Name: creation of a dense transposon insertion library using bacterial conjugation in enterobacterial strains such as escherichia coli or shigella flexneri
Uploaded: 2017-09-23T14:00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri at JoVE.

ジョージ教会ラボ pJA1 プラスミドの種類のギフトのために感謝します。感謝ファビエンヌ ハンバーガーと Urs Jenal 研究室からアレックス ベーム バーゼル Biozentrum で細菌の活用でについて、BW20767 株を提供するため。また有用な編集のオリン Silander に感謝します。この研究のための資金は、バーゼル、スイス連邦共和国の大学にニュージーランドのマッセイ大学とシステム生物学 (プロジェクト"戦い X"Dirk Bumann に授与) のスイスの取り組みからの資金によって提供されました。

注意: S. 菌 を使用すると、受信者のひずみとして場合、s. 菌 が胃腸の病気を引き起こす可能性が人間の病原体であることに注意してください。適切なバイオ セーフティ対策 (ヨーロッパおよび米国の BSL 2 またはニュージーランドで PC2 を指定) と 米菌 を含む実験を行う必要があります。このプロトコルに関連付けられているビデオのすべての実験が行われた非病原性 大腸菌 のよ特徴付けられた受信者ひずみを用いた MG1655 PC1 の設定で。赤痢菌 と以前行ったバーゼル, Biozentrum BSL 2 研究室の 6 で説明した。
 注: 2 回効果的に次の実験を行っています。(ステップ 1.1-ステップ 4.5) の最初の部分は、めっき用最高希釈を見つける目標が与えるプレートあたりの多くの個々 のコロニーが多く活用の希釈に芝生フォームを見つけるには、ライブラリに実行されます。これは、大幅に削減できるフィットネスの突然変異体とより堅牢なフィットネスとのそれら間の競争を減らすことです。(手順 5.1 7.4) の 2 番目の部分は、多くのプレートは、ライブラリの適切な希釈に広がっている最後のライブラリの作成。
 1。 に準備 1 日事前実験する <ol><li>Inoculate、冷凍在庫、流体培養基 LB の 2 mL でドナーのひずみからミラーズ レシピ (10 g/L の NaCl) メディア 100 μ g/mL にアンピシリンを含みます。ここで使用されるドナーひずみは 大腸菌 BW20767 15 pJA1 プラスミド 11 をかくまっています。アンピシリンの使用 pJA1 のプラスミッドのための選択を保持します</li>。
	<li>単一コロニーや冷凍ストック以外、かカナマイシン、アンピシリン抵抗性マーカーと LB 媒体の 2 mL で受信者のひずみからの Inoculate。ここで使用される受信者のひずみは 大腸菌 &#34; 野生型 &#34; ナリジクス酸に対する自然抵抗性変異株による MG1655 17 , 18 のひずみ。それは 30 μ g/mL ナリジクス酸で栽培されています</li>。
	<li>(90 mM シャーレ、約 12.5 mL) で準備 20 ルリアスープ含む 1.5% 寒天版。抗生物質を欠けている寒天を使用するまで数ヶ月の 4 ° C で保存ことができます</li>。
	<li>(90 mM シャーレ、約 12.5 mL) で準備 20 ルリアスープ含む 1.5% 寒天版両方 30 μ G/ml でナリジクス酸で 50 μ g/mL (LBA Nal30 Kan50) カナマイシンを含みます。抗生物質を含む寒天を使用するまで数ヶ月の 4 ° C で暗闇の中で保存ことができます</li>。
	<li>は、200 mL 滅菌 LB 媒体を準備します。LB メディアが数ヶ月常温で保存できます</li>。
	<li>メーカーによると 1 mL 100 mM の IPTG、滅菌在庫を準備 &#39; の指示</li>。
