Name: dissection of human retina and rpe-choroid for proteomic analysis
Uploaded: 2017-11-12T14:00:00
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VBM wird unterstützt durch Zuschüsse des NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 und R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant #: 2013103 und Forschung zu verhindern, dass Blindheit (RPB), New York, NY. MT und GV werden unterstützt durch NIH T32GM007337 zu gewähren.

diese Studie wurde von der University of Iowa genehmigt &#39; s Institutional Review Board und hält sich an den Grundsätzen, die in der Deklaration von Helsinki festgelegten.
 1. Foveal und Makula Biopsie-Punch <ol><li>öffnen und Schmetterling, das menschliche Auge, so dass es besteht aus 4 separaten Klappen des Gewebes, wie in einer früheren Publikation beschrieben. 5</li> <li>beginnend mit butterflied menschlichen Auge in einer Petrischale gelegt, zentrieren S...

<ol>
	<li>Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+changes+in+the+aging+choroid:+implications+for+age-related+macular+degeneration.">Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration.</a> Eye (Lond). , (2016).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+proteome+of+human+iris,+ciliary+body,+retinal+pigment+epithelium,+and+choroid.">Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid.</a> Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).</li><li>Funke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glaucoma+related+Proteomic+Alterations+in+Human+Retina+Samples.">Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples.</a> Sci Rep. 6, 29759 (2016).</li><li>Decanini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+retinal+pigment+epithelium+proteome+changes+in+early+diabetes.">Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes.</a> Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).</li><li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+human+vitreous+body+elements+for+proteomic+analysis.">Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li><li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+landscape+of+the+human+choroid-retinal+pigment+epithelial+complex.">Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex.</a> JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Skeie, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+vitreous+biopsy+techniques.">Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques.</a> Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).</li><li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+interactions+in+the+mouse+vitreous-retina+complex.">Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex.</a> PLoS One. 8 (11), e82140 (2013).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+vitreous+proteomics.">Translational vitreous proteomics.</a> Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).</li><li>Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+insight+into+the+molecular+function+of+the+vitreous.">Proteomic insight into the molecular function of the vitreous.</a> PLoS One. 10 (5), e0127567 (2015).</li><li>Velez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+Medicine:+Personalized+Proteomics+for+the+Diagnosis+and+Treatment+of+Idiopathic+Inflammatory+Disease.">Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease.</a> JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).</li><li>Velez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+elevated+intraocular+pressure+with+retinal+detachment.">Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment.</a> Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).</li><li>Skeie, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biorepository+for+ophthalmic+surgical+specimens.">A biorepository for ophthalmic surgical specimens.</a> Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).</li><li>Ferrer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+protein+preservation+largely+depends+on+the+postmortem+storage+temperature:+implications+for+study+of+proteins+in+human+neurologic+diseases+and+management+of+brain+banks:+a+BrainNet+Europe+Study.">Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).</li><li>Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+protein+profiles+in+tissue+samples:+differing+outcomes+with+and+without+heat+stabilization.">Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization.</a> J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).</li><li>Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Collection+Method+Bias+Effects+in+Quantitative+Phosphoproteomics.">Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).</li><li>Crecelius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+quantitative+post-mortem+changes+in+the+gray+matter+of+the+human+frontal+cortex+proteome+by+2-D+DIGE.">Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE.</a> Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).</li><li>Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+of+the+phosphoproteome+in+postmortem+mouse+brains.">Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains.</a> PLoS One. 6 (6), e21405 (2011).</li><li>Nagy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+postmortem+interval+on+biomolecule+integrity+in+the+brain.">Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+frozen+tissue+samples+using+laser+capture+microdissection.">Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection.</a> Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).</li></ol>

Nach Gewebe sind Sammlung, Probenbehandlung und Behandlung wichtige Überlegungen14. Konservierung in flüssigem Stickstoff wird über chemische Fixierung, bevorzugt, da Letzteres beschädigt, Protein-Struktur kann die nachgelagerte Analyse verzerren könnten. Darüber hinaus ist flüssiger Stickstoff Erhaltung bevorzugt, Methoden, die keine Einfrieren der Proben beinhalten. Vor allem, Ferrer Et Al. zeigten erhebliche Unterschiede im Proteingehalt zwischen Gehirn Proben bei 4 ° C oder Ra...

