Name: evaluation of injury-induced senescence and in vivo reprogramming in the skeletal muscle
Uploaded: 2017-10-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle at JoVE.com

Estamos agradecidos a Clemire Cimper por su excelente soporte técnico. Trabajo en el laboratorio de H.L. fue financiado por el Instituto Pasteur, Centro Nacional para la investigación científica y la Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d ' la excelencia Revive, Investissement Avenir; ANR-10-LABX-73), la Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) y la Fundación arco (PJA 20161205028). C.C. y C.A. son financiados por el doctorado y becas postdoctorales del consorcio revivir.

los animales fueron tratados según las directrices de la Comunidad Europea y el Comité de ética de los protocolos de Institut Pasteur (CETEA) aprobado.
 1. preparaciones de las soluciones Stock <ol><li>preparar los materiales para la fijación de la muestra de músculo. Disolver 0,5 g de goma del tragacanto con 20 mL de agua a temperatura ambiente para hacer el medio de inclusión de congelación para la fijación del músculo.</li>
	<li>Preparar las soluciones para tinción SA-?...

<ol>
	<li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+from+physiology+to+pathology.">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+p16(Ink4a)-positive+cells+shorten+healthy+lifespan.">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains.">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li><li>Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+senescence-associated+secretory+phenotype:+the+dark+side+of+tumor+suppression.">The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression.</a> Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).</li><li>Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+turnover+of+senescent+cells+during+regeneration+of+a+complex+structure.">Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+senescent+cells+in+optimal+wound+healing+through+secretion+of+PDGF-AA.">An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li><li>Mosteiro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+damage+and+senescence+provide+critical+signals+for+cellular+reprogramming+in+vivo.">Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo.</a> Science. 354 (6315), (2016).</li><li>Chiche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury-Induced+Senescence+Enables+In+Vivo+Reprogramming+in+Skeletal+Muscle.">Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle.</a> Cell Stem Cell. , (2016).</li><li>Ritschka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+senescence-associated+secretory+phenotype+induces+cellular+plasticity+and+tissue+regeneration.">The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration.</a> Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency.">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).</li><li>Abad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+in+vivo+produces+teratomas+and+iPS+cells+with+totipotency+features.">Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features.</a> Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).</li><li>Ohnishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+Termination+of+Reprogramming+In+Vivo+Leads+to+Cancer+Development+through+Altered+Epigenetic+Regulation.">Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation.</a> Cell. 156 (4), 663-677 (2014).</li><li>Guardiola, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Acute+Skeletal+Muscle+Regeneration+by+Cardiotoxin+Injection.">Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li><li>Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numb+is+required+to+prevent+p53-dependent+senescence+following+skeletal+muscle+injury.">Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury.</a> Nat Commun. 6, 8528 (2015).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li><li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase.">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li><li>Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+pH+6+beta-galactosidase+activity+indicate+cell+senescence?.">Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?.</a> Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).</li><li>Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SA+beta+Gal+staining:+biomarker+or+delusion.">SA beta Gal staining: biomarker or delusion.</a> Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).</li></ol>

Aquí, presentamos un método para detectar ambos senescentes y células madre pluripotentes en el músculo esquelético de ratones reprogramables. Este método podría utilizarse para evaluar y cuantificar tanto la senescencia e inducir plasticidad celular en vivoy examinar el papel de la senescencia en la reparación de los tejidos y la regeneración.
En el protocolo actual, el ensayo asociados a senescencia de β-galactosidasa (SA-β-Gal) se utiliza para detectar en vivo l...