</ol> 2。細菌の交配や共役 室温で <ol><li>1 分 14,000 x のためのドナーのひずみの一晩文化の遠心 1 mL g。成長媒体を破棄します。抗生物質を含むすべての成長媒体を削除するこの手順を実行します</li>。
	<li>文化を集中の LB (抗生物質を含まない)、110 μ L に細胞ペレットを再懸濁します</li>。
	<li>使用して滅菌鉗子位置滅菌硝酸セルロース フィルター (または滅菌一枚のあぶらとり紙は使用できますが、資料を参照してくださいリスト) (抗生物質を含まない) LBA プレートの真ん中に。ラベル プレート &#34; ネガティブ コントロール: ドナー &#34;.</li>
	<li>フィルター上に濃縮されたドナー文化の 50 μ L をドロップ、ピペットを使用しています</li>。
	<li>手順 2.1-4 受信者のひずみのプレートをラベル付け &#34; ネガティブ コントロール: 受信者 &#34;</li>。
	<li>ライブラリの (これらのプレートが抗生物質を含めないでください) LBA プレートに 1 つの滅菌フィルターに (ステップ 2.5) から受信者負担の (手順 2.2) からドナーと 50 μ L の 50 μ L をドロップします。このプレートをラベル &#34; ライブラリ &#34; 交配が発生するためドナーと受信者フィルターに近く物理的な接触で</li>。
	<li>6 h の 37 ° C でフィルターを含む寒天プレートを配置</li>
</ol> 3。PJA1、トランスポザーゼの IPTG 誘導によるトランスポゾンの活性化 <ol><li>準備 3 15 mL コニカル バイアル 1 mM (すなわち IPTG の 100 mM の在庫の 20 μ L) の最終的な集中に IPTG と LB の 2 mL を含みます。それぞれのラベル: ドナー管理、受信者コントロールおよびライブラリ</li>。
	<li>は、(ステップ 2.4) から 37 ° C で成長の 6 h 後インキュベーターからプレートを削除します。いくつかの細菌の増殖は、フィルター上に表示する必要があります</li>。
	<li>使用滅菌鉗子は、ドナー管理からろ紙を削除し、15 mL コニカル バイアル (ステップ 3.1) からドナー コントロールをラベルに配置。受信者コントロールとライブラリの同じ操作を行います</li>。
	<li>15 mL コニカル バイアルの底にろ紙を取得し、ポンドに完全に浸漬を確保する管をタップ</li>
	<li>渦管を完全な少なくとも分高硝酸セルロース フィルターから細菌の関連付けを解除します。LB は細菌細胞 ( 図 2) と曇りになります</li>。
	<li>というラベルの付いた LBA Nal30 Kan50 プレートの上にドナーの管理から vortexed 細菌懸濁液 200 μ L をプレート滅菌ガラス ビーズまたは滅菌スプレッダーを使用して &#34; ドナー管理、200 μ L &#34; です</li>。
	<li>プレートをラベリング、受信者コントロールについて (3.6) 上記手順を繰り返します &#34; 受信者コントロール、200 μ L &#34; です</li>。
	<li>プレートをラベリング ライブラリに (3.7) 上記手順を繰り返します &#34; ライブラリ、200 μ L &#34; です</li>。
	<li>(すなわち 1:5、1:10 と 1: 100 希釈液、希釈剤として抗生物質を含まない LB を使用して) 追加の希薄を作るライブラリの。適切なラベル LBA Nal30 Kan50 プレートをプレート 200 μ l の原液ライブラリおよび追加希薄にします</li>。
	フィットネスの大規模な損失を引き起こす遺伝子に挿入されたトランスポゾンと 18 h のクローンの <li>37 ° C に場所プレート インキュベーターは成長し、プレート上に表示に時間がかかります。コロニーのサイズ ( 図 3) の様々 な必要があります。ドナーと受信者のひずみプレートはありませんそれらのコロニーです</li>。
