Name: dissection of human retina and rpe-choroid for proteomic analysis
Uploaded: 2017-11-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis at JoVE.com

VBM is ondersteund door subsidies van de NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 en R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant #: 2013103 en onderzoek te voorkomen blindheid (RPB), New York, NY. MT en GV worden ondersteund door de NIH T32GM007337 verlenen.

deze studie werd goedgekeurd door de Universiteit van Iowa &#39; s institutionele Review Board en houdt zich aan de beginselen die zijn uiteengezet in de verklaring van Helsinki.
 1. Foveal en Macula Biopsy Punch <ol><li>Open en vlinder het menselijk oog, zodanig dat het bestaat uit 4 aparte flappen van weefsel, zoals beschreven in een eerdere publicatie. 5</li> <li>beginnen met een butterflied menselijk oog geplaatst in een petrischaal, een 4-mm punch biopsie tool ...

<ol>
	<li>Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+changes+in+the+aging+choroid:+implications+for+age-related+macular+degeneration.">Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration.</a> Eye (Lond). , (2016).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+proteome+of+human+iris,+ciliary+body,+retinal+pigment+epithelium,+and+choroid.">Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid.</a> Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).</li><li>Funke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glaucoma+related+Proteomic+Alterations+in+Human+Retina+Samples.">Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples.</a> Sci Rep. 6, 29759 (2016).</li><li>Decanini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+retinal+pigment+epithelium+proteome+changes+in+early+diabetes.">Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes.</a> Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).</li><li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+human+vitreous+body+elements+for+proteomic+analysis.">Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li><li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+landscape+of+the+human+choroid-retinal+pigment+epithelial+complex.">Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex.</a> JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Skeie, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+vitreous+biopsy+techniques.">Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques.</a> Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).</li><li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+interactions+in+the+mouse+vitreous-retina+complex.">Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex.</a> PLoS One. 8 (11), e82140 (2013).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+vitreous+proteomics.">Translational vitreous proteomics.</a> Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).</li><li>Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+insight+into+the+molecular+function+of+the+vitreous.">Proteomic insight into the molecular function of the vitreous.</a> PLoS One. 10 (5), e0127567 (2015).</li><li>Velez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+Medicine:+Personalized+Proteomics+for+the+Diagnosis+and+Treatment+of+Idiopathic+Inflammatory+Disease.">Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease.</a> JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).</li><li>Velez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+elevated+intraocular+pressure+with+retinal+detachment.">Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment.</a> Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).</li><li>Skeie, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biorepository+for+ophthalmic+surgical+specimens.">A biorepository for ophthalmic surgical specimens.</a> Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).</li><li>Ferrer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+protein+preservation+largely+depends+on+the+postmortem+storage+temperature:+implications+for+study+of+proteins+in+human+neurologic+diseases+and+management+of+brain+banks:+a+BrainNet+Europe+Study.">Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).</li><li>Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+protein+profiles+in+tissue+samples:+differing+outcomes+with+and+without+heat+stabilization.">Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization.</a> J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).</li><li>Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Collection+Method+Bias+Effects+in+Quantitative+Phosphoproteomics.">Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).</li><li>Crecelius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+quantitative+post-mortem+changes+in+the+gray+matter+of+the+human+frontal+cortex+proteome+by+2-D+DIGE.">Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE.</a> Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).</li><li>Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+of+the+phosphoproteome+in+postmortem+mouse+brains.">Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains.</a> PLoS One. 6 (6), e21405 (2011).</li><li>Nagy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+postmortem+interval+on+biomolecule+integrity+in+the+brain.">Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+frozen+tissue+samples+using+laser+capture+microdissection.">Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection.</a> Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).</li></ol>

Na weefsel zijn collectie, sample handling en behandeling cruciaal overwegingen14. Behoud in vloeibare stikstof heeft de voorkeur boven chemische fixatie, zoals de laatste kan resulteren in schade aan eiwitstructuur, die stroomafwaarts analyse kan scheeftrekken. Daarnaast is de vloeibare stikstof behoud aangenamer zijn wanneer u de methoden die geen bevriezing van monsters. Met name Ferrer et al. toonde significante verschillen in eiwitniveaus tussen hersenen monsters bewaard bij 4 ° C o...

