Name: quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli
Uploaded: 2017-08-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli at JoVE.com

يشكر المؤلفون ماريت وارير للمساعدة التقنية الممتازة. هذا العمل كان يدعمها "المجلس الدانمركي" "البحوث المستقلة" | العلوم الطبيعية [1323-00343B]، ومؤسسة البحوث الوطنية الدانمركية [DNRF120].

1-التحضير للثقافات البكتيرية.
<ol><li>تنمو جميع الثقافات في قوارير Erlenmeyer مع نسبة حجم ثقافة/قارورة من 1/6 على الأكثر. في إعداد نموذجي تجريبي، تنمو الثقافات في 37.0 درجة مئوية وتهز 160 لفة في الدقيقة في مورفولينيبروبانيسولفونيك الحمضية (والمماسح) الحد الأدنى المتوسط 18 تستكمل مع مصدر ا...

<ol>
	<li>Varshney, U., Lee, C. -. P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase.">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li><li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel(+)+and+Rel(-)+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Kr&#252;ger, M. K., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo.">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li><li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Mu&#241;oz-G&#243;mez, A. J., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li><li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs.">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li><li>Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+and+alternatives+in+reading+the+universal+genetic+code.">Errors and alternatives in reading the universal genetic code.</a> Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).</li><li>Traxler, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global,+ppGpp-mediated+stringent+response+to+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNAs+Mediate+the+Rapid+Adaptation+of+Escherichia+coli+to+Oxidative+Stress.">Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress.</a> PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).</li><li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+(Asn).">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li><li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation:+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition.">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li><li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR.">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).</li><li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli.">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li><li>McCarthy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+magnesium+starvation+on+the+ribosome+content+of+Escherichia+coli.">The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).</li><li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli.">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li><li>Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+degradation+in+growing+bacteria.">Ribosome degradation in growing bacteria.</a> EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).</li><li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium.">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases.">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li></ol>

هذا البروتوكول ويصف كيفية قياس مستوى شحن محددة كولاي في نفس الوقت ترنس ومقارنة مستويات نسبية من ترنس في عينات مختلفة. النقاط الحرجة للبروتوكول 1) للتعامل مع العينات بطريقة أن تبقى مستويات الحمض الريبي النووي النقال مشحون الخلوية، 2) تطبيع كميات الحمض الريبي النووي النقال في مثل هذه طر...

