Name: dissection of human retina and rpe-choroid for proteomic analysis
Uploaded: 2017-11-12T14:00:00
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VBM é suportada por concessões de NIH [K08EY020530, R01EY024665, R01EY025225, R01EY024698 e R21AG050437], Doris Duke Charitable Foundation Grant #: 2013103 e pesquisa para evitar cegueira (RPB), New York, NY. MT e GV são suportados pelo NIH conceder T32GM007337.

este estudo foi aprovado pela Universidade de Iowa &#39; s Conselho de revisão institucional e adere aos princípios estabelecidos na declaração de Helsinque.
 1. Foveal e Macular soco biópsia <ol><li>aberto e borboleta olho humano, que consiste em 4 diferentes retalhos de tecido, conforme descrito em uma publicação anterior. 5</li> <li>começando com um borboleta olho humano colocado em uma placa de Petri, centralize uma ferramenta de biópsia do perfurador d...

<ol>
	<li>Chirco, K. R., Sohn, E. H., Stone, E. M., Tucker, B. A., Mullins, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+changes+in+the+aging+choroid:+implications+for+age-related+macular+degeneration.">Structural and molecular changes in the aging choroid: implications for age-related macular degeneration.</a> Eye (Lond). , (2016).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+proteome+of+human+iris,+ciliary+body,+retinal+pigment+epithelium,+and+choroid.">Defining the proteome of human iris, ciliary body, retinal pigment epithelium, and choroid.</a> Proteomics. 16 (7), 1146-1153 (2016).</li><li>Funke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glaucoma+related+Proteomic+Alterations+in+Human+Retina+Samples.">Glaucoma related Proteomic Alterations in Human Retina Samples.</a> Sci Rep. 6, 29759 (2016).</li><li>Decanini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+retinal+pigment+epithelium+proteome+changes+in+early+diabetes.">Human retinal pigment epithelium proteome changes in early diabetes.</a> Diabetologia. 51 (6), 1051-1061 (2008).</li><li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+human+vitreous+body+elements+for+proteomic+analysis.">Dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li><li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+landscape+of+the+human+choroid-retinal+pigment+epithelial+complex.">Proteomic landscape of the human choroid-retinal pigment epithelial complex.</a> JAMA Ophthalmol. 132 (11), 1271-1281 (2014).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Skeie, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+vitreous+biopsy+techniques.">Proteomic analysis of vitreous biopsy techniques.</a> Retina. 32 (10), 2141-2149 (2012).</li><li>Skeie, J. M., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+interactions+in+the+mouse+vitreous-retina+complex.">Proteomic interactions in the mouse vitreous-retina complex.</a> PLoS One. 8 (11), e82140 (2013).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+vitreous+proteomics.">Translational vitreous proteomics.</a> Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 204-208 (2014).</li><li>Skeie, J. M., Roybal, C. N., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+insight+into+the+molecular+function+of+the+vitreous.">Proteomic insight into the molecular function of the vitreous.</a> PLoS One. 10 (5), e0127567 (2015).</li><li>Velez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+Medicine:+Personalized+Proteomics+for+the+Diagnosis+and+Treatment+of+Idiopathic+Inflammatory+Disease.">Precision Medicine: Personalized Proteomics for the Diagnosis and Treatment of Idiopathic Inflammatory Disease.</a> JAMA Ophthalmol. 134 (4), 444-448 (2016).</li><li>Velez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+elevated+intraocular+pressure+with+retinal+detachment.">Proteomic analysis of elevated intraocular pressure with retinal detachment.</a> Am J Ophthalmol Case Rep. 5, 107-110 (2017).</li><li>Skeie, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biorepository+for+ophthalmic+surgical+specimens.">A biorepository for ophthalmic surgical specimens.</a> Proteomics Clin Appl. 8 (3-4), 209-217 (2014).</li><li>Ferrer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+protein+preservation+largely+depends+on+the+postmortem+storage+temperature:+implications+for+study+of+proteins+in+human+neurologic+diseases+and+management+of+brain+banks:+a+BrainNet+Europe+Study.">Brain protein preservation largely depends on the postmortem storage temperature: implications for study of proteins in human neurologic diseases and management of brain banks: a BrainNet Europe Study.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 66 (1), 35-46 (2007).</li><li>Ahmed, M. M., Gardiner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+protein+profiles+in+tissue+samples:+differing+outcomes+with+and+without+heat+stabilization.">Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization.</a> J Neurosci Methods. 196 (1), 99-106 (2011).</li><li>Kanshin, E., Tyers, M., Thibault, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Collection+Method+Bias+Effects+in+Quantitative+Phosphoproteomics.">Sample Collection Method Bias Effects in Quantitative Phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 14 (7), 2998-3004 (2015).</li><li>Crecelius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+quantitative+post-mortem+changes+in+the+gray+matter+of+the+human+frontal+cortex+proteome+by+2-D+DIGE.">Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE.</a> Proteomics. 8 (6), 1276-1291 (2008).</li><li>Oka, T., Tagawa, K., Ito, H., Okazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+of+the+phosphoproteome+in+postmortem+mouse+brains.">Dynamic changes of the phosphoproteome in postmortem mouse brains.</a> PLoS One. 6 (6), e21405 (2011).</li><li>Nagy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+postmortem+interval+on+biomolecule+integrity+in+the+brain.">Effects of postmortem interval on biomolecule integrity in the brain.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 74 (5), 459-469 (2015).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+frozen+tissue+samples+using+laser+capture+microdissection.">Proteomic analysis of frozen tissue samples using laser capture microdissection.</a> Methods Mol Biol. 1002, 71-83 (2013).</li></ol>

Depois de tecido recolha, manipulação de amostra e tratamento são cruciais considerações14. Preservação em nitrogênio líquido é preferida por fixação química, como o último pode resultar em danos à estrutura da proteína, que pode distorcer a análise a jusante. Além disso, a preservação de nitrogênio líquido é preferencial para métodos que não envolvem o congelamento de amostras. Notavelmente, Ferrer et al mostraram diferenças significativas nos níveis de proteí...

