Name: quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli
Uploaded: 2017-08-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli at JoVE.com

Yazarlar Marit Warrer mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser bağımsız araştırma için Danimarka Konseyi tarafından desteklenmiştir | Doğa Bilimleri [1323-00343B] ve [DNRF120] Danimarka Ulusal Araştırma Vakfı.

1. bakteriyel kültürlerde hazırlanması.
<ol><li>Grow bütün kültürlerde Erlenmeyer şişeler ile bir kültür/şişesi hacim oranı en az 1/6. 37,0 ° C'de kültürler ve tercih edilen karbon kaynağı, örneğin % 0,2 glikoz, en az 10 ile takıma morpholinepropanesulfonic asit (paspas) en az orta 18 160 rpm'de sallayarak tipik bir deneysel Kur içinde büyümek RNA hasat önce üst üste nesilleri.</li>
	<li>RNA hasat, önceki gün seyreltik BEZLERİ en az orta ertesi gün istediğiniz...

<ol>
	<li>Varshney, U., Lee, C. -. P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase.">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li><li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel(+)+and+Rel(-)+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Kr&#252;ger, M. K., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo.">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li><li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Mu&#241;oz-G&#243;mez, A. J., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li><li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs.">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li><li>Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+and+alternatives+in+reading+the+universal+genetic+code.">Errors and alternatives in reading the universal genetic code.</a> Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).</li><li>Traxler, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global,+ppGpp-mediated+stringent+response+to+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNAs+Mediate+the+Rapid+Adaptation+of+Escherichia+coli+to+Oxidative+Stress.">Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress.</a> PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).</li><li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+(Asn).">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li><li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation:+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition.">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li><li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR.">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).</li><li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli.">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li><li>McCarthy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+magnesium+starvation+on+the+ribosome+content+of+Escherichia+coli.">The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).</li><li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli.">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li><li>Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+degradation+in+growing+bacteria.">Ribosome degradation in growing bacteria.</a> EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).</li><li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium.">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases.">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li></ol>

Bu iletişim kuralı aynı anda belirli E. coli şarj düzeyini ölçmek açıklar tRNA ve farklı örneklerinde tRNA göreli düzeyleri karşılaştırın. 1) örnekleri hücresel tRNA şarj düzeyleri, 2) tRNA miktarları göreli tRNA düzeyleri farklı örneklerinde güvenilir bir şekilde karşılaştırılabilir şekilde normale ve sp 3) tutulduğunu böyle bir şekilde işlemek için protokol kritik noktaları vardır tRNA ilgi için seçili sonda ecificity. Bu noktalar aşağıda ayrı ayrı ele alınmakt...

