Name: quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli
Uploaded: 2017-08-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli at JoVE.com

Författarna vill tacka Marit Warrer för utmärkt teknisk assistans. Detta arbete stöds av danska rådet för oberoende forskning | Naturvetenskap [1323-00343B] och danska National Research Foundation [DNRF120].

1. beredning av bakteriekulturer.
<ol><li>Växa alla kulturer i Erlenmeyer-kolvar med en kultur/kolv volymförhållandet av högst 1/6. I en typisk experimentella setup, växa kulturerna på 37,0 ° C och skaka på 160 rpm i morpholinepropanesulfonic syra (moppar) minimal medium 18 kompletteras med den föredragna kolkälla, till exempel 0,2% glukos, minst 10 på varandra följande generationer innan RNA skörd.</li>
	<li>Dagen innan RNA skörd, späd en urvuxen kultur av önskad stammen i mop...

<ol>
	<li>Varshney, U., Lee, C. -. P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase.">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li><li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel(+)+and+Rel(-)+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Kr&#252;ger, M. K., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo.">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li><li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Mu&#241;oz-G&#243;mez, A. J., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li><li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs.">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li><li>Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+and+alternatives+in+reading+the+universal+genetic+code.">Errors and alternatives in reading the universal genetic code.</a> Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).</li><li>Traxler, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global,+ppGpp-mediated+stringent+response+to+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNAs+Mediate+the+Rapid+Adaptation+of+Escherichia+coli+to+Oxidative+Stress.">Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress.</a> PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).</li><li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+(Asn).">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li><li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation:+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition.">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li><li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR.">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).</li><li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli.">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li><li>McCarthy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+magnesium+starvation+on+the+ribosome+content+of+Escherichia+coli.">The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).</li><li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli.">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li><li>Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+degradation+in+growing+bacteria.">Ribosome degradation in growing bacteria.</a> EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).</li><li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium.">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases.">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li></ol>

Det här protokollet beskriver hur man samtidigt mäta nivån laddning av specifika E. coli tRNAs och jämföra de relativa nivåerna av tRNAsna i olika prover. De kritiska punkterna i protokollet är 1) att hantera proverna på ett sådant sätt att de cellulära tRNA laddning nivåerna behålls, 2) att normalisera tRNA kvantiteter på ett sådant sätt att relativa tRNA nivåer i olika prover kan jämföras på ett tillförlitligt sätt, och 3) att säkerställa sp ecificity av de valda sonderna för tRNAsna s...