Senescencia celular es una forma de respuesta al estrés, caracterizada por una detención del ciclo celular estable. En la última década, investigación ha establecido firmemente que la senescencia se asocia con varios procesos biológicos y patológicos como desarrollo embrionario, fibrosis,1,2del envejecimiento del organismo. Senescencia celular primero fue identificada en fibroblastos humanos al final de su vida replicativa por3el acortamiento del telómero. Además de estrés replicativo, hay muchos otros estímulos que pueden inducir senescencia, incluyendo daño de ADN, estrés oxidativo, señales oncogénicas y alteraciones genómicas/epigenómica, cualquiera de las cuales eventualmente puede activar las vías de p53/p21 o pRB para establecer y reforzar el crecimiento permanente de detención1. Una de las características importantes de las células senescentes es que siguen siendo metabólicamente activas y enérgicamente expresan un fenotipo secretorio asociada a la senescencia (spas): secreción de citoquinas proinflamatorias, factores de crecimiento y matriz extracelular factores4. Factores de spas se han propuesto para jugar un papel importante en mediar y amplificar el efecto de la senescencia, debido a sus potentes efectos en atraer las células inmunes y alterar el tejido local y sistémica ambientes1. Curiosamente, la senescencia se ha propuesto recientemente importantes para tejido reparación y regeneración de5,6. Además, datos de varios laboratorios, incluido el nuestro, ha sugerido que la senescencia inducida por daño de tejido podría mejorar plasticidad celular, via SASPs, promover regeneración7–9. Por lo tanto, todos los datos emergentes destacan la importancia de estudiar el envejecimiento in vivo.
En la era posterior a pluripotentes inducidas (iPSC) de la célula de vástago, plasticidad celular es la capacidad de una célula para adquirir una nueva identidad y adoptar un destino alternativo cuando se expone a diferentes estímulos tanto en cultivo como in vivo10. Se conoce que reprogramación completo puede ser logrado en vivo11,12, donde la expresión de la cassette que contiene cuatro factores Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4y c-Myc (OSKM) puede ser inducida en vivo para promover la formación de teratomas en múltiples órganos. Por lo tanto, un modelo de ratón reprogramable (i4F) puede utilizarse como un sistema de gran alcance para identificar reguladores críticos y rutas que son importantes para la plasticidad celular11.
Un sistema adecuado y sensible en vivo es fundamental para comprender la senescencia celular cómo regula plasticidad celular en el contexto de la regeneración de los tejidos. Aquí, presentamos un sistema robusto y un protocolo detallado para evaluar el vínculo entre senescencia y plasticidad celular en el contexto de la regeneración de los tejidos. El combinación de cardiotoxin (CTX) inducida por daño del músculo en el grupo del músculo tibial Anterior (TA), un sistema bien establecido para el estudio de regeneración de los tejidos y el modelo de ratón i4F, permite la detección de senescencia celular y vivo en reprogramación en la regeneración muscular.
Para evaluar la relación entre la plasticidad celular y senescencia, i4F ratones son heridos con CTX para inducir daño muscular aguda y tratados con doxiciclina (0,2 mg/mL) durante 7 días para inducir la reprogramación en vivo . Mientras que una CTX induce daño muscular aguda y Protocolo de regeneración ha sido recientemente publicado13, por razones éticas, este procedimiento será omitido en el actual protocolo. Se recogerán muestras de músculo de TA a los 10 días post lesión13cuando el pico de las células senescentes se han observado previamente14. Aquí, este protocolo detallado describe todos los pasos necesarios para evaluar el nivel de senescencia (vía SA-β-Gal) y reprogramación (a través de la coloración de IHC de Nanog).
Ensayo de la senescencia asociada a beta-galactosidasa (SA-β-Gal) es el ensayo más utilizado para detectar las células senescentes en cultura en vivo15. En comparación con otros ensayos, el ensayo SA-β-Gal permite la identificación de las células senescentes en su entorno nativo con la arquitectura del tejido intacto, que es particularmente importante para el estudio en vivo . Además, es posible acoplar el ensayo SA-β-Gal con otros marcadores con IHC. Sin embargo, el análisis de SA-β-Gal requieren muestras frescas o congeladas, que sigue siendo una limitación importante. Cuando los tejidos frescos o congelados están rutinariamente disponibles, como muestras de músculo de TA congeladas, SA-β-Gal obviamente es el ensayo más adecuado para detectar las células senescentes. Nanog es el marcador utilizado para detectar células reprogramarlo por dos razones: 1) es un marcador esencial de pluripotencia; 2) más importante aún, su expresión no es conducida por doxiciclina (dox), por lo tanto detecta pluripotencia inducida por más que la expresión forzada de la cassette de Yamanaka.
Es importante tener en cuenta, los protocolos de tinción presentados en este estudio pueden realizarse por separado para simplificar el procedimiento de cuantificación, pero también se pueden hacer en un procedimiento de tinción Co para visualizar ambos senescentes y pluripotentes células madre en la misma sección.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K3Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13746-66-2</td>
			<td>For SA-&#946; Gal staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K4Fe(CN)6</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td>For SA-&#946; Gal staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td>For SA-&#946; Gal staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4252</td>
			<td>For SA-&#946; Gal staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D3447</td>
			<td>For inducing in vivo reprogramming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiotoxin</td>
			<td>Lotaxan Valence, France</td>
			<td>L8102</td>
			<td>For muscle injury</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>111-30-8</td>
			<td>For Fixation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>50-980-487</td>
			<td>For Fixation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18996-35-5</td>
			<td>For permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td>For permeabilization solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3608</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody anti- Nanog</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>8822S</td>
			<td>Rabbit monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K4010</td>
			<td>For Nanog revelation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin 1%</td>
			<td>Leica</td>
			<td>380159EOF</td>
			<td>Counterstainning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast red</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3403</td>
			<td>Counterstainning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Immu-Mount</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td>Mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt&#174;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>25608-33-7</td>
			<td>Mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td>Microscope for Nanog quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: i4F-A</td>
			<td>Abad et al., 2013</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Reprogrammable mouse model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal muscle, Tibialis Anterior</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Scanner</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Scan Z1</td>
			<td>slides scanning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of injury-induced senescence and in vivo reprogramming in the skeletal muscle