Aşağıda, biz belirli tRNA miktarının bir yöntem mevcut ve kendi şarj ölçme düzeyleri Kuzey Blot tarafından. Bu yöntem ilk Varshney vd tarafından geliştirilen bir teknik üzerinde dayanır 1. hücre trichloroacetic asit (TCA) hasat ve RNA arıtma boyunca 0 ° C'de örnekleri tutmak, korunmuş2,3,4arasında tRNA ve amino asit ester bağı olduğunu. Aminoacylated tRNA nonacylated karşılıkları Jel Elektroforez ve seçkin Kuzey kurutma, tarafından kusura bakmayın ama aminoacylated azalmış bir hareketlilik için tRNA kovalent bağlı amino asit5tarafından neden jel içinde. Ayrıca, biz tRNA miktarları sık kullanılmayan tRNAselC 4overexpressing spike hücreler ilavesi ile normalize için bir iletişim kuralı mevcut.
tRNA bakteri hücre ve çeviri makineleri kesinlikle hayati bir parçası en bol moleküllerin bazıları. tRNA amino asitleri bağlama ve çeviri ribozomlara aktarabilirsiniz. Aminoasitler tRNA (aminoacylation veya şarj) için bağlama aminoasil tRNA sentetaz tarafından yönetilir. Farklı ücret tRNA göreli bolluk protein sentezi, kalitesini sağlamak için önemli çünkü tRNA için verilen mesajcı RNA (mRNA) kodon konağımız yakınındaki tRNA eşitlenmesi olasılığını artırır konağımız underrepresentation tahsil Yanlışlıkla onun amino asit büyüyen polipeptid zinciri ribozom6teslim. Şarj edilmiş tRNA önemini E. coli hücre geniş yanıt bir tRNA şarj düzeyleri ciddi bir düşüş olarak yansıtılır; sıkı yanıt. Sıkı tepki sırasında tRNA, ribozomal RNA'ların ve çoğu mRNA sentezi, amino asit biyosentezi ve stres hayatta kalma ile ilişkili belirli mRNA'lar transkripsiyon lehine indirilir ve hücrelerin büyüme oranı önemli ölçüde düşürdü7 . Ayrıca, bize ve diğerleri tarafından son iş E. coli aktif tRNA düzeyleri ayarlama olabileceğini düşündüren onun tRNA yanıt olarak çeviri4,8, limit gerilmeler çoğunluğu düşürür gösterdi Böyle stres ile başa çıkma için önemli. Böylece, güvenilir ölçümler tRNA zenginliği ve düzeyleri şarj tamamen bakteriyel stres yanıt-e doğru anlamak için önemli bir araç olacak.
E.coli rekombinant protein hızlı için yaygın olarak kullanılır ve türler arasında kodon kullanım farklılıkları nedeniyle bir sorun kez karşı karşıya9suboptimal ifadesidir. Bu ek tRNA rekombinant mRNA10çevirmek için gerekli ifade tarafından atlatılabilir. Böyle suşları seviyelerinde şarj tRNA ölçümleri sorun giderme çabaları rehberlik ve protein ifade en iyi duruma getirmek.
Bu yöntem, aynı zamanda "mischarging"; algılama sağlar Konağımız olmayan amino asit ile bir tRNA molekül aminoacylated. Farklı amino asitler tarafından Aminoacylation-polyacrylamide jeller1,11biraz farklı hızları ile geçirilecek bir tRNA neden olabilir. Bazı durumlarda, yöntem aynı zamanda aksi takdirde aynı tRNA3farklı değişiklik desenleri ayırt etmek için kullanılabilir.
Düzeyleri şarj tRNA incelenmesi olduğunu periodate için oksidasyon başka bir biyokimyasal yordamı kurdu. TRNA korunuyorsunuz aminoacylated periodate oksidasyon ve doldurulmamış tRNA değil gözlem yöntemi kullanır. Sonra tRNA şarj şarj düzeyleri hasat RNA'ın tahmin etmek için kullanılan oksidasyon tedavi periodate. Ancak, birkaç tRNA şarj böylece biraz yanlışlık12-mek şartıyla tedavi tarafından etkilendiği gösterilmiştir. Yöntem burada doğrudan saf RNA şarj, böylece herhangi bir önyargıları kimyasal veya enzimatik reaksiyonlar hariç önlemler sundu. Bu yöntemin bir sınırlama yalnızca bir o tRNA türler algılandığında bir zamanda, öylesine her ne kadar aynı Kuzey leke-ebilmek var soymak ve birden çok tRNA için reprobed zaman alan ve pek çok tRNA üzerinde veri toplamak biraz zahmetli olması.
Örnekleri birbirlerine normalleştirme için güvenilir bir yol hedefi farklı örnekler üzerindeki göreli bir molekül düzeyde karşılaştırmak için nerede çalışmalarda önemlidir. Burada küçük bir aliquot nadir tRNAselC overexpressing E. coli hücre içinde bir spike RNA arıtma önce deneysel örnekleri eklendiği RNA için normalleştirme işlemi tanıtmak. Bu yöntem sadece tRNA incelerken ama RNA'ın herhangi bir türün göreli miktar için deneysel Kur öyle ki hiçbir endojen RNA olmak güvenilir olabilir ne zaman tüm örnekleri aynı hücresel konsantrasyon mevcut yararlı olur. Örneğin, göreli miktarları arasında farklı başka bir RNA'ın karşılaştırmak için endojen bir başvuru13örnekleri gibi bir "temizlik" RNA gibi ribozomal RNA düzeyini kez kullanılır. Ama örnekleme bir stres yanıt15,16,17 veya sırasında oluşursa ribozomal RNA için durum olabilir gibi bu küçük kullanımı başvuru RNA hücresel konsantrasyonu örnekleri arasında değişir durağan faz17girmesinden. Spike hücreler RNA arıtma önce deneysel örnekleri için ek normalleştirme örnekleme kurulumunu bağımsız sağlam ve doğru bir yol sağlar. Başka bir belirli bir veya daha fazla spike içinde RNA'ların deneysel örnekleri eklenmesinden sonra RNA arınma yoludur. Ancak, bu yöntem için RNA kurtarma farklılıklarını örnekler arasındaki hesap değil.
E. coli hücreleri kullanarak bir deneyde E. coli olarak (bkz: şekil 1) spike hücreler olarak RNA gönderme yapıyor bunun dezavantajı o overexpress Ayrıca eksojen E. coli az miktarda toplam RNA örnekleri. Biz bu ek için yalnızca spike hücreler (bkz. Şekil 2, lane "selC" etiketli leke Kuzey) deneysel örnekleri ile paralel olarak içeren bir örnek analiz ederek doğru. Sunulan protokolü E. coli K-12 için geliştirilmiş ancak çoğu bakteriyel türler için geçerli olması muhtemeldir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>Purity &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Serva</td>
			<td>79-06-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis (N,N&#39;-Methylene-bis-acrylamide)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108-95-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring Sperm DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100403-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P32 &#947;ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos (probes)</td>
			<td>TAG Copenhagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+ membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydridization oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger-M&#252;ller tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor imager screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) herhangi bir canlı translasyonel makinelerin önemli bir parçasıdır. tRNA bağlamak ve amino asitler için çeviri ribozom aktarın. Farklı tRNA göreli seviyeleri ve aminoacylated oranı tRNA toplam tRNA, şarj düzeyi olarak bilinen için doğruluk ve çeviri hızını belirlemede önemli faktörlerdir. Bu nedenle, bolluk ve şarj tRNA düzeyde protein sentezi, örneğin çeşitli stres koşullarında okurken ölçmek için önemli değişkenlerdir. Burada, tRNA hasat ve doğrudan göreli bereket ve Escherichia colibelirli tRNA türler mutlak şarj düzeyini ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. TRNA tRNA ve onun amino asit arasında değişken bağ korunmuş şekilde hasat edilir. RNA sonra Jel Elektroforez ve kurutma, ücret ve doldurulmamış tRNA ayrılması hangi sonuçlar Kuzey tabi tutulur. Normalleştirme spike hücreler ilavesi nedeniyle farklı örneklerinde belirli tRNA düzeyde karşılaştırılabilir. Önce RNA arıtma, her örnek için nadir tRNAselC yatırıma E. coli hücrelerinin % 5 ekleyin. Bir örnek ilgi tRNA tür miktarı o zaman tRNAselC aynı örnek miktarı için normalleştirilmiş. Ayrıca spike hücreler RNA arıtma önce Ayrıca hücre lizis verimliliği tüm farklılıkları örnekleri arasında için hesaplar arıtılmış spike bileşenini RNA'lar ek avantajı vardır.

