Name: quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli
Uploaded: 2017-08-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli at JoVE.com

Forfatterne takke Marit Warrer for fremragende teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af Forskningsrådet for uafhængige forskning | Naturvidenskab [1323-00343B] og Danmarks Grundforskningsfond [DNRF120].

1. forberedelse af bakteriel kulturer.
<ol><li>Vokse alle kulturer i Erlenmeyerkolben kolber med en kultur/kolbe volumen-forholdet på højst 1/6. I en typisk eksperimentel opsætning, vokse kulturer på 37.0 ° C og ryster på 160 rpm i morpholinepropanesulfonic syre (MOPPER) minimal medium 18 suppleret med den foretrukne carbon kilde, for eksempel 0,2% glukose, for mindst 10 på hinanden følgende generationer før RNA høst.</li>
	<li>Dagen før RNA høst, fortynde en forvokset kultur af de...

<ol>
	<li>Varshney, U., Lee, C. -. P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase.">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li><li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel(+)+and+Rel(-)+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Kr&#252;ger, M. K., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo.">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li><li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Mu&#241;oz-G&#243;mez, A. J., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li><li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs.">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li><li>Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+and+alternatives+in+reading+the+universal+genetic+code.">Errors and alternatives in reading the universal genetic code.</a> Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).</li><li>Traxler, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global,+ppGpp-mediated+stringent+response+to+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNAs+Mediate+the+Rapid+Adaptation+of+Escherichia+coli+to+Oxidative+Stress.">Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress.</a> PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).</li><li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+(Asn).">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li><li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation:+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition.">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li><li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR.">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).</li><li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli.">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li><li>McCarthy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+magnesium+starvation+on+the+ribosome+content+of+Escherichia+coli.">The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).</li><li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli.">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li><li>Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+degradation+in+growing+bacteria.">Ribosome degradation in growing bacteria.</a> EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).</li><li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium.">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases.">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li></ol>

Denne protokol beskriver hvordan man samtidig måle niveauet opladning af specifikke E. coli tRNAer og sammenligne de relative niveauer af tRNAer i forskellige prøver. De kritiske punkter i protokollen er 1) til at håndtere prøverne på en sådan måde, at de cellulære tRNA opladningsniveauet bevares, 2) til at normalisere tRNA mængder på en sådan måde, at relative tRNA niveauer i forskellige prøver kan sammenlignes pålideligt, og 3) for at sikre sp ecificity af de valgte sonder til tRNAer af interesse...