I följande presenterar vi en metod för att kvantifiera specifika tRNAs och mäta deras laddning nivåer av Northern blotting. Metoden bygger på en teknik som utvecklades av Varshney o.a. 1. genom skörd celler i triklorättiksyra (TCA) och hålla proverna vid 0 ° C under hela RNA rening, ester bindningen mellan tRNAen och aminosyran är bevarade2,3,4. Aminoacylated tRNAs kan skiljas från sina nonacylated motsvarigheter gelelektrofores och Northern blotting, tack till en minskad rörlighet i aminoacylated tRNA i gelen, orsakade av kovalent bundna aminosyra5. Dessutom presenterar vi ett protokoll för att normalisera tRNA kvantiteter genom tillsats av spike-celler överuttryck används sällan tRNAselC 4.
tRNAsna är några av de vanligast förekommande molekylerna i cellen bakteriell och en absolut nödvändig del av översättning maskiner. tRNAs binda aminosyror och överföra dem till att översätta ribosomerna. Bindningen av aminosyror till tRNAs (aminoacylation eller laddning) underlättas av aminoacyl tRNA synthetases. Det relativa överflödet av olika laddade tRNAsna är viktiga för att garantera trohet i proteinsyntesen, eftersom underrepresentation av besläktat laddad tRNA för en given budbärar-RNA (mRNA) codon ökar sannolikheten för att en nära-besläktat tRNA kommer felaktigt leverera sin aminosyra till den växande polypeptidkedja på Ribosomen6. Vikten av laddad tRNA återspeglas i den omfattande Svaren av E. coli cellen till en allvarlig nedgång i laddning nivåer av en tRNA; den stränga svaren. Under den stränga Svaren syntes av tRNAs, ribosomalt RNA och de flesta mRNA sänks till förmån för transkription av specifika mRNA associerade med aminosyran biosyntes och stress överlevnad och tillväxttakten i cellerna sänks dramatiskt7 . Senaste arbete av oss och andra har dessutom visat att E. coli aktivt försämras majoriteten av dess tRNA svar betonar att begränsar översättning4,8, vilket tyder på att justering av tRNA nivåerna kan vara viktigt för att klara sådana påfrestningar. Pålitliga mätningar av tRNA sammansättning och laddning nivåer kommer således vara ett viktigt verktyg för att fullt förstå bakteriell stressreaktioner.
E. coli används ofta uttrycka rekombinant protein och på grund av skillnader i kodon användning mellan arter, suboptimal uttryck är ett problem som ofta inför9. Detta kan kringgås genom uttryck för ytterligare tRNAs behövs för att översätta de rekombinanta mRNA-10. Mätningar av tRNA laddning nivåer i sådana stammar kunde vägleda felsökning insatser och bidrar till att optimera proteinuttryck.
Denna metod möjliggör också upptäckt av ”mischarging”; en tRNA molekyl aminoacylated med en icke-besläktat aminosyra. Aminoacylation av olika aminosyror kan orsaka en tRNA att migrera med lite olika hastigheter genom polyakrylamidgeler1,11. I vissa fall kan metoden också användas för att skilja olika modifiering mönster på annars identiska tRNAs3.
En annan etablerad biokemiska proceduren för utredningen av tRNA laddning nivåer är natriumperjodat oxidation. Metoden bygger på iakttagelsen att aminoacylated tRNA är skyddad från natriumperjodat oxidation och oladdade tRNA är inte. Efter natriumperjodat oxidation behandling laddning av tRNAen används för att uppskatta laddning nivåerna av den skördade RNA. Laddning av flera tRNAs har dock visat sig påverkas av behandling vilket ger vissa felaktigheter12. Metoden presenteras här åtgärder laddning direkt från renat RNA, alltså exklusive eventuella fördomar från kemiska eller enzymatiska reaktioner. En begränsning med denna metod är att endast en tRNA arter upptäcks i taget, så även om den samma Northern blot kan strippad och reprobed för flera tRNAs, det är tidskrävande och ganska arbetsamt att samla in uppgifter om många tRNAs.
Ett tillförlitligt sätt i normalisera prover till varandra är vital i studier där målet är att jämföra de relativa nivåerna av en molekyl mellan olika prover. Här presenterar vi en normalisering förfarande för RNA där en liten delmängd av E. coli celler överuttryck av den sällsynta tRNAselC läggs som ett spike till alla experimentella proverna före RNA rening. Denna metod är användbar inte bara vid prövningen tRNAs men för relativ kvantifiering av någon art av RNA när den experimentella setup är sådan att ingen endogena RNA kan vara betrodd att vara närvarande vid samma cellulära koncentrationen i alla prover. Till exempel används nivån på en ”städning” RNA-liknande ribosomalt RNA ofta som en endogen referens att jämföra de relativa mängder en annan RNA mellan olika prover13. Men detta är till liten nytta om den cellulära koncentrationen av referens RNA varierar mellan prover, som kan vara fallet för ribosomalt RNA om provtagning sker under en stress svar15,16,17 eller under trätt i stationär fas17. Tillsats av spike celler till experimentella proverna före RNA rening ger ett fast och korrekt sätt att normalisering oberoende av inställningen för provtagning. Ett annat sätt att standardisering är tillägget av en eller flera spike-i RNAs till experimentella proverna efter RNA rening. Denna metod tar dock inte hänsyn till eventuella skillnader i RNA återhämtning mellan prover.
Med E. coli -celler som overexpress hänvisningen RNA som spike-i celler (se figur 1) i ett experiment på E. coli har den nackdelen att det resulterar i tillägg av en liten mängd av exogena E. coli totalt RNA till den prover. Vi korrigera för detta tillägg genom att analysera ett prov som innehåller endast spike celler parallellt med experimentella proverna (se nordligt blot i figur 2, lane märkt ”selC”). Det protokoll som presenteras är utvecklad för E. coli k-12 men sannolikt är tillämpliga för de flesta bakteriearter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>Purity &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Serva</td>
			<td>79-06-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis (N,N&#39;-Methylene-bis-acrylamide)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108-95-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring Sperm DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100403-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P32 &#947;ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos (probes)</td>
			<td>TAG Copenhagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+ membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydridization oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger-M&#252;ller tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor imager screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli

Överföring RNA (tRNA) är en viktig del av den translationella maskinen i någon organism. tRNAs binda och överföra aminosyror till översätta Ribosomen. De relativa nivåerna av olika tRNAs, och förhållandet mellan aminoacylated tRNA till totala tRNA, känd som den laddning nivån, är viktiga faktorer vid fastställandet av den noggrannhet och hastighet av översättning. Överflöd och laddning nivåer av tRNAsna är därför viktiga variabler att mäta när man studerar proteinsyntesen, till exempel under olika stress förhållanden. Här, beskriver vi en metod för skörd tRNA och direkt mäta både relativ överflödet och den absoluta laddning nivån av specifika tRNA arter i Escherichia coli. TRNAen skördas på ett sådant sätt att den labila bond mellan tRNAen och dess aminosyra bevaras. RNA utsätts sedan för gelelektrofores och Northern blotting, vilket resulterar i separation av de laddade och oladdade tRNAsna. Nivåerna av specifika tRNAs i olika prover kan jämföras på grund av tillägg av spike celler för normalisering. Innan RNA rening, vi lägger till 5% av E. coli -celler som överproducera de sällsynta tRNA-selC till varje prov. Beloppet av tRNA arter av intresse i ett prov är sedan normaliserat till mängden tRNAselC i samma prov. Tillägg av spike celler innan RNA rening har fördelen över tillägg av renat spike-i RNAs som det också står för eventuella skillnader i cell lysis effektivitet mellan prover.

Med hjälp av proceduren som beskrivs här, överflödet och laddning nivåer av tre tRNAs mättes i E. coli k-12 före och under aminosyra svält.
Det arginin auxotroph stam NF9154 (thr leu hans argH thi mtl supE44) var odlas för minst tio generationer i moppar minimalmedium kompletteras med 0,4% glycerol, 50 µg/mL treonin, leucin, arginin och 5 µg/mL histidin vid 37 ° C skakar på ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli at JoVE.com

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantifiering av överflödet och laddning nivåer av överföring RNAs i Escherichia coli

Här presenterar vi en metod för att direkt mäta överföring RNA laddning nivåer från renat Escherichia coli RNA samt ett sätt att jämföra relativ nivåer av överföring RNA, eller några andra korta RNA, över olika prover baserat på tillägg av spike-i celler som uttrycker en referens-gen.

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Riktad Protein Förpackning inom yttre membranvesiklar från<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produktion och rening

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detektering av den pH-beroende aktivitet för<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; och<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifiering av hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Storskalig produktion av rekombinant RNAs på en cirkulär byggnadsställning Viroid-härledda System med i Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Webbplats riktad mutagenes för In Vitro och i Vivo experiment exemplifieras med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Användning av Alu Element som innehåller Minigenes för att analysera cirkulära RNA

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering av membran transportörer genom heterologt uttryck i E. coli och produktion av membran blåsor

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantifiering av coenzym A i celler och vävnader

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

RNA Blot Analys för detektion och kvantifiering av Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Platsspecifik lysin acetylering av histoner för nukleosomkonstitution med hjälp av genetisk kodexpansion i Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...