Name: creation of a dense transposon insertion library using bacterial conjugation in enterobacterial strains such as escherichia coli or shigella flexneri
Uploaded: 2017-09-23T14:00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri at JoVE.

Jeg takker George kirken laboratoriet type gave pJA1 plasmider. Jeg takker Fabienne Hamburger og Alex Boehm fra Urs Jenal Lab på Biozentrum i Basel hjelp med bakteriell bøyning og for å gi BW20767 belastningen. Jeg takker også Olin Silander for nyttig redigeringer. Finansiering for denne forskningen ble levert av midler fra Massey University i New Zealand og den sveitsiske initiativ i Systems Biology (prosjekt "Battle X" tildelt Dirk Bumann) ved Universitetet i Basel, Sveits.

Advarsel: Hvis du bruker S. flexneri som en mottaker belastning, Vennligst merk at S. flexneri er en human patogen som kan føre til gastrointestinal sykdom. Eksperimenter med S. flexneri må utføres med passende biosikkerhet forholdsregler (betegnet BSL-2 i Europa og USA eller PC2 i New Zealand). Alle eksperimenter utført i videoen knyttet til denne protokollen ble gjort ved hjelp av godt karakterisert mottaker belastningen av ikke-patogene E. coli MG1655 i PC1 omgivelser. Arbeid med Shigella flexneri var tidligere utført i en BSL-2 lab på Biozentrum i Basel, som beskrevet i 6.
 Merk: følgende eksperimentet er effektivt gjort to ganger. Den første delen (trinn 1.1 - trinn 4.5) utføres for å finne den beste fortynning for plating ut biblioteket, der målet er å finne en fortynning av Bøyning som gir mange personlige kolonier per plate, men ikke så mange som en plen former. Dette er å redusere konkurransen mellom mutanter med reduserte fitness og de med mer robust fitness. Den andre delen (trinn 5.1-7.4) er etableringen av siste biblioteket, hvor mange plater er spredt på riktig fortynning av biblioteket.
 1. å forberede en dag før eksperimentet <ol><li>Inoculate, fra et frosne lager, donor belastningen i 2 mL LB kjøttkraft, Millers oppskrift (NaCl på 10 g/L) mediet som inneholder ampicillin på 100 µg/mL. Donor belastningen her er E. coli belastningen BW20767 15 skjuler pJA1 plasmider 11. Bruk av ampicillin opprettholder valg for pJA1 plasmider.</li>
	<li>Inoculate, fra en enkelt koloni eller frosne lager, mottaker belastningen i 2 mL av LB media med merketråd motstand enn ampicillin eller kanamycin. Mottaker belastningen her er E. coli &#34; wild type &#34; belastning MG1655 17 , 18 med en spontan motstand mutant til nalidixic acid. Økt 30 µg/mL nalidixic acid.</li>
	<li>Forberede 20 Luria buljong med 1,5% agar plater (i 90 mM petri retter, ca 12.5 mL). Agar plater mangler antibiotika kan lagres på 4 ° C i flere måneder før bruk.</li>
	<li>Forberede 20 Luria buljong med 1,5% agar plater (i 90 mM petri retter, ca 12.5 mL) som inneholder både nalidixic acid på 30 µg/mL og kanamycin på 50 µg/mL (LBA Nal30 Kan50). Agar plater som inneholder antibiotika kan lagres i mørket på 4 ° C i flere måneder før bruk.</li>
	<li>Forberede 200 mL steril LB media. LB media kan lagres ved romtemperatur månedene.</li>
	<li>Forberede 1 mL av 100 mM sterilt lager av IPTG, ifølge produsenten &#39; s instruksjoner.</li>