</ol> 4。最終的な突然変異体のライブラリに使用するライブラリの適切な希釈を選択 <ol><li>を決定するさまざまなサイズの多くの植民地をもたらすステップ 3.9 からライブラリの希釈の間隔は十分に。目的は、植民地が互いにマージし、リソースの競合として 1 つの皿の上可能ですが、あまりに多くの植民地を得ることです。この番号は、プレート当たり約 500-2,000 の植民地をする必要があります。皿の上の適切なコロニーの密度の例は 図 3 に示す.</li>
	<li>版のコロニーの数を記録します</li>。
	<li>共役 (受信者の細胞 1 個あたりの conjugants 数) の周波数を計算します。これは 1 x 10 -6 19 1 x 10 -4 の範囲にする必要があります</li>。
	<li>は、ダウン ストリーム アプリケーションに基づいて最終的なライブラリで必要な突然変異体の数を決定します。多くのユーザーは単に可能な限りとして多くのミュータントとライブラリを必要と。可能な理論としての多くトランスポゾン挿入を生成する (1 つ挿入すべての塩基対)、おおよその目的ly (すなわち、エシェリヒア属大腸菌 の ~4.5 x 10 6) ゲノムの塩基対と同じ数のコロニーのすべての可能なトランスポゾン挿入でゲノムを完全に飽和します。それは、エッセンシャルで挿入を抱いて多くの突然変異体に注意してくださいすることが重要または機能的に重要な遺伝子はこれらの突然変異は受信者に致命的になるよう、回復することができません</li>。
	<li>は、最初のライブラリの容量がどの程度が希望するサイズのライブラリを作成する必要を計算します。たとえば、目的のライブラリのサイズは 5 × 10 4 変異体です。ステップ 3.9 からコロニーの最も適した間隔で希釈された 200 μ L、1:10 の希釈。このプレートのコロニーの数は、約 2,000 のコロニーをすると推定されます。5 × 10 4 変異体が必要し各プレートは 2,000 の植民地なら 25 枚この希釈に必要になります</li>。
</ol> 5。最終的な突然変異体ライブラリの作成 <ol><li>手順 1 から 3.8 (手順 4.4 参照) を必要に応じて手順 1.4 で板の数を調整します</li>。
	<li>3.9 のステップで目的のサイズのライブラリを作成する必要に応じて、できるだけ多くのプレートの上に 4.1 で希釈をプレート (手順 4.4 参照).</li>
</ol> 6。ライブラリ密度推定 <ol><li>プレートあたりどのように多くのコロニーをカウントし、それによってライブラリがどのように高密度の大まかな見積もりを得る。たとえば: 2 x 10 5 植民地の合計はメッキします。大腸菌 MG1655 ゲノムは約 4.5 × 10 6 塩基対です。したがって、約 2 × 10 5 ライブラリを挿入、挿入 の平均 があることを意味すべての 22 の塩基対と、約 1 × 10 の 3 塩基対の各遺伝子必要があります変更約 45 倍、その 1 つの遺伝子を与えられました。必須遺伝子の挿入がこのライブラリの非常に過小評価する可能性があります、したがって非必須遺伝子の密度がこれよりも大きくなる可能性が。この種の計算はトランスポゾン密度の広範な見積もりとの 1 つを提供します</li>。
</ol> 7。トランスポゾン ライブラリおよびストレージ プール <ol><li>コロニーを数え、ライブラリ プレートに LB (または必要に応じてなど) の 1 つの mL を追加し、プレートから細菌をこすり落とすため滅菌の拡散機を使用します。細菌懸濁液を除去し、50 mL と 15 mL コニカル バイアルに置き。すべての版の繰り返し</li>。
	<li>渦完全な分のプールされた細菌懸濁液懸濁液を均一にします</li>。
	<li>最終濃度 20% に滅菌グリセリンを追加。
	<ol><li>簡単再成長のための 0.25 mL 管 100 x 20 μ 因数を準備します</li>。
		<li>少なくとも 2 つ以上クリオバイアルで分注 1 mL を準備します</li>。
	</ol></li> <li>-80 ° C ですべての因数を保存</li></ol>

