Name: quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli
Uploaded: 2017-08-22T14:00:00
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저자는 우수한 기술 지원 마리 트 Warrer를 감사합니다. 이 작품은 독립적인 연구에 대 한 덴마크 위원회에 의해 지원 되었다 | 자연 과학 [1323-00343B] 고 덴마크 연구 재단 [DNRF120].

1. 세균성 문화의 준비.
최대 1/6의 문화/플라스 크 볼륨 비율 삼각 플라스 크에 <ol><li>성장 모든 문화. 전형적인 실험 설정에서 성장 37.0 ° C에서 문화 및 morpholinepropanesulfonic 산 (MOPS) 최소한의 중간 18 선호 탄소 소스, 예를 들어 0.2% 포도 당, 적어도 10와 보완에 160 rpm에 떨고 RNA 수확을 하기 전에 연속 세대.</li>
	<li>RNA 수확 전에 하루 희석 MOPS 다음 날 원하는 시간에 원하는 OD 4...

<ol>
	<li>Varshney, U., Lee, C. -. P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase.">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li><li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel(+)+and+Rel(-)+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Kr&#252;ger, M. K., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo.">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li><li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Mu&#241;oz-G&#243;mez, A. J., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li><li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs.">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li><li>Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+and+alternatives+in+reading+the+universal+genetic+code.">Errors and alternatives in reading the universal genetic code.</a> Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).</li><li>Traxler, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global,+ppGpp-mediated+stringent+response+to+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNAs+Mediate+the+Rapid+Adaptation+of+Escherichia+coli+to+Oxidative+Stress.">Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress.</a> PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).</li><li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+(Asn).">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li><li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation:+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition.">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li><li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR.">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).</li><li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli.">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li><li>McCarthy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+magnesium+starvation+on+the+ribosome+content+of+Escherichia+coli.">The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).</li><li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli.">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li><li>Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+degradation+in+growing+bacteria.">Ribosome degradation in growing bacteria.</a> EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).</li><li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium.">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases.">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li></ol>

이 프로토콜 특정 대장균 의 충전 레벨을 동시에 측정 하는 방법에 설명 합니다 tRNAs 다른 샘플에 tRNAs의 상대적 수준을 비교 하 고. 1) 2)는 다른 샘플에서 상대 tRNA 수준을 안정적으로 비교 될 수 있다, 같은 방식으로 tRNA 수량을 정상화 하 고 3) sp 셀룰러 tRNA 충전 레벨 유지 되는 방식으로 샘플을 처리 하는 프로토콜의 중요 한 포인트는 관심의 tRNAs에 대 한 선택 된 프로브 ecificity. 이러한 포?...