</ol> 2. Bakterielle Mating eller Bøyning <ol><li>sentrifuge 1 mL av natten kultur av donor belastningen i 1 minutt på 14.000 x g ved romtemperatur. Kast vekst medier. Dette trinnet er gjort for å fjerne alle vekst medier som inneholder antibiotika.</li>
	<li>Resuspend celle pellets til 110 µL av LB (ikke inneholder antibiotika), dermed konsentrere kulturen.</li>
	<li>Bruke sterilt tang, plassere et sterilt nitrocellulose-filter (alternativt et sterilt stykke blotting papir kan brukes, se materialer liste) på midten av en LBA plate (ikke inneholder antibiotika). Etiketten platen &#34; negativ kontroll: Donor &#34;.</li>
	<li>Bruker en pipette, slippe 50 µL av konsentrert donor kultur på filteret.</li>
	<li>Gjenta trinn 2.1-4 for mottakeren belastningen, merking platen &#34; negativ kontroll: mottakeren. &#34;</li>
	<li>For biblioteket, slippe 50 µL av donor (fra trinn 2.2) og 50 µL av mottakeren belastningen (fra trinn 2.5) på ett enkelt sterilt filter på en LBA plate (disse platene ikke skulle inneholder antibiotika). Merke denne platen &#34; biblioteket. &#34; Mating oppstår fordi giver og mottaker er nær fysisk kontakt på filteret.</li>
	<li>Plasser agar platene som inneholder filtrene ved 37 ° C i 6 h.</li>
</ol> 3. Aktivering av pJA1 Transposon av IPTG induksjon av Transposase <ol><li>forberede tre 15 mL konisk ampuller med 2 mL LB med IPTG i en endelig konsentrasjon av 1 mM (dvs., 20 µL av 100 mM lager av IPTG). Label hver: Donor kontroll, mottakeren kontroll og biblioteket.</li>
	<li>Fjern platene settefiskanlegg etter 6 h vekst på 37 ° C (fra trinn 2.4). Noen bakterievekst skal være synlig på filteret.</li>
	<li>Bruke sterilt tang, Fjern filter papir fra donor kontrollen og plasserer den i 15 mL konisk ampullen merket Donor kontroll (fra trinn 3.1). Gjøre det samme for mottakeren kontroll og biblioteket.</li>
	<li>Trykk rørene får filter papiret til bunnen av 15 mL konisk ampullen og sikre at det er fullstendig neddykket i pund</li>
	<li>Vortex rør for minst en full minutt høye å fjerne bakterier fra nitrocellulose filteret. LB bør bli skyet med bakterielle celler ( figur 2).</li>
	<li>Bruker sterilt glassperler eller en steril sprederen, plate 200 µL av vortexed bakterier suspensjon fra donor kontrollen på LBA Nal30 Kan50 plater merket &#34; Donor kontroll, 200 µL &#34;.</li>
	<li>Gjenta trinnet ovenfor (3,6) for kontrollen mottaker, merking platene &#34; mottakeren kontroll, 200 µL &#34;.</li>
	<li>Gjenta trinnet ovenfor (3.7) for biblioteket, merking platene &#34; bibliotek, 200 µL &#34;.</li>
	<li>Gjøre flere fortynninger (dvs., 1:5, 1:10 og 1: 100 fortynninger, bruker LB ikke inneholder antibiotika som en fortynner) av biblioteket. Plate 200 µl av ufortynnet bibliotek og flere fortynninger på riktig merket LBA Nal30 Kan50 plater.</li>
	<li>Sted platene i 37 ° C inkubator for 18 h. kloner med transposons settes inn i et gen som fører til store tap fitness kan ta lengre tid å vokse og vises på tallerkenen. Det bør være en rekke kolonien størrelser ( Figur 3). Giver og mottaker belastning plater må ingen kolonier på dem.</li>