<ol>
	<li>Camacho, L. R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B., Guilhot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+virulence+gene+cluster+of+Mycobacterium+tuberculosis+by+signature-tagged+transposon+mutagenesis.">Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis.</a> Mol Microbiol. 34 (2), 257-267 (1999).</li><li>Hensel, M., Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M. D., Dalton, E., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+bacterial+virulence+genes+by+negative+selection.">Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection.</a> Science. 269 (5222), 400-403 (1995).</li><li>Glass, J. I., Assad-Garcia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+genes+of+a+minimal+bacterium.">Essential genes of a minimal bacterium.</a> PNAS. 103 (2), 425-430 (2006).</li><li>Salama, N. R., Shepherd, B., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+transposon+mutagenesis+and+essential+gene+analysis+of+Helicobacter+pylori.">Global transposon mutagenesis and essential gene analysis of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 186 (23), 7926-7935 (2004).</li><li>Akerley, B. J., Rubin, E. J., Camilli, A., Lampe, D. J., Robertson, H. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+essential+genes+by+in+vitro+mariner+mutagenesis.">Systematic identification of essential genes by in vitro mariner mutagenesis.</a> PNAS. 95 (15), 8927-8932 (1998).</li><li>Freed, N. E., Bumann, D., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Shigella+Tn-seq+data+with+gold-standard+E.+coli+gene+deletion+data+suggests+rare+transitions+between+essential+and+non-essential+gene+functionality.">Combining Shigella Tn-seq data with gold-standard E. coli gene deletion data suggests rare transitions between essential and non-essential gene functionality.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 1-14 (2016).</li><li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn-seq:+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms.">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nature Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li><li>Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+assay+of+every+Salmonella+Typhi+gene+using+one+million+transposon+mutants.">Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants.</a> Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).</li><li>Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+insertion+mutants+within+libraries+by+deep+sequencing+and+a+genome-wide+screen+for+Haemophilus+genes+required+in+the+lung.">Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung.</a> PNAS. 106 (38), 16422-16427 (2009).</li><li>Chan, K., Kim, C. C., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+detection+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+transposon+mutants+that+cannot+survive+in+macrophages+and+mice.">Microarray-based detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium transposon mutants that cannot survive in macrophages and mice.</a> Infect and Immun. 73 (9), 5438-5449 (2005).</li><li>Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays.">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li><li>Bender, J., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IS10+transposase+mutations+that+specifically+alter+target+site+recognition.">IS10 transposase mutations that specifically alter target site recognition.</a> The EMBO Journal. 11 (2), 741-750 (1992).</li><li>Shafferman, A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+properties+of+the+beta+origin+of+replication+of+plasmid+R6K.">Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K.</a> J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).</li><li>Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+assay+of+every+Salmonella+Typhi+gene+using+one+million+transposon+mutants.">Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants.</a> Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).</li><li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Daniels, L. L., Kim, S. K., Haldimann, A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+replicative+and+conjugative+plasmids+carrying+lacZ+alpha+for+cloning,+mutagenesis,+and+allele+replacement+in+bacteria.">Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria.</a> Plasmid. 35 (1), 1-13 (1996).</li><li>Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays.">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li><li>Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Sex-factor-affinity+Site+in+E.+coli+as+&#947;&#948;.">Identification of a Sex-factor-affinity Site in E. coli as &#947;&#948;.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45, 135-140 (1981).</li><li>Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Genome+Sequence+of+Escherichia+coli+K-12.">The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li><li>Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn10+transposon+derivatives+for+insertion+mutagenesis+and+gene+delivery+into+the+chromosome+of+gram-negative+bacteria.">Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.</a> Gene. 160 (1), 59-62 (1995).</li><li>Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+construction+of+pir++Enterobacterial+hosts+for+maintenance+of+R6K+replicon+plasmids.">A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids.</a> BMC Res Notes. 5 (1), 157 (2012).</li><li>Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+and+adaptation+in+a+long-term+experiment+with+Escherichia+coli.">Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.</a> Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).</li><li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).</li><li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li></ol>

