Name: quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli
Uploaded: 2017-08-22T14:00:00
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Os autores agradecer Marit Warrer excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho dinamarquês para pesquisa independente | Ciências naturais [1323-00343B] e a Fundação de pesquisa nacional dinamarquesa [DNRF120].

1. preparação de culturas bacterianas.
<ol><li>Crescer todas as culturas em Erlenmeyers com uma relação de volume de cultura/frasco no máximo 1/6. Em uma instalação experimental típica, crescem as culturas a 37,0 ° C e agitando a 160 rpm em morpholinepropanesulfonic ácido (MOPS) mínimo médio 18 suplementado com a fonte de carbono preferencial, por exemplo glicose 0,2%, pelo menos 10 gerações consecutivas antes da colheita do RNA.</li>
	<li>o dia antes da colheita de RNA, diluir u...

<ol>
	<li>Varshney, U., Lee, C. -. P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase.">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li><li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel(+)+and+Rel(-)+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Kr&#252;ger, M. K., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo.">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li><li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Mu&#241;oz-G&#243;mez, A. J., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li><li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs.">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li><li>Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+and+alternatives+in+reading+the+universal+genetic+code.">Errors and alternatives in reading the universal genetic code.</a> Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).</li><li>Traxler, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global,+ppGpp-mediated+stringent+response+to+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNAs+Mediate+the+Rapid+Adaptation+of+Escherichia+coli+to+Oxidative+Stress.">Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress.</a> PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).</li><li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+(Asn).">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li><li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation:+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition.">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li><li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR.">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).</li><li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli.">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li><li>McCarthy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+magnesium+starvation+on+the+ribosome+content+of+Escherichia+coli.">The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).</li><li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli.">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li><li>Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+degradation+in+growing+bacteria.">Ribosome degradation in growing bacteria.</a> EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).</li><li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium.">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases.">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li></ol>

Este protocolo descreve como simultaneamente, medir o nível de carga de específico de e. coli tRNAs e comparar os níveis relativos dos tRNAs em amostras diferentes. Os pontos críticos do protocolo são 1) para manipular as amostras de tal forma que os níveis de carga celular tRNA são retidos, 2) para normalizar as quantidades de tRNA de tal forma que níveis de tRNA relativo em amostras diferentes podem ser comparados confiantemente e 3) para garantir a sp ecificity dos testes selecionados para os tRNAs de...