</ol> 4. Velg den aktuelle fortynning av biblioteket skal brukes for siste Mutant biblioteket <ol><li>fastslå en fortynning av biblioteket fra trinn 3.9 som gir mange kolonier av varierende størrelse som fordeles tilstrekkelig. Målet er å få så mange koloniene som mulig på én plate, men ikke så mange at koloniene flette inn i hverandre og konkurrerer om ressurser. Dette nummeret skal være ca 500-2000 kolonier per plate. Et eksempel på riktig tettheter på en plate er vist i Figur 3.</li>
	<li>Registrere antall kolonier på platene.</li>
	<li>Beregner antallet Bøyning (antall conjugants per mottaker celle). Dette bør være i området fra 1 x 10 -4 til 1 x 10 -6 19.</li>
	<li>Bestemmer hvor mange mutanter ønsket i siste biblioteket basert på nedstrøms programmer. Mange brukere krever bare et bibliotek med så mange mutanter som mulig. Generere så mange transposon innsettinger som teoretisk mulig (en innsetting hver base-par), mål for omtrentligly samme antall kolonier som base parene i genom (dvs., ~4.5 x 10 6 for E. coli) å fullt mette genomet med alle mulige transposon innsettinger. Det er viktig å merke seg mange mutanter skjuler innsettinger i viktige eller funksjonelt viktig gener ikke kan gjenopprettes, som disse mutasjonene vil være fatalt for mottakeren.</li>
	<li>Beregner hvor mye volum av første biblioteket er nødvendig for å opprette et bibliotek med ønsket størrelse. For eksempel er ønsket biblioteket størrelse 5 x 10 4 mutanter. Fortynning med beste avstanden kolonier fra trinn 3.9 var 200 µL av en 1:10 fortynning. Antall kolonier på denne platen er anslått til ca 2000 kolonier. Hvis 5 x 10 4 mutanter er nødvendig og hver plate har 2000 kolonier, så 25 plater vil være nødvendig på dette fortynning.</li>
</ol> 5. Etableringen av siste Mutant biblioteket <ol><li>Gjenta trinn 1 til 3.8, justere antall plater på trinn 1.4 etter behov (se trinn 4.4).</li>
	<li>På trinnet 3.9 plate fortynning valgt i trinn 4.1 på så mange plater som kreves for å opprette biblioteket av ønsket størrelse (se trinn 4.4).</li>
</ol> 6. Beregne biblioteket tetthet <ol><li>teller hvor mange koloniene det er per plate, og dermed få et grovt overslag over hvor tett biblioteket er. For eksempel: totalt 2 x 10 5 koloniene er belagt. E. coli MG1655 genomet er ca 4.5 x 10 6 base parene. Derfor et bibliotek med ca 2 x 10 5 setter betyr at det er en sett inn gjennomsnittlig hver 22 base parene, og at hver genet bør være mutert ca 45 ganger, gitt Vigeland er ca 1 x 10 3 base parene. Innsettinger i viktige gener er trolig bli svært underrepresentert i dette biblioteket, og dermed tettheten i uvesentlig gener er sannsynlig å være større enn dette. Denne typen beregning gir en med en bred anslag av transposon tetthet.</li>
</ol> 7. Samle Transposon bibliotek og lagring <ol><li>etter teller kolonier, legge 1 mL av LB (eller mer, som nødvendig) til biblioteket plate og bruke en steril sprederen for å skrape av bakterier fra platen. Fjern bakteriell suspensjon og plasser i en 50 mL eller 15 mL konisk hetteglass. Gjenta for alle plater.</li>
	<li>Vortex gruppert bakterier suspensjon litt full til homogenize suspensjon.</li>
	<li>Legge til sterilt glyserol en siste konsentrasjon på 20%.