著者は、何を開示します。

ここで説明されているプロトコルは、密なカーソル ライブラリの構築のためことができます。このメソッドは、以上 2 x 105ユニークなトランスポゾン変異体文化ボリューム6の 5 mL を用いた下をトランスポゾン ライブラリの作成できます。比較的簡単に実行し、最も基本的な微生物学実験室で使用可能な試薬を使用しは拡張性が高く、高価な機器やエレクトロポレーション キュヴェットなど消耗品の方法で少しを必要とします。
この方法の重要な利点は、ユーザーは理論的には、腸内細菌の受信者菌株の選択の広い緯度を持っている、です。これは紙、だけでなく、他の11、pJA1 プラスミドは赤痢菌6とサルモネラなど他の腸内細菌の受信者の種で正常に使用されていますが、受信者のひずみとしてエシェリヒア属大腸菌を使用型ネズミチフス菌ひずみ SL134410。理論的には、pJA1 の複製 (織R6Kγ) γ 起源により、広いホストの範囲19、受信者の歪みであることができますで維持されるこのプラスミドpir +.最近では、 pir +腸内細菌株の20、さらなる柔軟性を与える範囲での構築を可能にする新しい方法を記載されています。また、pJA1 の RP4 プラスミッドから300 塩基対暴徒地域は、グラム陰性細菌系統19の広い範囲にこのプラスミドの伝達できます。簡単に言えば、このメソッド理論で使用できる受信者の系統の様々 ないくつかの条件が満たされている限り: ひずみはpir+、抗生物質カナマイシン以外とドナーの負担以外にマークされています。
プロトコルの重要なステップは、適切な手順 4.1 うち板に細胞数の推定であります。植民地はあまりにも密接に間隔が、彼らはプレート上の栄養素を競うその少ないフィットの変異体が outcompeted。これは変異体の合計数の削減につながる可能性があります。また場合植民地の間隔が離れすぎて、板上には、あまりにも少数のコロニーがあるし、寒天の大規模なライブラリを達成するために必要な数の合計が負担になります。したがって、プレートあたりのコロニー数の面で適切なバランスを達成することは重要です。
手順は、説明されているように作業していることを確認するためのプロトコルのコントロールを行うことが重要です。特に、ドナー株に対するカウンター選択としてナリジクス酸を使用する場合、負ドナー制御板、コロニーの自由を確保することが重要です。これは、ナリジクス酸、偽陽性を降伏へ自然の抵抗率が低い (約 1 × 10-10)21があるためにです。通常、抱合と転位の速度は約 2 × 10-4 19です。したがって、抱合と転位の速度は桁違いナリジクス酸に対する自然抵抗性の率よりも大きいです。したがって、真の転位のイベントと比較して、偽陽性の率は非常に低く、プロトコルを使用する場合、無視できるとみなされます。ただし場合活用または転位の料金を大幅に削減 (効率が低いため交尾や IPTG とトランスポザーゼの遺伝子の誘導の欠如) から、プロトコルがスケール アップし、偽陽性の数を補うために (のクローンを作成します。トランスポゾンの挿入はありません) も増加します。
ステップ 3.2 および 3.10 でインキュベーション時間をいくつかの変更が可能です。6 h の共役が発生する 3.2 状態が、私たちの経験ではこの時間ステップをすることができます結果を著しく変更することがなく (すなわち4-7 h) に変化します。さらに、ステップ 3.10 で植民地に寒天版で孵化する時間の長さも調整できます。これは、受信者のひずみの時間または成長率の 2 倍の平均によって変えることができます。さらに、私たちの経験では 18 h は多様なフィットネスのライブラリを示すコロニー サイズの様々 なをもたらした。ただし、非常に減らされたフィットネスと共に植民地成長に時間がかかることがあります、したがってが表示されない後 18 時間。非常に減らされたフィットネスの複製を検索するこのメソッドを使用している場合は、インキュベーション時間が長くなると (すなわち、48 h、50-300 コロニー) の混雑を減らすためにプレートの少ない植民地が使用可能性があります。
このメソッドの追加の落とし穴がありますそれはカナマイシン耐性の既に受信者ひずみを使用することは不可能です。このハードルを克服するためにクロロアムフェニ コールの抵抗など、代替の選択可能なマーカーの pJA1 プラスミドのカナマイシン耐性マーカーを交換することがあります。、理論的には、アンピシリン耐性のある受信者のひずみを使用することは注目に値することもあります、、pJA1 としてアンピシリン抵抗性マーカーを含んでいるプラスミッドが転位の直後に失われます。
好みの遺伝的背景の緻密なトランスポゾン ライブラリの作成は、多くのダウン ストリーム アプリケーションで潜在的有利です。たとえば、スレオ レプリカ メッキ22を使用してを識別するか、感染1,2の確立で欠陥がある変異体を識別するためには、密なトランスポゾン ライブラリを使用できます。もっと最近、DNA シーケンシング コストを落としているし、次世代シーケンシングなどの新しい技術となっている平凡なトランスポゾン ライブラリで使用されている深い DNA シーケンシング遺伝子かんじん、遺伝子の働きに洞察力を得るためにおよび遺伝相互作用。これらのメソッドのいくつかは23で見直され、監督のトランスポゾンの挿入サイト シーケンス (TraDIS)、トランスポゾン配列 (Tn seq)、ディープ シーケンス (安打)、し挿入配列 (追跡高スループットの挿入などの方法があります。INSeq)。これらのすべてのダウン ストリーム メソッドは、密なトランスポゾン挿入ライブラリの構造に依存します。他のベクトルは、特定のダウン ストリーム メソッドの使用する必要があります、ここで説明されているプロトコルは従う手順要点の概要を示します。