RPE, Netzhaut und Aderhaut sind komplexe Gewebe, die wichtige regionale Unterschiede in pathologischen Empfindlichkeiten1,2Proteinexpression und physiologische Funktion zu demonstrieren. Beispielsweise zeigen Krankheiten wie altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), Retinitis Pigmentosa und zentrale seröse Retinopathie charakteristische Lokalisation innerhalb der Fovea, der Makula oder der Netzhaut Peripherie1,3, 4,6. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zeigen, wie unterschiedliche Retinal Regionen unabhängig verkostet werden können. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, einen zuverlässigen Kompass für die Sammlung von Gewebeproben aus der fovealen, Makula und peripheren Regionen der menschlichen Netzhaut und RPE-Aderhaut für Proteomic Analysen zur Verfügung zu stellen. Die Gründe für die Entwicklung und Nutzung dieser Technik ist, dass durch Proteomic Analysen dieser spezifischen retinalen Regionen wichtig, dass molekulare Erkenntnisse kann über die physiologische und pathophysiologischen Funktionen dieser Regionen.
Dieser Ansatz verspricht die Proteomik-Basis für relative regionale Krankheit Empfindlichkeiten zu offenbaren und die Identifizierung von neuen spezifischen therapeutischen Ziele zu erleichtern. In der Tat boten Proteomic Untersuchungen des Glaskörpers und seine Wechselwirkungen mit der Netzhaut wichtige Einblicke in die molekularen Zusammensetzung und Funktion von gesundem und krankem Gewebe5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. klar vergleichende Proteomic Analysen aus verschiedenen retinalen Regionen fehlen jedoch. Die Technik hilft, um diese dringend notwendigen Studien, bietet Vorteile gegenüber anderen Methoden durch eine zuverlässige und reproduzierbare Gewebe Sammlung Ansatz zu unterstützen. Um so mehr, ist der Ansatz sehr gut erreichbar, unter Ausnutzung der Standardgröße und leicht verfügbare Gewebe Punch Biopsie Werkzeuge. Unsere Technik betont entsprechende Erhebung und Speicherung von Geweben für die Proteomik Verarbeitung, so dass wichtige Überlegungen für die Proteinstabilität und Abbau. Daher ist diese Methode am besten geeignet für Ermittler in Anbetracht nachgelagerten molekulare Analyse der Proteomik Faktoren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4-mm skin punch biopsy tool</td>
			<td style="width:189px;">Miltex</td>
			<td style="width:119px;">REF 33-34</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">8-mm skin punch biopsy tool</td>
			<td style="width:189px;">Miltex</td>
			<td style="width:119px;">REF 33-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.12 Colibri Forceps</td>
			<td style="width:189px;">Stephens Instruments</td>
			<td style="width:119px;">S5-1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wescott Scissors</td>
			<td style="width:189px;">Sklar Surgical Instruments</td>
			<td style="width:119px;">64-3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">#022364111</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:189px;">Praxair, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">7727-37-9 [R]</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of human retina and rpe-choroid for proteomic analysis

Die menschliche Netzhaut besteht aus der sensorischen Neuroretina und die zugrunde liegenden Netzhaut pigmentierten Pigmentepithels (RPE), ist fest auf die vaskuläre choroid Schicht komplexiert. Verschiedene Regionen der Netzhaut unterscheiden sich anatomisch und molekular, einzigartige Funktionen zu erleichtern und zeigen unterschiedliche Anfälligkeit für Krankheiten. Proteomic Analysen der einzelnen Regionen und Schichten bieten wichtige Einblicke in den molekularen Prozess von vielen Krankheiten, einschließlich altersbedingter Makula-Degeneration (AMD), Diabetes Mellitus und Glaukom. Trennung von retinalen Regionen und Schichten ist jedoch unerlässlich, bevor quantitative Proteomik Analyse erreicht werden kann. Hier beschreiben wir eine Methode zur Präparation und Sammlung von der Fovea, Makula und peripheren Netzhaut Regionen und RPE-Aderhaut-Komplex zugrunde, an denen regionalen Stanzbiopsien und manuelle Entfernung von Gewebeschichten von einem menschlichen Auge. Eindimensionale SDS-PAGE als auch nachgelagerte Proteomic Analysen, wie z.B. flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), lässt sich Proteine in jeder seziert retinalen Schicht zu identifizieren enthüllt molekularen Biomarker für Netzhauterkrankung.

Retinal und RPE-Aderhaut Gewebe können auf verschiedene Weise eine individuelle Untersuchung entsprechend verarbeitet werden. Nach der Entnahme verfügen die Forscher Proben von Retinal und RPE-Aderhaut-Gewebe aus der fovealen Region, äußere Makula und peripheren Netzhaut (Abbildung 1). Insbesondere gehören die Fovea Region Punch der Fovea, der Parafovea und eine kleine Menge der angrenzenden Perifovea. Der Makula Stempel beinhaltet den Rest von der Perif...

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Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

Die menschliche Netzhaut besteht aus funktional und molekular verschiedene Regionen, einschließlich der Fovea, der Makula und der peripheren Netzhaut. Hier beschreiben wir eine Methode mit Stanzbiopsien und manuelle Entfernung von Gewebeschichten von einem menschlichen Auge zu zerlegen und diese verschiedenen retinalen Regionen für nachgeschaltete Proteomic Analysen zu sammeln.

Dissektion der menschlichen Netzhaut und RPE-Aderhaut für Proteomic Analysen

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Forschung

Biochemie

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraktionierung für Auflösung von löslichen und unlöslichen Huntingtin-Arten

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomic Analyse der kontextspezifischen Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Probenahme und Vorbehandlung des Zahnschmelzes Carbonat für stabile Kohlenstoff und Sauerstoff-Isotopen-Analyse

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamische Proteomic und MiRNA Analyse des Polysomes von isolierten Maus Herz nach Langendorff Perfusion

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteomic Analysen der menschlichen Makrophagen Polarisierung in einer sauerstoffarmen Umgebung

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Analyse der Fucosylated menschlichen Milch Trisaccharides in biotechnologischen Zusammenhang mit genetisch codierte Biosensoren

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Analysis and Specification of Starch Granule Size Distributions

Analyse und Spezifikation von Stärkegranulatgrößenverteilungen

Starch from all plant sources are made up of granules in a range of sizes and shapes having different occurrence frequencies, i.e., exhibiting a size and ...