	<ol><li>Forberede 100 x 20 µL dele i 0,25 mL rør lett ettervekst.</li>
		<li>Forberede minst to eller flere 1 mL aliquot i cryovials.</li>
	</ol></li> <li>Lagre alle dele ved-80 ° C</li></ol>

<ol>
	<li>Camacho, L. R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B., Guilhot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+virulence+gene+cluster+of+Mycobacterium+tuberculosis+by+signature-tagged+transposon+mutagenesis.">Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis.</a> Mol Microbiol. 34 (2), 257-267 (1999).</li><li>Hensel, M., Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M. D., Dalton, E., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+bacterial+virulence+genes+by+negative+selection.">Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection.</a> Science. 269 (5222), 400-403 (1995).</li><li>Glass, J. I., Assad-Garcia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+genes+of+a+minimal+bacterium.">Essential genes of a minimal bacterium.</a> PNAS. 103 (2), 425-430 (2006).</li><li>Salama, N. R., Shepherd, B., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+transposon+mutagenesis+and+essential+gene+analysis+of+Helicobacter+pylori.">Global transposon mutagenesis and essential gene analysis of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 186 (23), 7926-7935 (2004).</li><li>Akerley, B. J., Rubin, E. J., Camilli, A., Lampe, D. J., Robertson, H. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+essential+genes+by+in+vitro+mariner+mutagenesis.">Systematic identification of essential genes by in vitro mariner mutagenesis.</a> PNAS. 95 (15), 8927-8932 (1998).</li><li>Freed, N. E., Bumann, D., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Shigella+Tn-seq+data+with+gold-standard+E.+coli+gene+deletion+data+suggests+rare+transitions+between+essential+and+non-essential+gene+functionality.">Combining Shigella Tn-seq data with gold-standard E. coli gene deletion data suggests rare transitions between essential and non-essential gene functionality.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 1-14 (2016).</li><li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn-seq:+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms.">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nature Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li><li>Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+assay+of+every+Salmonella+Typhi+gene+using+one+million+transposon+mutants.">Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants.</a> Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).</li><li>Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+insertion+mutants+within+libraries+by+deep+sequencing+and+a+genome-wide+screen+for+Haemophilus+genes+required+in+the+lung.">Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung.</a> PNAS. 106 (38), 16422-16427 (2009).</li><li>Chan, K., Kim, C. C., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+detection+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+transposon+mutants+that+cannot+survive+in+macrophages+and+mice.">Microarray-based detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium transposon mutants that cannot survive in macrophages and mice.</a> Infect and Immun. 73 (9), 5438-5449 (2005).</li><li>Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays.">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li><li>Bender, J., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IS10+transposase+mutations+that+specifically+alter+target+site+recognition.">IS10 transposase mutations that specifically alter target site recognition.</a> The EMBO Journal. 11 (2), 741-750 (1992).</li><li>Shafferman, A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+properties+of+the+beta+origin+of+replication+of+plasmid+R6K.">Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K.</a> J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).</li><li>Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+assay+of+every+Salmonella+Typhi+gene+using+one+million+transposon+mutants.">Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants.</a> Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).</li><li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Daniels, L. L., Kim, S. K., Haldimann, A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+replicative+and+conjugative+plasmids+carrying+lacZ+alpha+for+cloning,+mutagenesis,+and+allele+replacement+in+bacteria.">Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria.</a> Plasmid. 35 (1), 1-13 (1996).</li><li>Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays.">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li><li>Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Sex-factor-affinity+Site+in+E.+coli+as+&#947;&#948;.">Identification of a Sex-factor-affinity Site in E. coli as &#947;&#948;.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45, 135-140 (1981).</li><li>Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Genome+Sequence+of+Escherichia+coli+K-12.">The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li><li>Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn10+transposon+derivatives+for+insertion+mutagenesis+and+gene+delivery+into+the+chromosome+of+gram-negative+bacteria.">Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.</a> Gene. 160 (1), 59-62 (1995).</li><li>Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+construction+of+pir++Enterobacterial+hosts+for+maintenance+of+R6K+replicon+plasmids.">A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids.</a> BMC Res Notes. 5 (1), 157 (2012).</li><li>Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+and+adaptation+in+a+long-term+experiment+with+Escherichia+coli.">Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.</a> Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).</li><li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).</li><li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li></ol>

Forfatteren har ikke noe å avsløre.

Protokollen beskrevet her kan for bygging av et tett innsetting bibliotek. Denne metoden tillater opprettelsen av et transposon bibliotek med over 2 x 105 unike transposon mutanter bruker under 5 mL kultur volum6. Det er relativt enkelt å utføre, bruker reagenser i mest grunnleggende mikrobiologi labs, skaleres og krever lite i veien for dyrt utstyr eller forbruksvarer som electroporation cuvettes.