細菌性病原体1、2、病原性遺伝子の発見から必須遺伝子3,の研究に至るまで、アプリケーションのさまざまな役に細菌トランスポゾン変異ライブラリの作成4,5,6、遺伝的相互作用の同定には、7、8,9 をネットワークします。これらの研究に重要なは、変異体の大規模なライブラリを作成する能力です。トランスポゾン (短い断片 DNA のゲノムにランダムに挿入する) の使用は、関数または式、開いたリーディング ・ フレームまたは遺伝子の転写調節領域内でトランスポゾンの挿入は中断しばしば遺伝子機能を中断することの簡単な手段遺伝子。
プラスミド pJA110を使用して細菌の活用によるエシェリヒア属大腸菌またはs. 菌でトランスポゾン ライブラリの作成方法は、ここで説明しました。このプラスミドを使用する 2 つの主な利点があります。最初の利点は pJA1 プラスミドから表現 Tn10 トランスポザーゼのバリアント誘導性があり、低挿入バイアス11,12, トランスポゾンがゲノムに統合するランダムにことを意味するときイソプロピルΒ-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) は、メディアに追加されます。トランスポゾンには、受信者の株の染色体にトランスポゾン挿入変異体の選択できるカナマイシン耐性マーカーが含まれています。PJA1 プラスミドの 2 番目の利点は、レプリケーションの R6K 変異原点が含まれていることです。レプリケーションの R6K 変異起源13プラスミドの維持のための順序でラムダのpirの遺伝子が必要です。プラスミッドをpir -系統でレプリケートできませんとは、受信者の負担 (図 1) で失われます。これにより Tn10 トランスポザーゼがセルから削除されます、アクティブ、初期転位イベント後さらに突然変異を減らすにはや。
ドナーの負担から受信者のひずみに pJA1 プラスミドを移動する細菌の活用の使用は、いくつかの理由のため有利です。抱合はシンプルで安価を実行して、遺伝子導入装置などの特別な機器を必要としません。さらに、細菌の活用高効率は、非常に大規模なライブラリ (&#62; 2 × 105ユニークな挿入) 一晩培養6のわずか数ミリリットル (mL) を達成します。プロセスには、約 2 時間の孵化のため時間とともに実践的な時間と菌の増殖がかかります。ラングリッジら14サイズのトランスポゾン変異ライブラリのような作成する 130 electroporations の実行を報告はここで説明8単一接合を実現します。130 electroporations の使用は、electrocompetent セルの労働集約的な時間のかかる準備と消耗品だけでの以上 $1,000 ドルのコストで多くの高価な材料 (例えば、エレクトロポレーション キュヴェット) の使用に必要です。10その他の研究は、同様のメソッドを使用しているが、異なる菌株と達成までライブラリ (5 × 104コロニー形成単位) よりも小さなサイズはここで報告されます。
ドナーひずみに関するノート: ここで使用されるドナーひずみは大腸菌の菌株 BW2076715 pJA1 トランスポゾン プラスミド16を含みます。ひずみ BW20767 は、pJA1 プラスミドの伝達を効率的に作成他系統に共役することができます。また、重要なは、BW20767 はラムダpir +.前述したように、プラスミド pJA1、ラムダpir遺伝子を含んでいる系統で維持することができるのみ。この株は、カナマイシン、アンピシリン耐性。PJA1 プラスミドはアンピシリン抵抗性マーカーを含み、トランスポゾン内カナマイシン耐性マーカーにあります。この株は、100 μ g/mL にアンピシリンを使用してプラスミッドの選択で栽培されています。それはまた恒常発現トランスポザーゼの遺伝子の他の系統が安定するため知られていることは注目に値するとトランスポザーゼ使用中ここは下誘導制御、漏れやすい表現の低リスクが残っています。このため、このひずみの通路を最小限にし各の新しいライブラリの準備のため冷凍文化から新鮮なストリークをすべきであることをお勧めします。ここで使用されるドナー株はリクエストに応じて研究室から入手可能です。
受信者ひずみに関するノート: 受信者のひずみは、ラボの K12 由来大腸菌の系統や系統のS.flexneri (また、議論を参照) などの任意のひずみをすることができます.受信者のひずみがカナマイシン抵抗がない追加の抗生物質耐性マーカーに対して選択できるドナーの負担が必要です。受信者のひずみ大腸菌 MG1655が導入された自発的なナリジクス酸突然変異とここで使用されます。ナリジクス酸の自然突然変異は、30 μ G/ml でナリジクス酸を含むプレートの上に 200 μ L 因数で一晩かけて培養の 2 mL をめっきによって選ばれました。MG1655 の単一のクローンは、受信者の負担になるナリジクス酸に耐性が選ばれました。さらに、前述のよう、受信者のひずみのラムダpir 、否定的な必要があります。
概要: 細菌の活用が行われると pJA1 プラスミドは受信者のひずみにドナーの負担から移動して、メディアに IPTG の添加を誘発する IPTG 誘導の制御下にあるtnp遺伝子の発現lacIq/Ptac プロモーター (図 1)。PJA1 tnp遺伝子はホット スポット6,10,11の挿入の低い周波数を持つ変異トランスポザーゼ。また、IPTG 誘導トランスポゾンが活性化、ゲノムに挿入されたランダムに。プラスミッドはラムダの pir 受信者負担を確保できない、失われます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">0.45 micron nitrocellulose filters (sterile)</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">HAWP02500</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively blotting paper can be used (listed below)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:335px;">Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper</td>
			<td style="width:171px;">GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 &#215; 57 cm</td>
			<td>3030-917</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Metal Forceps, sterile</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>MURRE009/01</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume,&#160; 12.5 mL working volume.</td>
			<td style="width:171px;">Interlab New Zealand</td>
			<td>2303-1090</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:335px;">Sterile glass spreaders</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>NZNZSPREADER</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:335px;">Sterile glass beads</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>HERE1080603</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Nalidixic acid (optional)</td>
			<td style="width:171px;">GoldBio.com</td>
			<td style="width:119px;">N-015-250</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">Ampicillin sodium salt BioChemica</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>APLIA0839.0025</td>
			<td style="width:179px;">prepare according to manufacturer recommendation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Kanamycin sulfate BioChemica</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>APLIA1493.0010</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">IPTG (Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside)&#160;</td>
			<td>Thermofisher New Zealand</td>
			<td>FMTR0393</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">Difco Agar granulated</td>
			<td style="width:171px;">Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand</td>
			<td style="width:119px;">214530</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Luria Broth Base (Miller&#39;s LB Broth Base)</td>
			<td style="width:171px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">12795-084</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Glycerol bidistilled 99,5 %</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>VWRC24388.320</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">15 ml polypropelene sterile conical vials&#160;</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>CORN430791</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>AXYGMCT-175-C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td style="width:119px;">BDAA352070</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Equipment</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Incubator at 37C</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Autoclave for sterilizing media&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation of a dense transposon insertion library using bacterial conjugation in enterobacterial strains such as escherichia coli or shigella flexneri