I følgende præsenterer vi en metode til kvantificering af specifikke tRNAer og måling af deres opladning niveauer af nordlige blotting. Metoden er baseret på en teknik, først udviklet af Varshney et al. 1. ved høst celler i trichloreddikesyre (TCA) og holde prøverne ved 0 ° C i hele RNA oprensning, ester obligation mellem tRNA og aminosyren er bevaret2,3,4. Aminoacylated tRNAer kan skelnes fra deres nonacylated kolleger ved gelelektroforese og nordlige blotting, grund til en nedsat bevægelighed af aminoacylated tRNA i gelen, forårsaget af kovalent bundne aminosyre5. Derudover præsenterer vi en protokol til normalisering tRNA mængder ved tilsætning af spike-i celler overekspression af sjældent brugte tRNAselC 4.
tRNAer er nogle af de mest udbredte molekyler i cellen bakteriel og en helt vitale del af oversættelse maskiner. tRNAer binder aminosyrer og overføre dem til at oversætte ribosomer. Bindingen af aminosyrer til tRNAer (aminoacylation eller opladning) lettes af aminoacyl tRNA synthetases. Den relative forekomst af forskellige ladede tRNAer er vigtig for at sikre troskab af proteinsyntesen, fordi underrepræsentation af cognate opkrævet tRNA for en given messenger RNA (mRNA) codon øger sandsynligheden for, at en nær cognate tRNA vil fejlagtigt levere sin aminosyre til den voksende polypeptid kæde på ribosom6. Betydningen af ladede tRNA afspejles i den omfattende svar af E. coli celle en alvorlig nedgang i Opladningsniveauet for en tRNA; den strenge svar. Under den strenge svar syntesen af tRNAer, ribosomale RNA'er og de fleste mRNAs er sænket til fordel for transskription af specifikke mRNAs tilknyttet aminosyre biosyntese og stress overlevelse og vækst af celler er sænket drastisk7 . Desuden har de seneste arbejde af os og andre vist, at E. coli aktivt nedbryder fleste af sine tRNA svar på understreger, at begrænser oversættelse4,8, tyder på, at justering af tRNA niveauer kan være vigtigt for at håndtere sådanne belastninger. Således, pålidelige målinger af tRNA mængder og opladning niveauer vil være et vigtigt redskab for at fuldt ud forstå bakteriel stress svar.
E.coli er almindeligt anvendt til at udtrykke rekombinante protein og på grund af forskelle i codon skik mellem arter, suboptimal udtryk er et problem, der ofte står over for9. Dette kan omgås ved udtryk for yderligere tRNAer nødvendig for at oversætte den rekombinante mRNA10. Målinger af tRNA opladning niveauer i disse stammer kan guide fejlfinding bestræbelser og hjælpe med at optimere protein udtryk.
Denne metode giver også mulighed for påvisning af "mischarging"; en tRNA-molekyle aminoacylated med en ikke-cognate aminosyre. Aminoacylation af forskellige aminosyrer kan forårsage en tRNA overflytte med lidt forskellige hastigheder gennem polyacrylamidgeler1,11. I nogle tilfælde kan metoden også bruges til at skelne mellem forskellige ændring mønstre på ellers identiske tRNAer3.
En anden etableret biokemiske procedure for undersøgelse af tRNA opladning niveauer er periodate oxidation. Metoden er baseret på den iagttagelse, at aminoacylated tRNA er beskyttet mod periodate oxidation og tomt tRNA er ikke. Efter periodate oxidation behandling genopladning af tRNA bruges til at beregne opladningsniveauet af den høstede RNA. Dog har genopladning af flere tRNAer vist sig at være påvirket af den behandling, hvilket giver nogle unøjagtighed12. Metoden, der præsenteres her foranstaltninger opladning direkte fra oprensede RNA, således udelukke eventuelle afvigelser fra kemisk eller enzymatisk reaktioner. En begrænsning af denne metode er, at kun én tRNA arter opdages på et tidspunkt, så selv om den samme nordlige duppes kan strippet og reprobed for flere tRNAer, det er tidskrævende og noget besværlige at indsamle data på mange tRNAer.
En pålidelig måde at normalisere prøver til hinanden er afgørende i undersøgelser, hvor målet er at sammenligne de relative niveauer i et molekyle på tværs af forskellige prøver. Her har vi indføre en normalisering procedure for RNA hvor en lille alikvot af E. coli celler overekspression af sjældne tRNAselC er tilføjet som en spike-i til alle de eksperimentelle prøver før RNA oprensning. Denne metode er nyttig ikke kun ved behandlingen af tRNAer men for relativ kvantificering af enhver art af RNA når opsætningen af eksperimenterende er sådan, at ingen endogene RNA kan have tillid til at være præsentere på den samme cellulære koncentration i alle prøver. For eksempel, bruges niveau af en "husholdning" RNA-lignende ribosomale RNA ofte som en endogen reference at sammenligne de relative mængder af et andet RNA mellem forskellige prøver13. Men dette er til megen nytte, hvis den cellulære koncentration af reference RNA varierer mellem prøver, som kan være tilfældet for ribosomale RNA, hvis prøveudtagningen sker under en stress reaktion15,16,17 eller under indtræden i stationær fase17. Tilsætning af spike celler til de eksperimentelle prøver før RNA oprensning giver en solid og præcis måde af normalisering uafhængigt af opsætningen for prøveudtagning. En anden måde at standardisering er tilføjelsen af en eller flere spike-i RNA'er til de eksperimentelle prøver efter RNA oprensning. Men denne metode ikke tager højde for eventuelle forskelle i RNA opsving mellem prøver.
Ved hjælp af E. coli celler at overexpress reference RNA som spike-i celler (Se figur 1) i et eksperiment på E. coli har den ulempe, at det fremgår desuden af en lille mængde af eksogene E. coli alt RNA til den prøver. Vi korrigere for denne tilsætning ved at analysere en prøve, der indeholder kun spike-i celler sideløbende med de eksperimenterende prøver (se den nordlige duppes i figur 2, lane mærket "selC"). Protokollen præsenteret er udviklet til E. coli K-12 men er tilbøjelige til at være gældende for de fleste bakteriearter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>Purity &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Serva</td>
			<td>79-06-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis (N,N&#39;-Methylene-bis-acrylamide)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108-95-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring Sperm DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100403-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P32 &#947;ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos (probes)</td>
			<td>TAG Copenhagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+ membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydridization oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger-M&#252;ller tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor imager screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) er en væsentlig del af den translationel maskiner i enhver organisme. tRNAer binder og overføre aminosyrer at oversætte ribosomet. De relative niveauer af forskellige tRNAer og forholdet mellem aminoacylated tRNA til samlede tRNA, kendt som niveauet opladning er vigtige faktorer i fastlæggelsen af nøjagtighed og hastighed af oversættelse. Derfor, overflod og opladning niveauer af tRNAer er vigtige variabler at måle når man studerer proteinsyntese, for eksempel på forskellige betingelser, stress. Her, beskriver vi en metode til høst tRNA og direkte måling af den relative forekomst og den absolutte opladning niveau af specifikke tRNA arter i Escherichia coli. TRNA er høstet på en sådan måde, at den labile bånd mellem tRNA og dens aminosyre er bevaret. RNA er derefter underkastes gelelektroforese og Northern blotting, hvilket resulterer i separation af de ladede og tomt tRNAer. Niveauer af specifikke tRNAer i forskellige prøver kan sammenlignes på grund af tilsætning af spike celler til normalisering. Før RNA oprensning tilføje vi 5% af E. coli celler, at overproducere den sjældne tRNAselC til hver prøve. Mængden af tRNA arter af interesse i en stikprøve er derefter normaliseret til mængden af tRNAselC i samme prøve. Tilsætning af spike celler før RNA oprensning har fordel over tilsætning af renset spike-i RNA'er, der også står for eventuelle forskelle i celle lysis effektivitet mellem prøver.