En viktig fordel med denne metoden er at, i teorien, brukeren har stort spillerom i valg av enterobacterial mottaker stammer. Dette papir, og andre11, bruke E. coli som en mottaker belastning, men pJA1 plasmider har vært brukt med hell med andre enterobacterial mottaker arter som Shigella flexneri6 og Salmonella enterica serovar Typhimurium belastning SL134410. Teoretisk sett, γ opprinnelsen til replikering (oriR6Kγ) i pJA1 kan dette plasmider vedlikeholdes på en bred vert området19, tillate at mottakeren belastningen er pir +. Nylig har nye metoder blitt beskrevet en som tillater konstruksjon av pir + i en rekke enterobacterial stammer20, gir ytterligere fleksibilitet. I tillegg gir300 base par mob regionen fra RP4 plasmider i pJA1 konjugerbart overføring av denne plasmider til en rekke gram negativ bakteriell stammer19. Enkelt sagt, denne metoden kan teoretisk brukes med en rekke mottaker stammer, som flere betingelser er oppfylt: belastningen er pir+, og er merket med en antibiotikaresistens enn kanamycin og enn donor belastningen.
En avgjørende skritt i protokollen ligger i å estimere riktig antall celler til plate ut i trinn 4.1. Hvis kolonier fordeles for tett, de konkurrerer for næringsstoffer på tallerkenen og mindre passer mutanter er outcompeted. Dette kan føre til en reduksjon i antall mutanter. Alternativt hvis koloniene er plassert for langt fra hverandre, det blir for få kolonier på tallerkenen, og antall agar plater for å oppnå et stort bibliotek blir tyngende. Det er derfor viktig å oppnå den rette balansen i kolonien tall per plate.
Det er viktig å utføre kontrollene oppført i protokollen for å sikre trinnene arbeider som beskrevet. Spesielt når bruker nalidixic acid som et mot utvalg mot donor belastning, er det viktig å sikre negative donor kontroll platene er gratis kolonier. Dette er fordi det kan være en lav rente (ca 1 x 10-10)21 av spontane motstand mot nalidixic acid, gir false positiv. Frekvensen av bøyning og transponering er vanligvis ca 2 x 10-4 19. Derfor er bøyning og transponering flere størrelsesordener større enn spontan motstand mot nalidixic acid. Derfor falske positiver sammenlignet med ekte transponering hendelser er svært lav og anses ubetydelig når protokollen fungerer. Men hvis priser på Bøyning eller transponering betydelig redusert, (fra lav parring effektivitet og/eller mangel på induksjon av transposase genet med IPTG) og protokollen er skalert opp å kompensere for dette, så antallet falske positiver (kloner som ikke har transposon satt inn) kan også øke.
Noen endringer kan gjøres inkubasjon ganger i trinn 3.2 og 3.10. Trinn 3,2 stater som Bøyning skulle oppstå 6 h, men i vår erfaring, denne gang trinn kan være varierte (dvs.4-7 h) uten å endre resultatet betydelig. I tillegg i trinnet 3.10 kan tiden koloniene er ruges på agar platene også justeres. Dette kan endres avhengig av gjennomsnittlig dobling tid eller vekst rate av mottakeren belastningen. I tillegg, i vår erfaring gitt 18 h en rekke kolonien størrelser, indikerer et bibliotek med ulike fitness. Men kolonier med sterkt reduserte fitness kan ta lengre tid å vokse og dermed kan ikke være synlig etter 18 h. Hvis denne metoden brukes til å finne kloner av svært redusert fitness, kan lengre inkubasjon ganger og færre kolonier på tallerkenen å redusere stimlet (dvs., 48t, 50-300 kolonier) brukes.
Flere fallgruver ved denne metoden inkluderer det ikke er mulig å bruke en mottaker stamme som allerede er kanamycin motstandsdyktig. Det kan være mulig å bytte ut kanamycin motstand merket i pJA1 plasmider en alternativ valgbar markør, som chloramphenicol overvinne dette hinderet. Det kan også være verdt å merke seg at, i teorien, er det mulig å bruke en mottaker stamme som er motstandsdyktig ampicillin, som pJA1 plasmider inneholder ampicillin motstand markøren er tapt etter transponering.