トランスポゾン変異は、トランスポゾンと呼ばれる DNA の一部のランダムなゲノム挿入を介して遺伝子破壊を可能にする方法です。以下のプロトコルは、カナマイシン耐性マーカーを含むトランスポゾンを有するプラスミドの菌株間の高効率転送の方法をについて説明します。プラスミド媒介トランスポザーゼは、非常に低い挿入バイアスを持つ受信者株のゲノムのトランスポゾンの挿入するバリアントtnp遺伝子によってエンコードされます。このメソッドは、このように細菌エシェリヒア属大腸菌や赤痢菌の受信者の緊張でユニークなゲノム位置にトランスポゾンが挿入されて大規模な変異ライブラリの作成をできます。エレクトロポレーションや化学的変化など他の方法ではなく、細菌の活用を使用してユニークなクローンの数千人の何百もの大規模なライブラリを作成できます。これは非必須遺伝子のすべての 4-6 塩基として頻繁に発生する挿入と高密度挿入ライブラリを生成します。このメソッドは、密なトランスポゾン挿入ライブラリを作成するための安価な使いやすい、高効率法の他の方法より優れています。トランスポゾン遺伝子相互作用ネットワークを推測する (テネシー州-Seq) をシーケンスなどのダウン ストリーム アプリケーションでまたはもっと単に、突然変異で、トランスポゾン ライブラリを使用することができます (前方遺伝) 画面。

