Name: creation of a dense transposon insertion library using bacterial conjugation in enterobacterial strains such as escherichia coli or shigella flexneri
Uploaded: 2017-09-23T14:00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri at JoVE.

Я благодарю Джордж церковь лаборатории для рода дар pJA1 плазмиды. Я благодарю Фабьенн гамбургер и Алекс Boehm от Урс Jenal лаборатории в Biozentrum в Базеле за помощь с бактериальной спряжение и предоставление BW20767 штамма. Я также благодарю Олин Силандер за полезные изменения. Финансирование этого исследования была представлена средств от Massey университет в Новой Зеландии и Швейцарии инициативы в биологии (проект «Битвы X» присуждена Дирк Bumann) в университете Базеля, Швейцария.

внимание: при использовании S. Флекснера как получателя деформации, обратите внимание, что S. Флекснера является человеческий патоген, которые могут вызвать желудочно-кишечные заболевания. Эксперименты с S. Флекснера должны быть выполнены соответствующие биобезопасности меры предосторожности (обозначено BSL-2 в Европе и США или PC2 в Новой Зеландии). Все эксперименты, проведенные в видео, связанные с настоящим Протоколом были сделаны с помощью хорошо известных получателей штамма непатогенных E. coli MG1655 в обстановке PC1. Работа с шигеллам Флекснера ранее была выполнена в лаборатории BSL-2 на Biozentrum в Базеле, как описано в 6.
 Примечание: следующий эксперимент эффективно выполняется дважды. Первая часть (шаг 1.1 - шаг 4.5) выполняется выяснить лучшие разрежения для нанесения гальванического покрытия, Библиотека, где целью является найти разрежения спряжение, который дает много отдельных колоний на пластину, но не так много, что формы газона. Это необходимо для уменьшения конкуренции между мутантов с значительно сокращена фитнес и те, с более надежной фитнес. Вторая часть (шаги 5.1-7,4) является создание окончательного библиотеки, где многие плиты распространяются соответствующие разбавления библиотеки.
 1. чтобы подготовить один день до эксперимента <ol><li>Inoculate, от замороженных запас, штамм доноров в 2 мл LB отвара, мельники рецепт (NaCl на 10 г/Л) носитель, содержащий ампициллина на 100 мкг/мл. Штамм доноров, используемый здесь является штамм E. coli BW20767 15 укрывательство плазмида pJA1 11. Использование ампициллин обеспечивает выбор для плазмида pJA1.</li>
	<li>Inoculate, от одной колонии или замороженные инвентаря, получателей штамм в 2 мл LB СМИ с маркером сопротивления помимо ампициллин или канамицин. Получателей штамм, используемый здесь является E. coli &#34; дикого типа &#34; штамма MG1655 17 , 18 с спонтанное сопротивление мутанта с налидиксовой кислотой. Он выращивается в 30 мкг/мл Налидиксовая кислота.</li>
	<li>Подготовить бульоне Лурия 20, содержащих агар 1,5% пластины (в Петри 90 мм, около 12,5 мл). Плиты агара, хватает антибиотик может храниться при температуре 4 ° C на несколько месяцев до использования.</li>
	<li>Подготовить бульоне Лурия 20 содержащие плиты агара 1,5% (в Петри 90 мм, около 12,5 мл) содержит налидиксовой кислоты на 30 мкг/мл и канамицин в 50 мкг/мл (LBA Nal30 Kan50). Плиты агара, содержащие антибиотики могут храниться в темноте при температуре 4 ° C на несколько месяцев до использования.</li>
	<li>Подготовить 200 мл стерильного LB средств массовой информации. LB СМИ может храниться при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.</li>
	<li>Подготовить 1 мл 100 мм стерильные запас ИПТГ, по словам производителя &#39; s инструкции.</li>
</ol> 2. Бактериальные сопрягать или конъюгации <ol><li>центрифуг 1 мл ночь культуры штамма доноров за 1 минуту в 14.000 x g при комнатной температуре. Отказаться от выращивания. Этот шаг выполняется для удаления всех питательных сред, содержащих антибиотики.</li>
	<li>Ресуспензируйте Пелле клеток в 110 мкл фунтов (не содержащие антибиотики), таким образом концентрируя культуры.</li>
	<li>Использование стерильный пинцет, позиция фильтр стерильные нитроцеллюлозы (альтернативно кусок стерильной промокательной бумаги могут быть использованы, смотрите материалы список) на середине LBA пластины (не содержащие антибиотиков). Этикетке плиты &#34; отрицательный контроль: доноров &#34;.</li>
	<li>С помощью пипетки, падение 50 мкл концентрированного доноров культуры на фильтр.</li>
	<li>Повторите пункты 2.1-4 для получателя штамм, маркировки пластины &#34; отрицательный контроль: получатель. &#34;</li>
	<li>Для библиотеки, падение 50 мкл доноров (от шага 2.2) и 50 мкл штамма получателя (с шагом 2.5) на один стерильные фильтр на плите LBA (эти плиты не должны содержать антибиотиков). Ярлык эта пластинка &#34; библиотека. &#34; спаривание происходит потому, что доноров и получателей находятся в тесном физическом контакте на фильтре.</li>
	<li>Место плиты агара, содержащий фильтры при 37 ° C для 6 ч.</li>