Etableringen av et tett transposon bibliotek i genetisk bakgrunnen av valget er potensielt fordelaktig for mange nedstrøms programmer. Et tett transposon bibliotek kan for eksempel brukes til å identifisere auxotrophic mutanter bruker kopi plating22 eller identifisere mutanter som er defekt i å etablere en infeksjon1,2. Flere nylig, DNA sekvensering kostnader har falt og nye teknologier som neste generasjons sekvensering har blitt vanlig, transposon biblioteker har blitt brukt med dyp DNA sekvensering for å få innsikt i genet essentiality, gen funksjon, og genetiske interaksjoner. Noen av disse metodene er gjennomgått i 23 og omfatter metoder som transposon-rettet innsetting området sekvensering (TraDIS), transposon sekvenser (Tn-seq), høy gjennomstrømming innsetting ved dyp sekvensering (treff) og innsetting sekvensering ( INSeq). Alle metodene nedstrøms avhengige av tett transposon innsetting biblioteker. Mens andre vektorer må brukes for spesiell nedstrøms metoder, gir protokollen beskrevet her en oversikt over den fremspringende fremgangsmåter for å følge.

Etablering av transposon mutagenese biblioteker i bakterier er nyttig for en rekke applikasjoner, alt fra funn av virulens gener i bakteriell patogener1,2, til studier av viktige gener3, 4 , 5 , 6, til identifisering av genetisk samhandling nettverk7,8,9. Kritisk til disse studiene er muligheten til å lage et stort bibliotek av mutanter. Bruk av transposons (kort fragmenter av DNA som tilfeldig inn i en genome) er en enkel måte å forstyrre gen funksjon, som innsetting av en transposon i åpent lesing ramme eller regulatoriske regionen et gen vil ofte forstyrre funksjonen eller uttrykk av genet.
Skissert her er en metode for etablering av et transposon bibliotek i E. coli eller S. flexneri av bakteriell Bøyning bruker plasmider pJA110. Det er to hovedfordeler denne plasmider. Den første fordelen er at varianten av den Tn10 transposase uttrykt fra pJA1 plasmider er induserbart og har lav innsetting bias11,12, betyr at transposon tilfeldig vil integrere i genomet når Isopropyl Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) legges til media. Transposon inneholder en kanamycin motstand markør, slik at markeringen av mutanter med transposon skivene kromosomet av mottakeren belastningen. Den andre fordelen med pJA1 plasmider er at den inneholder en R6K mutant opprinnelse i replikering. R6K mutant opprinnelsen til replikering krever lambda pir genet for at vedlikehold av plasmider13. Som plasmider ikke kan replikere i pir - stammer, vil det gå tapt i mottakerens belastningen (figur 1). Dette sikrer at Tn10 transposase er fjernet fra cellen og er ikke lenger aktiv, reduserer ytterligere mutasjoner etter første transponering hendelsen.
Bruk av bakteriell Bøyning flytte pJA1 plasmider fra donor belastningen til mottakeren belastning er fordelaktig for flere grunner. Bøyning er enkelt og billig å utføre og trenger ikke spesielt utstyr som en electroporator. I tillegg høy virkningsgrad av bakteriell Bøyning tillater et stort bibliotek (&#62; 2 x 105 unike innsettinger) oppnås med kun ml (mL) overnatting bakteriell kultur6. Prosessen tar rundt to timer med hands-on tid med tid for inkubasjon og veksten av bakterier. Langridge et al. 14 rapportert utfører 130 electroporations å skape en transposon mutagenese bibliotek størrelse lik den beskrives her8, som er oppnådd med en enkelt Bøyning. Bruk av 130 electroporations krever arbeidskraft intensiv og tidkrevende utarbeidelsen av electrocompetent celler og bruk av mange dyre materialer (f.eks, electroporation cuvettes) til en kostnad på mer enn $1000 USD i forbruksvarer alene. Andre studier10 har brukt lignende metoder, men med forskjellige bakteriell stammer og oppnådd langt mindre biblioteket størrelser (5 x 104 kolonien danner enheter) enn rapporterte her.