成長の 18 時間後のプレートはコロニー サイズの様々 な多くの植民地を含める必要があります(図 3)。異なるコロニー サイズさまざまなフィットネスのクローンを示すで、プロトコルが働いている良い兆候です。皿の上は成長ドナーとレシピエントのコントロール必要がありますありません。上記のプロトコルを使用すると、優に 2 x 10 の5のコロニー形成単位 (CFU) 得られるはず。一度に 5 複製活用するプロトコルをスケール アップ約 1 × 106 CFU をもたらす必要があります。前作、次世代シーケンシングによる分析が示されたこのようなスケール アップ ライブラリが得られる &#62; 2 × 105ユニークな挿入6。非常に高い CFU (すなわち1 x 106 CFU) でユニークな挿入の比率は、すべての利用可能な (非致命的な) 挿入になる表される高原、する予定です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig1.jpg"> 
図 1: 細菌の活用と染色体にトランスポゾンの挿入のスケマティック。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig2.jpg"> 
図 2: LB 媒体に水没してボルテックスの前後のフィルターのイメージ。ボルテックス前、に細胞はフィルターに立ち往生しているし、メディアが明確。ボルテックス後、としてセル フィルターから、メディアは、メディアが曇りになります。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig3.jpg"> 
図 3: (A) トランスポゾン ライブラリ成長の 18 時間後の代表的な板。(B) コロニー サイズのクローズ アップ。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri at JoVE.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

ここに提示は、大腸菌や赤痢菌細菌の活用を使用して高密度トランスポゾン挿入ライブラリを作成するための簡単な方法です。このプロトコルは、トランスポゾンのランダムなゲノム挿入による細菌のユニークな突然変異体の何千もの何百ものコレクションの作成をできます。

密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

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使用<em&gt;フレクスナー赤痢菌</em&gt;オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

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神経病原の非侵襲的モデル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;新生ラットにおける感染

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

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Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

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