Het netvlies, vaatvlies en RPE zijn complexe weefsels waaruit belangrijke regionale verschillen in eiwit expressie, fysiologische functie en pathologische gevoeligheden1,2. Bijvoorbeeld, tonen ziekten zoals Age-Related macula degeneratie (LMD), retinitis pigmentosa en centrale sereuze retinopathie elke karakteristiek localisatie binnen de fovea, macula of netvlies periferie1,3, 4,6. Hier presenteren we een methode aan te tonen hoe verschillende retinal regio's kunnen onafhankelijk worden bemonsterd. Het algemene doel van deze methode is een betrouwbare gids om te verzamelen van weefselmonsters uit de foveal, macula en perifere gebieden van de menselijke netvlies en RPE-vaatvlies voor proteoom-analyse. De reden voor de ontwikkeling en het gebruik van deze techniek is dat door middel van Proteoom analyse van deze specifieke retinale gebieden, belangrijke moleculaire inzichten kunnen worden verkregen tot de functies van het fysiologische en pathofysiologische van deze regio's.
Deze aanpak belooft te onthullen de proteomic-basis voor relatieve regionale ziekte gevoeligheden, en de identificatie van nieuwe specifieke therapeutische doelen te vergemakkelijken. Inderdaad, proteomic onderzoeken van het glasvocht en zijn interacties met het netvlies hebben verstrekt belangrijke inzichten in de moleculaire samenstelling en functie van gezonde en zieke weefsel5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. echter, duidelijke vergelijkende proteomic analyses van verschillende retinale gebieden ontbreken. De techniek helpt ter ondersteuning van deze broodnodige studies, bieden voordelen ten opzichte van andere methoden door het tonen van een betrouwbare en reproduceerbare weefsel collectie aanpak. Meer nog, de aanpak is heel toegankelijk, profiteren van standaardformaat en gemakkelijk beschikbaar weefsel punch biopsie tools. Onze techniek benadrukt de juiste inzameling en opslag van weefsels voor proteomic verwerking, waardoor belangrijke overwegingen voor eiwitstabiliteit en afbraak. Dus, deze methode is meest geschikt voor onderzoekers downstream moleculaire analyse van proteomic factoren te overwegen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4-mm skin punch biopsy tool</td>
			<td style="width:189px;">Miltex</td>
			<td style="width:119px;">REF 33-34</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">8-mm skin punch biopsy tool</td>
			<td style="width:189px;">Miltex</td>
			<td style="width:119px;">REF 33-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.12 Colibri Forceps</td>
			<td style="width:189px;">Stephens Instruments</td>
			<td style="width:119px;">S5-1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wescott Scissors</td>
			<td style="width:189px;">Sklar Surgical Instruments</td>
			<td style="width:119px;">64-3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">#022364111</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:189px;">Praxair, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">7727-37-9 [R]</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of human retina and rpe-choroid for proteomic analysis

Het menselijke netvlies is samengesteld uit de sensorische neuroretina en de onderliggende retinale pigment epitheel (RPE), die is stevig complexvorm aan de vasculaire choroideus laag. Verschillende regio's van het netvlies zijn anatomisch en moleculair verschillend, vergemakkelijking van unieke functies en demonstreren van differentiële gevoeligheid voor ziekte. Proteoom analyse van elk van deze regio's en lagen kan belangrijke inzicht verwerven in de moleculaire proces van vele ziekten, waaronder Age-Related macula degeneratie (LMD), diabetes mellitus en glaucoom. Scheiding van retinale regio's en lagen is echter noodzakelijk voordat kwantitatieve Proteoom-analyse kan worden bereikt. Hier beschrijven we een methode voor dissectie en verzameling van de foveal, macula en perifere Retina regio's en onderliggende RPE-vaatvlies complex, waarbij regionale punch biopsieën en handmatig verwijderen van de lagen weefsel van een menselijk oog. Eendimensionale SDS-pagina evenals downstream Proteoom analyse, zoals vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS), kan worden gebruikt voor identificatie van eiwitten in elke ontleed retinale laag, moleculaire biomarkers voor retinale ziekte onthullen.

Retina en RPE-vaatvlies weefsel kunnen op verschillende manieren aan een afzonderlijk onderzoek worden verwerkt. Na het verzamelen bezitten de onderzoeker monsters van de retina en RPE-vaatvlies weefsel uit de foveal regio, buitenste macula en perifere retina (Figuur 1). In het bijzonder zal de foveal regio punch omvatten de fovea, de parafovea en een kleine hoeveelheid van de aangrenzende perifovea. De macula punch omvat de rest van de perifoveal-regio evena...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis at JoVE.com

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Het menselijke netvlies is samengesteld uit functioneel en moleculair verschillende regio's, met inbegrip van de fovea, macula en perifere retina. Hier beschrijven we een methode met behulp van punch biopsieën en handmatig verwijderen van de lagen weefsel van een menselijk oog te ontleden en deze verschillende retinale regio's voor downstream Proteoom analyse te verzamelen.

Dissectie van menselijke netvlies en RPE-vaatvlies voor proteoom-analyse

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fractionering voor oplossing van oplosbare en onoplosbare Huntingtin soorten

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Monstername en voorbehandeling van tandglazuur carbonaat voor stabiele koolstof en zuurstof isotoop analyse

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteoom analyse van menselijke Macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Analyse van de Fucosylated mens melk trisacharide in biotechnologische Context, waarbij het genetisch gecodeerd biosensoren

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Analysis and Specification of Starch Granule Size Distributions

Analyse en specificatie van zetmeelgranulaatgrootteverdelingen

Starch from all plant sources are made up of granules in a range of sizes and shapes having different occurrence frequencies, i.e., exhibiting a size and ...