Ved hjælp af fremgangsmåden beskrevet her, overflod og opladning niveauer af tre tRNAer blev målt i E. coli K-12 før og under aminosyre sult.
Arginin auxotroph stamme NF9154 (thr leu hans argH thi mtl supE44) blev dyrket for mindst ti generationer i MOPS minimal medium suppleret med 0,4% glycerol, 50 µg/mL threonin, leucin, arginin og 5 µg/mL histidin ved 37 ° C ryster på 160 rpm...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli at JoVE.com

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantificering af overfloden og opladning niveauer af overførsel RNA'er i Escherichia coli

Her præsenterer vi en metode til direkte måling af transfer RNA opladning niveauer fra renset Escherichia coli RNA samt en måde at sammenligne relative niveauer af transfer RNA eller nogen andre korte RNA, på tværs af forskellige prøver baseret på tilsætning af spike-i celler, der udtrykker en reference genet.

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Instrueret Protein Emballage inden ydermembranvesikler fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produktion og oprensning

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Påvisning af pH-afhængige aktivitet af<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In vitro</em&gt; og<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantificering af hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Storproduktion af rekombinant RNA'er på en cirkulær stillads ved hjælp af en Viroid-afledte System i Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed mutagenese for In Vitro og i Vivo eksperimenter eksemplificeret med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Brug af Alu Element, der indeholder Minigenes til at analysere cirkulære RNA'er

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering af membran transportører ved heterologe udtryk i E. coli og fremstilling af membran vesikler

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantificering af coenzym A i celler og væv

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

RNA Blot analyse til påvisning og kvantificering af plantemikrorna'er

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specifik lysin acetylering af Histoner for nukleosom rekonstitution ved hjælp af genetisk kode ekspansion i Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...