho. Além disso, podemos focar esqueléticos fenótipos mutantes neste protocolo e incluir um procedimento para Alcian Blue/alizarina Red coloração modificada de anteriores protocolos15.
O método descrito aqui é uma estratégia simples para comutação penetrância mutante letal para cima ou para baixo. Enquanto este protocolo incide sobre fenótipos mutantes esqueléticos, acreditamos que vai ser uma estratégia útil para a criação de todas as linhas de zebrafish mutante. De fato, a utilidade desta estratégia de reprodução provável estende-se além do zebrafish. Prevemos que este protocolo pode ser modificado para deslocar penetrância em uma ampla gama de organismos. Penetrância letal de movimento através do teste de progênie pode ajudar a impulsionar o progresso de qualquer geneticista do desenvolvimento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Paraformaldehyde, pelleted, solid</td>
			<td style="width:125px;">Ted Pella Co.</td>
			<td style="width:119px;">18501</td>
			<td style="width:167px;">Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride, solid</td>
			<td style="width:125px;">Acros Organics</td>
			<td>223210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x PBS, Aqueous</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">190 proof Ethanol</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alcian Blue, solid</td>
			<td style="width:125px;">Anatech Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">867</td>
			<td>Must be from Anatech</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alizarin Red, solid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5533-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP229 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP263500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium hydroxide,&#160; solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">P250 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">StepOnePlus Real-time PCR Machine</td>
			<td style="width:125px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL)</td>
			<td style="width:125px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4346906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microseal &#39;B&#39; seal</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">MSB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KASP Master Mix, High ROX</td>
			<td style="width:125px;">LGC</td>
			<td>KBS-1016-022</td>
			<td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KASP By Design Primer Mix</td>
			<td style="width:125px;">LGC</td>
			<td style="width:119px;">KBS-2100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris HCl, solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP153 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">potassium chloride, solid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP366 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween-20, liquid</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP337 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nonidet P40</td>
			<td style="width:125px;">ThermoFisher</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:125px;">Western Chemicals</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1700 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T100 Thermal Cycler</td>
			<td style="width:125px;">BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Controlled Drop Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:125px;">Fisher</td>
			<td>13-678-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:125px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>for DNA quantitation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shifting zebrafish lethal skeletal mutant penetrance by progeny testing

Zebrafish fenótipos mutantes são frequentemente incompleta penetrante, manifestando-se apenas em alguns mutantes. Fenótipos interessantes que aparecem de forma inconsistente podem ser difícil de estudar e podem levar a confundir os resultados. O protocolo descrito aqui é um paradigma de reprodução simples para aumentar e diminuir penetrância em mutantes esquelético zebrafish letal. Porque os mutantes letais não podem ser seletivamente criados diretamente, a estratégia de reprodução seletiva clássico de teste de progênie é empregada. Esse método também inclui protocolos para Kompetitive alelo específico do PCR (KASP) genotipagem zebrafish e coloração zebrafish larval de cartilagem e osso. Aplicar a estratégia de criação descrita aqui pode aumentar a penetrância de um fenótipo esquelético interessante, permitindo que mais resultados reprodutíveis em aplicações a jusante. Além disso, diminuindo a penetrância mutante através desta estratégia de reprodução seletiva pode revelar os processos de desenvolvimento que requerem mais crucialmente a função do gene mutado. Enquanto o esqueleto é especificamente considerado aqui, propomos que esta metodologia será útil para todas as linhas mutantes zebrafish.

Este protocolo é uma técnica de maneio a longo prazo útil para a compreensão do zebrafish esquelético os mutantes (Figura 1). Reprodução seletiva através do teste de progênie deve produzir uma mudança em geral penetrância descendente e ascendente em poucas gerações (Figura 2). Em nosso trabalho anterior, duas rodadas de reprodução seletiva dirigimos a penetrância média para baixo de 17% para 3%1...

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Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

O objetivo do presente protocolo é alterar a penetrância de letais esqueléticos fenótipos mutantes no zebrafish por reprodução seletiva. Letais mutantes não podem ser cultivados até a idade adulta e se criados, portanto este protocolo descreve um método de controle e selecionando penetrância através de várias gerações por testes de progênie.

Mudando a Penetrância em Zebrafish com mutações esquléticas letais por testes na progênie

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

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Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolamento de Pericitos Tipo I e Tipo II de Músculos Esqueléticos de Rato

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identificação de células satélite de músculo esquelético por imunofluorescência com anticorpos de laminina e Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Realizando xenoenxertos de músculo esquelético humano em camundongos imunodeficientes

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...