في ما يلي، نقدم طريقة لتحديد كمية محددة ترناس وقياس فرض رسوم على المستويات من النشاف الشمالية. الأسلوب الذي يستند إلى تقنية وضعتها أولاً فارشنيي et al. 1-حصاد الخلايا إلى حمض التريكلوروسيتيك (TCA) وحفظ العينات في 0 درجة مئوية في جميع أنحاء تنقية الحمض النووي الريبي، هو السندات إستر بين الحمض الريبي النووي النقال والأحماض الأمينية المصانة2،،من34. ترنس أمينواسيلاتيد يمكن تمييز من نظرائهم نوناسيلاتيد هلام التفريد وشمال النشاف، يرجع إلى تنقل انخفض أمينواسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال في الهلام، الناجمة عن الأحماض الأمينية تساهمي ملزمة5. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم بروتوكول لتطبيع كميات الحمض الريبي النووي النقال بالإضافة إلى المصطلحات الخاصة في الخلايا overexpressingسيلك الحمض الريبي النووي النقال نادراً ما تستخدم 4.
ترنس بعض من الجزيئات الأكثر وفرة في الخلية البكتيرية وجزء حيوي للغاية للترجمة الآلية. ترناس ربط الأحماض الأمينية ونقلها إلى ترجمة ريبوسوم. ربط الأحماض الأمينية ترنس (أمينواسيليشن أو شحن) يسر aminoacyl الحمض الريبي النووي النقال سينثيتاسيس. الوفرة النسبية لمختلف ترنس مشحونة مهم لضمان الدقة تخليق البروتين، لأنه اتهم التمثيل الناقص لقرابة الحمض الريبي النووي النقال كودون معين رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً) يزيد من احتمال أن سيكون القرب من قرابة الحمض الريبي النووي النقال خطأ تسليم بالأحماض الأمينية في سلسلة ببتيد المتزايد في الريبوسوم6. وتتجلى الأهمية للحمض الريبي النووي النقال مشحونة باستجابة واسعة النطاق من الخلية كولاي إلى هبوط حاد في مستويات مشحون الحمض الريبي النووي النقال؛ استجابة صارمة. خلال الاستجابة الصارمة هو خفض التوليف ترنس والكشف الريباسي مرناس معظم صالح نسخ مرناس المحددة المرتبطة ببقاء الحمض الأميني الحيوي والإجهاد، وهو خفض معدل نمو الخلايا هائلة7 . وعلاوة على ذلك، أظهرت مؤخرا العمل لنا ولغيرنا أن كولاي يحط بنشاط غالبية الحمض الريبي النووي النقال ردا على تشدد على أن الحد من ترجمة4،8، مما يوحي بأن تعديل المستويات الحمض الريبي النووي النقال الهامة للتعامل مع هذه الضغوط. وهكذا، سوف تكون قياسات موثوقة من وفرة الحمض الريبي النووي النقال وفرض مستويات أداة هامة لفهم استجابات الضغط البكتيرية تماما.
القولونية يستخدم عادة للتعبير عن البروتين المؤتلف، ونظرا للاختلافات في استخدام كودون بين الأنواع، هو التعبير الأمثل غالباً ما واجهت مشكلة9. وهذا يمكن التحايل عليها بالتعبير عن ترناس الإضافية اللازمة لترجمة مرناً المؤتلف10. قياسات للحمض الريبي النووي النقال فرض مستويات في هذه السلالات يمكن توجيه جهود استكشاف الأخطاء وإصلاحها والمساعدة في تحسين التعبير البروتين.
هذا الأسلوب يمكن أيضا الكشف عن "ميشارجينج"؛ أمينواسيلاتيد جزيء الحمض الريبي النووي النقال مع من الأحماض الأمينية غير قرابة. قد يسبب أمينواسيليشن بالأحماض الأمينية مختلفة من الحمض الريبي النووي النقال لترحيل مع سرعات مختلفة قليلاً عن طريق الجل بولياكريلاميدي1،11. وفي بعض الحالات، يمكن أيضا استخدام الأسلوب التمييز بين أنماط مختلفة التعديل على خلاف ذلك مماثلة ترنس3.
آخر أنشأ الإجراء البيوكيميائية للتحقيق في فرض مستويات الحمض الريبي النووي النقال هو فوق يودات الأكسدة. الأسلوب يعتمد على ملاحظة مفادها أن أمينواسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال محمي من فوق يودات الأكسدة وليس من دون توجيه تهمة إليه الحمض الريبي النووي النقال. بعد فوق يودات علاج الأكسدة تغذيتها الحمض الريبي النووي النقال يستخدم لتقدير مستويات الشحن من الجيش الملكي النيبالي المقطوع. ومع ذلك، قد تبين تغذيتها ترنس عدة تتأثر بالعلاج وبالتالي توفير بعض عدم الدقة12. الطريقة المعروضة هنا تدابير الشحن مباشرة من تنقية الجيش الملكي النيبالي، وتستبعد بالتالي أي تحيز من التفاعلات الكيميائية أو الانزيمية. واحد الحد من هذا الأسلوب الكشف عن تلك الأنواع الحمض الريبي النووي النقال واحد فقط في كل مرة، حتى على الرغم من أن لطخة الشمالية نفسها يمكن تجريده وريبروبيد ترناس متعددة، أنها مضيعة للوقت وشاقة إلى حد ما جمع البيانات بشأن العديد من ترناس.
طريقة يمكن الاعتماد عليها لتطبيع عينات لبعضها البعض أمر حيوي في الدراسات حيث أن الهدف مقارنة المستويات النسبية لجزيء عبر عينات مختلفة. نقدم لك هنا إجراء تطبيع للجيش الملكي النيبالي حيث يتم إضافة قاسمة صغيرة كولاي الخلايا overexpressing الحمض الريبي النووي النقال نادرةسيلك كالمصطلحات خاصة في لجميع العينات التجريبية قبل تنقية الحمض النووي الريبي. يعد هذا الأسلوب مفيداً عندما يكون الإعداد التجريبية مثل لا الحمض النووي الريبي الذاتية التي يمكن أن تكون موثوق بها أن يقدم ليس فقط عند دراسة ترنس لكن للتحديد الكمي النسبي لأي أنواع من الحمض النووي الريبي في نفس تركيز الخلوية في جميع العينات. على سبيل المثال، غالباً ما يستخدم مستوى "التدبير المنزلي" مثل الحمض النووي الريبي الريباسي الرنا كمرجع ذاتية لمقارنة الكميات النسبية للجيش الملكي النيبالي آخر بين مختلف عينات13. ولكن هذا الاستخدام القليل إذا كان تركيز الجيش الملكي النيبالي الإشارة الخلوية يتراوح بين العينات، كما يمكن أن يكون الحال بالنسبة للحمض النووي الريبي الريباسي إذا أخذ العينات يحدث أثناء إجهاد استجابة15،،من1617 أو الدخول إلى مرحلة ثابتة17. إضافة المصطلحات الخاصة في الخلايا للعينات التجريبية قبل تنقية الحمض النووي الريبي يوفر طريقة متينة ودقيقة لتطبيع المستقلة لإعداد العينات. وهناك طريقة أخرى للتوحيد القياسي هو إضافة واحد أو أكثر المصطلحات الخاصة في الكشف على العينات التجريبية بعد تنقية الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، هذا الأسلوب لا تراعي أي اختلافات في الحمض النووي الريبي الانتعاش بين العينات.
استخدام خلايا كولاي أوفيريكسبريس هذا عيب الإشارة الجيش الملكي النيبالي كمسمار في الخلايا (انظر الشكل 1) في تجربة على كولاي التي يترتب عليها بالإضافة إلى ذلك كمية صغيرة من خارجية كولاي مجموع الجيش الملكي النيبالي عينات. علينا أن نصحح لهذه الإضافة عن طريق تحليل عينة تحتوي على إلا سبايك في الخلايا بالتوازي مع العينات التجريبية (انظر الشمالية لطخة في الشكل 2، لين المسمى "سيلك"). البروتوكول عرضت وضع من أجل K-12 كولاي ، لكن من المرجح أن تكون قابلة للتطبيق لمعظم الأنواع البكتيرية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>Purity &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Serva</td>
			<td>79-06-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis (N,N&#39;-Methylene-bis-acrylamide)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108-95-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring Sperm DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100403-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P32 &#947;ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos (probes)</td>
			<td>TAG Copenhagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+ membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydridization oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger-M&#252;ller tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor imager screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli

نقل الجيش الملكي النيبالي (الحمض الريبي النووي النقال) جزء أساسي من إليه متعدية الجنسيات في أي كائن حي. ترنس ربط ونقل الأحماض الأمينية إلى الريبوسوم ترجمة. المستويات النسبية لمختلف ترنس، ونسبة أمينواسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال إلى إجمالي الحمض الريبي النووي النقال، المعروفة باسم مستوى الشحن، عوامل هامة في تحديد الدقة والسرعة في الترجمة. ولذلك، بوفرة ومستويات الشحن ترناس هي المتغيرات الهامة لقياس عند دراسة تخليق البروتين، على سبيل المثال تحت ظروف الإجهاد المختلفة. هنا، يمكننا وصف أسلوب الحصاد الحمض الريبي النووي النقال ومباشرة قياس الوفرة النسبية ومستوى الشحن المطلق لأنواع محددة من الحمض الريبي النووي النقال في الإشريكيّة القولونية. هو المقطوع الحمض الريبي النووي النقال في مثل هذه طريقة أن يتم الاحتفاظ بالسندات مجا بين الحمض الريبي النووي النقال وبه الأحماض الأمينية. ثم يتعرض الجيش الملكي النيبالي لجل التفريد والشمالية النشاف، مما يؤدي إلى فصل ترناس التهمة الموجهة إليه ودون توجيه تهم لهم. يمكن مقارنة مستويات محددة ترنس في عينات مختلفة بسبب إضافة المصطلحات الخاصة في الخلايا للتطبيع. قبل تنقية الحمض النووي الريبي، يمكننا إضافة 5% خلايا كولاي التي أكثر الحمض الريبي النووي النقال نادرةسيلك لكل عينة. ثم هو تطبيع مقدار الفائدة في عينة وأنواع الحمض الريبي النووي النقال بمقدار الحمض الريبي النووي النقالسيلك في نفس العينة. إضافة المصطلحات الخاصة في الخلايا قبل تنقية الحمض النووي الريبي مزية على إضافة المنقي سبايك في الكشف بأنه يمثل أيضا أية فروق في كفاءة تحلل الخلية بين العينات.

استخدام الإجراء الموصوفة هنا، الوفرة والشحن وقيست مستويات ترنس الثلاثة في K-12 كولاي قبل وأثناء المجاعة من الأحماض الأمينية.
سلالة أوكسوتروف ارجينين NF9154 (لوي thr supE44 mtl ثي argH له) كان نمت على الأقل عشرة أجيال والمماسح ال...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli at JoVE.com

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

التحديد الكمي للوفرة وفرض مستويات نقل الكشف في الإشريكيّة القولونية

هنا نقدم طريقة لقياس مباشرة فرض مستويات من المنقي الإشريكيّة القولونية الجيش الملكي النيبالي، فضلا عن طريقة لمقارنة المستويات النسبية لنقل الجيش الملكي النيبالي، أو أي أخرى قصيرة الجيش الملكي النيبالي، عبر عينات مختلفة على أساس الإضافة للمصطلحات الخاصة في الجيش الملكي النيبالي نقل التعبير عن جين مرجع الخلايا.

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

توجه التغليف البروتين داخل الخارجي غشاء الحويصلات من<em&gt; كولاي</em&gt;: تصميم وإنتاج وتنقية

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من<em&gt; كولاي</em&gt; الوصيفة HdeB<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

التحديد الكمي لنشاط نقص التصبغ في المختبر

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

الإنتاج الواسع النطاق للكشف المؤتلف في سقالة دائرية باستخدام نظام المستمدة من فرويد في الإشريكيّة القولونية

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

الطفرات موقع الموجه لفي المختبر وفي فيفو التجارب المتمثلة بالتفاعلات الحمض النووي الريبي في الإشريكيّة القولونية

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

استخدام عنصر Alu الذي يحتوي على جينات صغيرة لتحليل الحمض النووي الريبي الدائري

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

توصيف الناقلات غشاء بواسطة تعبير مغاير في كولاي وإنتاج الحويصلات الغشائية

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

القياس الكمي لانزيم A في الخلايا والانسجه

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

تحليل RNA لطخة للكشف عن و الكم من MicroRNAs النبات

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

موقع محدد ليسين أسيتيل الهستونات لإعادة تشكيل النوكليوسوم باستخدام توسيع الشفرة الوراثية في الإشريكية القولونية

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...