다음, 우리는 특정 tRNAs 측정에 대 한 방법을 제시 하 고 북부 blotting에 의해 레벨을 측정 하 고 그들의 충전. 방법은 먼저 Varshney 그 외 여러분 에 의해 개발 된 기술에 기반 1. trichloroacetic 산 (TCA)으로 세포를 수확 하 고 RNA 정화에 걸쳐 0 ° C에서 샘플을 유지는 tRNA는 아미노산 사이의 에스테 르 결합은 보존된2,,34. Aminoacylated tRNAs 구별 될 수 있다 그들의 nonacylated에서 젤 전기 이동 법 그리고 북부 blotting에 의해 때문에 aminoacylated의 감소 이동성에 기인한 covalently 바인딩된 아미노산5젤에 tRNA. 또한, 우리는 스파이크 셀 거의 사용된 tRNAselC 4overexpressing의 추가 의해 tRNA 수량 정상화에 대 한 프로토콜을 제시.
tRNAs 세균성 세포 및 번역 기계에의 한 절대적으로 중요 한 부분에 있는 가장 풍부한 분자의 일부입니다. tRNAs는 아미노산 바인딩 그리고 번역 리보솜에 그들을 전송. (Aminoacylation 또는 충전) tRNAs에 아미노산의 바인딩 aminoacyl tRNA synthetases에 의해 촉진 된다. Underrepresentation는 동계어의 청구 주어진된 메신저 RNA (mRNA) 코 돈에 tRNA 근처 동계어 tRNA는 가능성을 증가 하기 때문에 다른 충전된 tRNAs의 관계 되는 풍부는 단백질 합성의 품질 보장을 위한 중요 한 잘못 리보솜6에 성장 polypeptide 사슬의 아미노산을 제공 합니다. TRNA 위탁된의 중요성;는 tRNA의 충전 레벨에 심각한 드롭 대장균 세포의 광범위 한 응답에 반영 됩니다. 엄격한 응답입니다. 엄격한 응답 동안 tRNAs 리보솜 RNAs, 대부분 mRNAs의 합성은 아미노산 생 합성 및 스트레스 생존와 관련 된 특정 mRNAs의 녹음 방송에 찬성 하 여 하향 조정 하 고 세포의 성장 율은 극적으로 낮 췄 다7 . 또한, 우리와 다른 사람에 의해 최근 작품 대장균 적극적으로 대부분 tRNA 레벨의 조정 될 수 있습니다 제안 번역4,8을 제한 하는 스트레스에 대 한 응답에서의 tRNA의 저하를 보이고 있다 이러한 스트레스와 대처에 대 한 중요 한. 따라서, tRNA 나타났는데 및 충전 레벨의 신뢰할 수 있는 측정 세균성 긴장 응답을 완전히 이해 하기 위한 중요 한 도구가 됩니다.
대장균 은 일반적으로 재조합 단백질을 표현 하는 데 사용 됩니다 그리고 차이 codon 사용법에서 종 사이, 차선 식 자주 직면 하는 문제9. 이 재조합 mRNA10번역 하는 데 필요한 추가 tRNAs의 표현에 의해 피할 수 있다. 이러한 긴장에 레벨 충전 하는 tRNA의 측정 문제 해결 노력을 안내 하 고 단백질 식이 최적화 하는 데 도움이 수 있습니다.
이 메서드는 또한 "mischarging";의 검색을 수 있습니다. 비 동계어 아미노산 tRNA 분자 aminoacylated 다른 아미노산에 의해 Aminoacylation polyacrylamide 젤1,11을 통해 약간 다른 속도으로 마이그레이션할 tRNA를 발생할 수 있습니다. 경우에 따라 방법 또한 달리 동일한 tRNAs3에 다른 수정 패턴을 구별 하 사용할 수 있습니다.
다른 레벨을 충전 하는 tRNA의 조사는 산화를 periodate에 대 한 생 화 확 적인 절차를 설립. 메서드는 tRNA에서 보호 하는 aminoacylated periodate 산화 및 충전된 tRNA는 관찰에 의존 합니다. 후에 수확된 하는 RNA의 충전 수준을 추정 하는 데 사용은 tRNA의 재충전 산화 치료 periodate. 그러나, 여러 tRNAs 충전 표시 되었습니다 일부 부정확12제공 하는 치료에 의해 영향을 받을 것. 방법 제시 여기 측정값 순화 된 RNA에서 직접 충전, 따라서 화학 또는 효소 반응에서 어떤 편견을 제외. 이 방법의 한 가지 한계는 그 하나만 tRNA 종 그것은 어렵고 다소 많은 tRNAs에 데이터를 수집 하는 힘이 드는 비록 동일한 북부 오 점 제거 하 고 여러 tRNAs에 대 한 reprobed 될 수 있으므로 한 번에 검색.
서로 게 샘플을 정상화의 신뢰할 수 있는 방법은 목표 다른 샘플에서 분자의 상대적 수준을 비교 하는 연구에 생명 이다. 여기 우리는 RNA 어디 드문 tRNAselC overexpressing 대장균 세포의 작은 약 수는으로 추가 스파이크에 RNA 정화 전에 모든 실험 샘플에 대 한 표준화 절차를 소개 합니다. 이 방법은 tRNAs 검사 하는 경우에 뿐만 아니라 그러나 RNA의 어떤 종의 상대 정량화에 대 한 모든 샘플에서 동일한 세포 농도에 현재 아무 생 RNA 수 신뢰할 수 있는 그런 실험적인 체제 때 유용 하다. 예를 들어 다른 사이 다른 RNA의 상대적 양을 비교 하는 내 생 참조 샘플13로 "가사" RNA 같은 리보솜 RNA의 수준 자주 사용. 그러나 이것은 거의 사용 경우 참조 RNA의 세포 농도 샘플, 사이 차이 수 ribosomal RNA의 경우 샘플링 스트레스 응답15,,1617 또는 도중 발생 하는 경우 고정 단계17로 항목입니다. 스파이크 셀 이전에 RNA 정화 실험 샘플의 추가 샘플링 설치의 독립적인 정규화의 견고 하 고 정확한 방법을 제공합니다. 표준화의 또 다른 방법은 RNA 정화 후 하나 이상의 스파이크에 RNAs 실험 샘플의 추가 이다. 그러나,이 방법은 견본 사이의 RNA 복구에 차이 대 한 고려 하지 않습니다.
대장균 세포를 사용 하 여 참조 RNA 스파이크 셀 ( 그림 1참조)으로 대장균 에 대 한 실험 결과 단점이 그 overexpress 또한 외 인 대장균 의 작은 금액의 총 RNA에는 샘플입니다. 우리는이 추가 대 한 실험 샘플 (참조 그림 2, 차선 "selC" 라는 오 점 북)와 병렬로 스파이크에만 셀을 포함 하는 샘플을 분석 하 여 수정 합니다. 제시 하는 프로토콜은 대장균 K-12 위해 개발 하지만 대부분 세균성 종에 적용 될 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>Purity &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Serva</td>
			<td>79-06-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis (N,N&#39;-Methylene-bis-acrylamide)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108-95-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring Sperm DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100403-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P32 &#947;ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos (probes)</td>
			<td>TAG Copenhagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+ membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydridization oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger-M&#252;ller tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor imager screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli

이동 RNA (tRNA) 변환 기계 어떤 유기 체에서의 필수적인 부분입니다. tRNAs 바인딩할 하 고 번역 리보솜에 아미노산을 전송. 다른 tRNAs의 상대 수준 및 aminoacylated의 비율 충전 수준으로 알려진 총 tRNA에 tRNA는 정확성과 번역의 속도 결정에 중요 한 요소. 따라서, 풍요로 움과 tRNAs의 충전 레벨 측정 단백질 합성, 다양 한 스트레스 조건 예를 공부 하는 때에 중요 한 변수가 있다. 여기, 우리가 수확 하는 tRNA와 직접 상대 풍요로 움과 대장균에 특정 tRNA의 절대 충전 레벨을 측정 하는 방법을 설명 합니다. tRNA는 tRNA의 아미노산 사이 정한 채권 유지 되는 그런 방법으로 수확 이다. RNA는 다음 젤 전기 이동 법 그리고 북부 더럽혀, 충전 및 충전 tRNAs의 분리에는 결과를 받게 됩니다. 다른 샘플에서 특정 tRNAs 수준의 스파이크 셀 정규화의 추가 때문에 비교할 수 있습니다. RNA 정화, 전에 우리는 각 샘플에 드문 tRNAselC 당신과 대장균 세포의 5%를 추가 합니다. TRNA 종의 샘플에 관심의 금액은 다음 tRNAselC 동일한 샘플의 양을 정규화 됩니다. 스파이크에 RNA 정화 이전 셀의 추가 또한 샘플 사이 세포 세포의 용 해 효율 차이 차지 하는 순화 된 스파이크에 RNAs의 추가 이점이 있다.

절차를 사용 하 여 풍부 하 고 전과 아미노산 기아 중 레벨 3 tRNAs의 대장균 K-12에 측정 되었다 충전 여기, 설명 합니다.
아르기닌 주별 NF9154 스트레인 (세 레이 그의 아 티 mtl supE44) MOPS 최소한의 매체와 0.4% 글리세롤, 50 µ g/mL 트레오닌, 신, 아르기닌, 37 ° C에서 흔들어에서 5 µ g/mL 히스티딘 보충에 ...

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Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

풍부 하 고 대장균 에서 전송 RNAs의 레벨 충전의 정량화

여기에 우리가 직접 스파이크에 추가에 따라 다른 샘플에서 이동 RNA의 상대적 수준 또는 다른 짧은 RNA를 비교 하는 방법 뿐만 아니라 순화 된 대장균 RNA에서 레벨을 충전 하는 전송 RNA를 측정 하는 방법 제시 셀 참조 유전자 표현입니다.

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Research

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Biochemistry

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

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에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

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In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

세포와 조직에서 코엔자임 A의 정량화

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

식물 MicroRNAs의 검출 및 정량화를 위한 RNA 블롯 분석

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...