Yordamı kullanarak burada, bereket ve üç tRNA düzeyde E. coli K-12 öncesi ve amino asit açlık sırasında ölçüldü şarj açıklanır.
Arginin auxotroph süzün NF9154 (thr Leyi onun argH thi mtl supE44) BEZLERİ en az orta % 0,4 gliserol, 50 µg/mL treonin, lösin, arginin ve 5 µg/mL histidin, sallayarak 37 ° C'de ile takıma en az on nesiller için yetiştirilen oldu 160 d/...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli at JoVE.com

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Burada doğrudan transfer RNA transfer RNA'ın göreli düzeyleri, ya da herhangi bir kısa diğer RNA, spike-in toplama göre farklı örnekleri arasında karşılaştırmak için bir yol yanı sıra arıtılmış Escherichia coli RNA düzeyleri şarj ölçmek için bir yöntem mevcut hücre başvurusu gen ifade.

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Escherichia coli içinde Viroid kaynaklı bir sistemi kullanarak dairesel bir iskele üzerinde rekombinant RNA'ların büyük ölçekli üretim

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Dairesel RNA'ları Analiz Etmek Için Minigen İçeren Alu Elementin Kullanımı

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Hücre ve Dokularda Koenzim A'nın Sayısallaştırılması

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Escherichia coli'de Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Nükleozom Rekonses için Histonların Siteye Özgü Lizin Asetilasyonu

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...