A retina, RPE e coroide são tecidos complexos que demonstram diferenças regionais importantes na expressão de proteínas, função fisiológica e patológica suscetibilidades1,2. Por exemplo, doenças como a Degeneração Macular Age-Related (AMD), retinite pigmentosa e retinopatia serosa central cada demonstram característica localização dentro da fóvea, mácula ou retina periferia1,3, 4,6. Aqui, apresentamos um método demonstrando como distinta da retina regiões podem ser degustadas de forma independente. O objetivo geral deste método é fornecer um guia confiável para coleta de amostras de tecido da região macular, Central e periférica da retina humana e RPE coroide para análise proteômica. A justificativa para o desenvolvimento e a utilização desta técnica é que através da análise de proteomic destas regiões específicas da retina, importante introspecções moleculares podem ser adquiridas para as funções fisiológicas e fisiopatológicas destas regiões.
Esta abordagem promete revelar a base de proteomic para suscetibilidades doença regional relativo e para facilitar a identificação de novos alvos terapêuticos específicos. Com efeito, proteomic investigações sobre o vítreo e suas interações com a retina forneceu insights-chave na composição molecular e função dos tecidos saudáveis e doentes5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. no entanto, análises de proteomic nítida de distintas regiões da retina são escassos. A técnica vai ajudar a apoiar estes estudos muito necessária, proporcionando vantagens sobre outros métodos demonstrando uma abordagem de coleta de tecido confiável e reprodutível. Mais ainda, a abordagem é muito acessível, aproveitando-se do ponche de tecido tamanho padrão e prontamente disponíveis a ferramentas de biópsia. Nossa técnica enfatiza a recolha e armazenamento de tecidos para proteomic processamento, fazendo considerações importantes para a estabilidade da proteína e degradação. Assim, este método é mais adequado para os investigadores a jusante análise molecular de proteomic factores a considerar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="691">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4-mm skin punch biopsy tool</td>
			<td style="width:189px;">Miltex</td>
			<td style="width:119px;">REF 33-34</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">8-mm skin punch biopsy tool</td>
			<td style="width:189px;">Miltex</td>
			<td style="width:119px;">REF 33-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.12 Colibri Forceps</td>
			<td style="width:189px;">Stephens Instruments</td>
			<td style="width:119px;">S5-1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wescott Scissors</td>
			<td style="width:189px;">Sklar Surgical Instruments</td>
			<td style="width:119px;">64-3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">#022364111</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td style="width:189px;">Praxair, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">7727-37-9 [R]</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of human retina and rpe-choroid for proteomic analysis

A retina humana é composta da neuroretina sensorial e o epitélio pigmentado da retina subjacente (RPE), que é complexado com firmeza à camada vascular da coroide. Diferentes regiões da retina são anatomicamente e molecularmente distintas, facilitando as funções originais e demonstrando o diferencial susceptibilidade à doença. Análise proteômica de cada uma destas regiões e camadas pode fornecer insights vitais sobre o processo molecular de muitas doenças, incluindo Age-Related Degeneração Macular (AMD), diabetes mellitus e glaucoma. No entanto, separação de camadas e regiões da retina é essencial antes de análise proteômica quantitativa pode ser realizado. Aqui, descrevemos um método para dissecção e coleção de regiões da retina central, periféricas e maculares e subjacentes RPE coroide complexo, envolvendo regional soco biópsias e remoção manual das camadas de tecido do olho humano. Unidimensional de SDS-PAGE, bem como análise de proteomic a jusante, tais como líquida espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS), pode ser usado para identificar proteínas em cada camada da retina dissecada, revelando moleculares biomarcadores para doenças da retina.

Tecido de RPE coroide e da retina podem ser processadas de várias maneiras, de acordo com uma investigação individual. Após a coleta, o pesquisador possuirá amostras da retina e RPE coroide tecido da região central, exterior mácula e retina periférica (Figura 1). Especificamente, o soco de região central incluirá a fóvea, o parafovea e uma pequena quantidade do perifovea adjacente. O soco macular inclui o restante da região perifoveal, bem como um...

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Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

A retina humana é composta de regiões funcionalmente e molecularmente distintas, incluindo a fóvea, mácula e retina periférica. Aqui, descrevemos um método usando o soco de biópsias e remoção manual das camadas de tecido do olho humano para dissecar e coletar estas regiões distintas da retina para análise proteômica a jusante.

Dissecação da Retina humana e RPE coroide para análise proteômica

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Bioquímica

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fracionamento para resolução das espécies de Huntingtin solúvel e insolúvel

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomic análise de complexos de proteínas específicas do contexto em seu ambiente nativo do celular

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificação e reconstituição de TRPV1 para análise espectroscópica

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Amostragem e tratamento prévio de esmalte do dente carbonato de carbono estável e análise de isótopos de oxigênio

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dinâmica proteómica e miRNA análise de polissomos de coração de rato isolado após Langendorff perfusão

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Análise de Proteomic do macrófago humano polarização sob um ambiente de baixo oxigênio

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Análise de fucosilado humanos leite trissacarídeos biotecnológicas contexto usando geneticamente codificado biosensores

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Analysis and Specification of Starch Granule Size Distributions

Análise e Especificação das Distribuições de Tamanho do Granulo de Amido

Starch from all plant sources are made up of granules in a range of sizes and shapes having different occurrence frequencies, i.e., exhibiting a size and ...