Senescencia celular es una respuesta de estrés que se caracteriza por una detención del crecimiento celular estable, que es importante para muchos procesos fisiológicos y patológicos, como cáncer y envejecimiento. Recientemente, senescencia también se ha implicado en la regeneración y reparación del tejido. Por lo tanto, se ha vuelto cada vez más crítica para identificar las células senescentes en vivo. Asociada a la senescencia de β-galactosidasa (SA-β-Gal) es el ensayo más ampliamente utilizado para detectar células senescentes tanto en cultivo como in vivo. Este ensayo se basa en el contenido lisosomal aumentado en las células senescentes, que permite la detección histoquímica de la actividad β-galactosidasa lysosomal en pH subóptimo (6 o 5.5). En comparación con otros ensayos, como citometría de flujo permite la identificación de las células senescentes en su entorno residente, que ofrece información valiosa, como la situación relativa a la arquitectura del tejido, la morfología y la posibilidad de acoplamiento con otros marcadores mediante inmunohistoquímica (IHQ). La limitación principal del ensayo SA-β-Gal es el requisito de muestras frescas o congeladas.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para entender cómo celular senescencia promueve celular regeneración del tejido y la plasticidad en vivo. Utilizamos SA-β-Gal para detectar las células senescentes en el músculo esquelético a la lesión, que es un sistema bien establecido para el estudio de regeneración de los tejidos. Además, utilizamos IHC para detectar Nanog, un marcador de las células madre pluripotentes, un modelo de ratón transgénico. Este protocolo nos permite analizar y cuantificar la senescencia celular en el contexto de plasticidad celular inducida y reprogramación en vivo .

Detección de senescencia celular inducida por la lesión muscular
Se ha demostrado recientemente que la lesión del músculo induce senescencia celular transitoria14. En 10 días posterior a la lesión (PPP), la mayoría de myofibers dañados está experimentando regeneración con núcleos centralmente localizados, un sello de regenerar myofibers, y la arquitectura del músculo se restablece. Las infiltraci...

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Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluación de la senescencia inducida por la lesión y en Vivo de reprogramación en el músculo esquelético

Aquí presentamos un protocolo detallado para detectar ambos senescentes y células madre pluripotentes en el músculo esquelético por lesión mientras que inducen reprogramación en vivo . Este método es adecuado para evaluar el papel de la senescencia celular durante la regeneración del tejido y la reprogramación en vivo.

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Investigación

Biología del Desarrollo

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Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

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Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

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