Notater om donor belastningen: donor belastningen her er E. coli belastningen BW2076715 inneholder pJA1 transposon plasmider16. Belastning BW20767 kan bøye til andre stammer, gjør overføring av pJA1 plasmider effektivt. Også viktigere, BW20767 er lambda pir +. Som nevnt tidligere, er bare plasmider pJA1 kunne opprettholdes i stammer som inneholder lambda pir genet. Denne belastningen er kanamycin og ampicillin motstandsdyktig. PJA1 plasmider inneholder ampicillin motstand markøren, og en kanamycin motstand markør finnes i transposon. Denne belastningen er vokst med utvalg på plasmider bruker ampicillin på 100 µg/mL. Det er også verdt å merke seg at andre stammer skjuler constitutively uttrykt transposase gener er kjent for å være ustabile, og mens transposase brukt her er induserbart kontroll, det er fortsatt en lav risiko lekk uttrykk. Derfor er det foreslått at passering av denne stammen bør minimaliseres og en frisk strek bør tas fra en frossen kultur for hver nye biblioteket forberedelse. Donor belastningen her er tilgjengelig fra vår lab på forespørsel.
Notater om mottakeren belastningen: mottaker belastningen kan være en belastning av valg, for eksempel K12-avledet laboratorium stammer av E. coli eller stammer av S.flexneri (se også, diskusjon). Mottaker belastning må ha en ekstra antibiotikaresistens markør som ikke er kanamycin motstand, slik at donor belastningen kan velges mot. For mottaker belastningen brukes en E. coli MG1655 belastning her med en introdusert spontan nalidixic acid mutasjon. Spontan nalidixic acid mutant ble valgt av plating ut 2 mL av natten kultur i 200 µL dele på plater inneholder nalidixic acid på 30 µg/mL. En enkel klone av MG1655 ble valgt som var resistente mot nalidixic acid bli mottaker belastningen. Mottaker belastning må dessuten være lambda pir negativ, som beskrevet ovenfor.
Oversikt: Når bakteriell Bøyning har funnet sted og pJA1 plasmider flyttet fra donor belastningen til mottakeren belastningen, tillegg av IPTG til media vil induserer uttrykk for tnp genet, som er under kontroll av IPTG-induserbart lacIq/Ptac promoter (figur 1). Tnp genet på pJA1 er en mutant transposase som har en lavere frekvens av innsetting på aktiveringspunkt6,10,11. På tillegg og induksjon med IPTG, er transposon aktivert og tilfeldig inn i genomet. Plasmider ikke kan brukes i lambda pir-mottaker belastningen og er tapt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">0.45 micron nitrocellulose filters (sterile)</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">HAWP02500</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively blotting paper can be used (listed below)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:335px;">Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper</td>
			<td style="width:171px;">GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 &#215; 57 cm</td>
			<td>3030-917</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Metal Forceps, sterile</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>MURRE009/01</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume,&#160; 12.5 mL working volume.</td>
			<td style="width:171px;">Interlab New Zealand</td>
			<td>2303-1090</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:335px;">Sterile glass spreaders</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>NZNZSPREADER</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:335px;">Sterile glass beads</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>HERE1080603</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Nalidixic acid (optional)</td>
			<td style="width:171px;">GoldBio.com</td>
			<td style="width:119px;">N-015-250</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">Ampicillin sodium salt BioChemica</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>APLIA0839.0025</td>
			<td style="width:179px;">prepare according to manufacturer recommendation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Kanamycin sulfate BioChemica</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>APLIA1493.0010</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">IPTG (Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside)&#160;</td>
			<td>Thermofisher New Zealand</td>
			<td>FMTR0393</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">Difco Agar granulated</td>
			<td style="width:171px;">Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand</td>
			<td style="width:119px;">214530</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Luria Broth Base (Miller&#39;s LB Broth Base)</td>
			<td style="width:171px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">12795-084</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Glycerol bidistilled 99,5 %</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>VWRC24388.320</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">15 ml polypropelene sterile conical vials&#160;</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>CORN430791</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>AXYGMCT-175-C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td style="width:119px;">BDAA352070</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Equipment</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Incubator at 37C</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Autoclave for sterilizing media&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation of a dense transposon insertion library using bacterial conjugation in enterobacterial strains such as escherichia coli or shigella flexneri