A seguir, apresentamos um método para quantificar os tRNAs específicas e níveis de medição de sua carga pela mancha do Norte. O método é baseado em uma técnica desenvolvida por Vieira et al . 1. colheita de células em ácido tricloroacético (TCA) e mantendo as amostras a 0 ° C em toda a purificação de RNA, a ligação éster entre o tRNA e o aminoácido é conservada2,3,4. TRNAs Aminoacylated distingue suas contrapartes nonacylated por eletroforese em gel e mancha do Norte, devido a uma diminuição da mobilidade do aminoacylated tRNA no gel, causado por aminoácido covalentemente ligados5. Além disso, apresentamos um protocolo para normalizar as quantidades de tRNA por adição de pico-em células superexpressão do usados raramente tRNAselC 4.
os tRNAs são algumas das moléculas mais abundantes na célula bacteriana e uma parte absolutamente vital da maquinaria de tradução. os tRNAs vincular aminoácidos e transferi-los para os traduzir ribossomas. A ligação dos aminoácidos para tRNAs (aminoacylation ou carregamento) é facilitada pela aminoacil sintetases de tRNA. A abundância relativa de diferentes tRNAs carregada é importante para garantir a fidelidade da síntese de proteínas, porque sub-representação do cognato acusado que tRNA para um codão de determinado RNA mensageiro (mRNA) aumenta a probabilidade de que um tRNA perto-cognato serão erroneamente entrega seu aminoácido à cadeia de polipeptídeo crescente no Ribossoma6. A importância do tRNA carregada é refletida na extensa resposta da célula de e. coli para uma severa queda nos níveis de carregamento de um tRNA; a resposta rigorosa. Durante a resposta rigorosa a síntese dos tRNAs, RNAs ribossomal e maioria dos mRNAs é abaixada em favor de transcrição de mRNAs específicos associados a sobrevivência de biossíntese e estresse de aminoácido, e a taxa de crescimento das células é reduzida drasticamente7 . Além disso, o recente trabalho de nos revelou que a Escherichia coli ativamente degrada a maioria dos seus tRNA em resposta ao estresse que limitam a tradução4,8, sugerindo que o ajuste dos níveis de tRNA pode ser importante para lidar com tais tensões. Assim, medições correctas de abundâncias de tRNA e níveis de carregamento será uma ferramenta importante para compreender plenamente a respostas bacterianas do stress.
Escherichia coli é comumente usado para expressar a proteína recombinante e devido às diferenças no uso do códon entre espécies, expressão de qualidade inferior é um problema muitas vezes enfrentado9. Isto pode ser contornado pela expressão de tRNAs adicionais necessários para traduzir o mRNA recombinante10. Medições do tRNA níveis em tais cepas de carregamento poderiam orientar os esforços de solução de problemas e ajudar a aperfeiçoar a expressão de proteínas.
Este método também permite a detecção de "mischarging"; um aminoacylated da molécula de tRNA com um aminoácido não-cognato. Aminoacylation por aminoácidos diferentes pode causar um tRNA migrar com velocidades ligeiramente diferentes através de géis de poliacrilamida1,11. Em alguns casos, o método também pode ser usado para distinguir padrões diferentes de modificação em idênticas tRNAs3.
Outro estabelecido procedimento bioquímico para a investigação do tRNA níveis de carregamento é periodato de oxidação. O método baseia-se na observação de que a aminoacylated-tRNA é protegido de periodato de oxidação e tRNA descarregado não é. Depois periodato tratamento de oxidação a recarga do tRNA é usada para estimar os níveis de carga do RNA colhido. No entanto, a recarga de vários tRNAs foi mostrado para ser afetado pelo tratamento proporcionando alguma imprecisão12. O método apresentado aqui medidas de carregamento diretamente do RNA purificado, excluindo assim qualquer preconceitos de reações químicas ou enzimáticas. Uma limitação deste método é que apenas uma espécie de tRNA é detectado em um momento, então, embora a mesma Northern blot pode ser descascado e reprobed de vários tRNAs, é demorado e um tanto trabalhoso coletar dados sobre muitos tRNAs.
Uma maneira confiável de normalizar as amostras para o outro é vital em estudos onde o objetivo é comparar os níveis relativos de uma molécula através de amostras diferentes. Aqui apresentamos um procedimento de normalização para o RNA, onde uma pequena alíquota de células de Escherichia coli superexpressão do tRNA raroselC é adicionada como um pico em que todas as amostras experimentais antes da purificação de RNA. Este método é útil não só ao examinar os tRNAs mas para quantificação relativa de qualquer espécie de RNA quando a instalação experimental é tal que nenhum RNA endógena pode ser confiável para ser apresenta na mesma concentração celular em todas as amostras. Por exemplo, o nível de um "housekeeping" como RNA ribossómico (ARNR) muitas vezes é usado como uma referência endógena para comparar as quantidades relativas de outro RNA entre diferentes amostras de13. Mas isso é de pouca utilidade se a concentração celular do RNA referência varia entre amostras, como pode ser o caso para o RNA ribossômico se amostragem ocorre durante um esforço resposta15,16,17 ou durante entrada em fase estacionária17. A adição de pico-em células com as amostras experimentais antes da purificação de RNA fornece uma forma sólida e precisa de normalização independente da instalação do amostragem. Outra forma de padronização é a adição de um ou mais pico-em RNAs para as amostras experimentais após a purificação de RNA. No entanto, este método não leva em conta diferenças eventuais na recuperação de RNA entre as amostras.
Usando células de Escherichia coli que overexpress a referência de RNA como spike-em células (ver Figura 1) em um experimento em e. coli tem a desvantagem de que resulta além de uma pequena quantidade de exógenos Escherichia coli total RNA para a amostras. Podemos corrigir para este acréscimo através da análise de uma amostra contendo somente spike-em células em paralelo com as amostras experimentais (ver o norte borre na pista Figura 2, , rotulada "selC"). O protocolo apresentado é desenvolvido para Escherichia coli K-12, mas é provável que seja aplicável para a maioria das espécies bacterianas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>Purity &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Serva</td>
			<td>79-06-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis (N,N&#39;-Methylene-bis-acrylamide)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108-95-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring Sperm DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100403-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P32 &#947;ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos (probes)</td>
			<td>TAG Copenhagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+ membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydridization oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger-M&#252;ller tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor imager screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli

RNA de transferência (tRNA) é uma parte essencial da maquinaria translacional em qualquer organismo. os tRNAs bind e transferir os aminoácidos para o ribossoma traduzir. Os níveis relativos de tRNAs diferentes e a relação de aminoacylated tRNA para total tRNA, conhecido como o nível de carga, são fatores importantes na determinação da precisão e velocidade de tradução. Portanto, a abundância e níveis de carga dos tRNAs são variáveis importantes para medir quando estudar a síntese de proteínas, por exemplo, sob diferentes condições de estresse. Aqui, descrevemos um método para a colheita de tRNA e medição diretamente tanto a abundância relativa e o nível de carregamento absoluto de espécies específicas de tRNA em Escherichia coli. O tRNA é colhida de forma que o laço lábil entre o tRNA e o aminoácido é preservado. O RNA é então submetido a electroforese do gel e do Norte, mancha, que resulta em separação entre os tRNAs carregado e descarregado. Os níveis de tRNAs específico em amostras diferentes podem ser comparados devido à adição de pico-em células para normalização. Antes da purificação de RNA, adicionar 5% de células de Escherichia coli que overproduce o tRNA raroselC para cada amostra. A quantidade de espécies de interesse em uma amostra de tRNA então é normalizada para a quantidade de tRNAselC na mesma amostra. Adição de pico-em células antes da purificação de RNA tem a vantagem sobre a adição de purificado spike-em RNAs que é também responsável por eventuais diferenças de eficiência de lise celular entre as amostras.

Usar o procedimento descrito aqui, a abundância e cobrando os níveis dos três tRNAs foram medidos em Escherichia coli K-12 antes e durante a fome de aminoácidos.
O auxotroph de arginina estirpe NF9154 (thr leu sua argH thi mtl supE44) foi cultivada pelo menos dez gerações em MOPS mínimo suplementado com 0,4% de glicerol, 50 treonina µ g/mL, leucina, arginina e histidina 5 µ g/mL...

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Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantificação de abundância e carregamento níveis de RNAs de transferência em Escherichia coli

Aqui nós apresentamos um método para medir diretamente o RNA de transferência, níveis de carga de purificado Escherichia coli RNA, bem como uma maneira de comparar os níveis relativos do RNA de transferência, ou qualquer outro RNA curto, entre diferentes amostras baseadas na adição de pico-no células expressando um gene de referência.

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Research

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