Transposon mutagenese er en metode der genet avbrudd via tilfeldig genomisk innsetting av et stykke av DNA kalt en transposon. Protokollen nedenfor beskriver en metode for høy effektivitet overføring mellom bakteriell stammer av en plasmider skjuler en transposon som inneholder en kanamycin motstand markør. Plasmider-borne transposase er kodet av en variant tnp genet som setter inn i transposon i genomet av mottakeren belastningen med svært lav insertional bias. Denne metoden kan dermed etableringen av store mutant biblioteker der transposons har blitt satt inn i unike genomisk posisjoner i en mottaker stamme av bakterien Escherichia coli eller Shigella flexneri . Ved hjelp av bakteriell Bøyning, i motsetning til andre metoder som electroporation eller kjemisk forandring, kan store biblioteker med hundretusener av unike kloner opprettes. Dette gir høy tetthet innsetting biblioteker, med innsettinger skjer så ofte som hver 4-6 base parene i uvesentlig gener. Denne metoden er bedre enn andre metoder som gjør det mulig for en rimelig, brukervennlig og høy effektivitet metoden for etableringen av et tett transposon innsetting bibliotek. Transposon biblioteket kan brukes i nedstrøms programmer som transposon sekvensering (Tn-Seq), for å antyde genetisk samhandling nettverk, eller enklere, i mutational (frem genetisk) skjermer.

Etter 18 timer med vekst, plater bør inneholde mange koloniene med en rekke kolonien størrelser (Figur 3). Forskjellige kolonien størrelser angir kloner av varierende form, og er et godt tegn at protokollen har jobbet. Giver og mottaker kontrollene skal ha ingen vekst på platene. Ved hjelp av protokollen ovenfor skal gi godt over 2 x 105 kolonien danner enheter (CFU). Skalere opp protokollen til fem Repliker conjugations samtidig skal gi ca 1 x 106 CFU. I tidligere arbeid, analyse med neste generasjons sekvensering indikerte at slike en skalert opp biblioteket skal gi &#62; 2 x 105 unike innsettinger6. I svært høy CFU (dvs1 x 106 CFU) forventes frekvensen av unike innsettinger å platået, alle tilgjengelig (ikke-fatale) innsettinger bli representert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig1.jpg"> 
Figur 1 : Skjematisk av bakteriell bøyning og innsetting av transposon kromosomet. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig2.jpg"> 
Figur 2 : Bilde av filtre senket i LB media før og etter vortexing. Før vortexing, celler fast til filteret og media er klart. Etter vortexing blir media skyet som celler har kommet ut av filteret og er i media. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig3.jpg"> 
Figur 3 : (A) representant plate av transposon biblioteket etter 18 h vekst. (B) Close up kolonien størrelser. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri at JoVE.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presenteres her er en enkel metode for å skape en høy tetthet transposon innsetting bibliotek i Escherichia coli eller Shigella flexneri bruker bakteriell Bøyning. Denne protokollen tillater etablering av en samling av hundrevis av unike mutanter i bakterier av tilfeldige genomisk innsettingen av en transposon.

Etableringen av et tett Transposon innsetting biblioteket bruker bakteriell bøyning i Enterobacterial stammer som Escherichia Coli eller Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Ved å bruke<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Å studere autofagi-Cytoskjelettet Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-invasiv Model of Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infeksjon i Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generasjon og Multi-fenotypiske Høy innhold Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Ett-trinns Negativ kromatografiske rensing i<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofilaktiverende Protein overuttrykkes i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; I batch-modus

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Påvisning av enterohemorrhagiske Escherichia Coli kolonisering i Murine vert av ikke-invasiv i Vivo bioluminescens System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspresjon og rensing av menneske<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

Høy gjennomstrømming parallelle sekvensering å måle Fitness Leptospira interrogans Transposon innsetting mutanter under Golden Syrian Hamster infeksjon

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

En lettvinte protokoll for å generere Site-Specifically Acetylated proteiner i Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replikering av bestilt, Nonredundant bibliotek av Pseudomonas aeruginosa belastning PA14 Transposon innsetting mutanter

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...