</ol> 3. Активация pJA1 Transposon с IPTG индукции Транспозаза <ol><li>подготовить три 15 мл конические флаконах, содержащих 2 мл фунтов с IPTG в конечной концентрации 1 мм (т.е., 20 мкл акций 100 мм ИПТГ). Каждая метка: доноров управления, управления получателя и библиотека.</li>
	<li>Удалить пластины из инкубатора после 6 h роста при 37 ° C (от шаг 2.4). Некоторые бактериального роста должны быть видны на фильтре.</li>
	<li>Использование стерильный пинцет, удалите фильтр бумагу из доноров управления и поместите его в конической флакон 15 мл, помечены доноров управления (от шага 3.1). Сделать то же самое для управления получателя и библиотека.</li>
	<li>Нажмите трубы получить документ фильтр в нижней части конических флакон 15 мл и убедитесь, что он полностью погружен в фунта</li>
	<li>Вихревой трубы для по крайней мере целую минуту на высоких, чтобы отделить бактерии из нитроцеллюлозы фильтра. LB должна стать облачно с бактериальной клетки ( рис. 2).</li>
	<li>С помощью стерильных стеклянных шариков или стерильной разбрасыватель, плита 200 мкл суспензии vortexed бактерий от доноров управления на LBA Nal30 Kan50 плиты с надписью &#34; доноров управления, 200 мкл &#34;.</li>
	<li>Повторить шаг выше (3.6) для элемента управления получателя, Маркировка пластин &#34; элемента управления получателя, 200 мкл &#34;.</li>
	<li>Повторить шаг выше (3,7) для библиотеки, Маркировка пластин &#34; Библиотека, 200 мкл &#34;.</li>
	<li>Сделать дополнительные разведений (т.е., 1:5, 1: 100 и 1:10 разведений, используя фунтов, не содержащие антибиотики как разбавителя) библиотеки. Плита 200 мкл неразбавленном библиотеки и дополнительные разведений на соответствующим образом помечены пластины LBA Nal30 Kan50.</li>
	Инкубатор <li>место пластины в 37 ° C для 18 h. клоны с транспозонов вставлен в гене, что приводит к большой потере фитнес может занять больше времени, растут и появляются на плите. Там должно быть различных размеров, колонии ( рис. 3). Доноров и получателей деформации плиты должны иметь никаких колоний на них.</li>
</ol> 4. Выберите соответствующие разрежения в библиотеку, чтобы использоваться для окончательного мутант библиотеки <ol><li>определить разрежения библиотеки с 3,9 шаг, который дает много колоний различных размеров, адекватно расположены. Цель состоит в том, чтобы получить как много колоний на одной тарелке, но не так много, что колонии сливаются друг с другом и конкурировать за ресурсы. Это число должно быть примерно 500-2000 колоний на пластину. На рисунке 3 приведен пример плотностей соответствующие колонии на тарелку,.</li>
	<li>Записать количество колоний на тарелках.</li>
	<li>Расчет частоты спряжение (количество conjugants на получателей ячейку). Это должно быть в диапазоне от 1 x 10 -4 до 1 x 10 -6 19.</li>
	<li>Определяет количество мутантов в заключительном библиотеки, основанной на нисходящие приложения. Многие пользователи просто требуется библиотека с столько мутантов как можно скорее. Для создания как много вставок transposon как теоретически возможных (один вставки каждой пары), направлены на приблизительноеly одинаковое количество колоний как пар нуклеотидов в геноме (то есть, ~4.5 x 10 6 для е. coli) полностью насытить генома всех возможных transposon вставки. Важно отметить, многие мутантов, укрывательство вставок в эфирных или функционально важно генов будет не сможет быть восстановлена, как эти мутации будет фатальным для получателя.</li>
	<li>Вычислить, сколько объем первоначальной библиотеки необходима для создания библиотеки желаемого размера. Например размер желаемого библиотека-5 х 10 4 мутантов. Разбавление с лучшими интервалов колоний с шагом 3,9 был 200 мкл рабочего раствора 1:10 разрежения. Количество колоний на этой табличке, по оценкам, приблизительно 2000 колоний. Если необходимы 5 х 10 4 мутантов и каждая рабочая пластина имеет 2000 колоний, то 25 плиты необходимо будет на этом разрежения.</li>
</ol> 5. Создание окончательного мутант библиотеки <ol><li>повторите шаги 1 – 3.8, регулируя количество пластин на этапе 1.4 при необходимости (см. шаг 4.4).</li>
	<li>На шаге 3.9, тарелка разрежения, выбранного на шаге 4.1 на столько пластин, необходимых для создания в библиотеке нужного размера (см. шаг 4.4).</li>
</ol> 6. Оценить плотность библиотека <ol><li>подсчитать, сколько колонии там находятся на пластину и тем самым получить грубую оценку как плотные библиотека является. Например: В общей сложности 2 x 10 5 колоний покрытием. Геном кишечной палочки MG1655 составляет около 4.5 x 10 6 пар. Таким образом библиотека с приблизительно 2 x 10 5 вставляет означает, что есть вставка в среднем каждые 22 пар оснований и что каждый ген должен быть мутировал около 45 раз, учитывая что одним геном приблизительно 1 x 10 3 низкопробных пар. Вставки в важно генов могут быть весьма недопредставлены в этой библиотеке, и таким образом плотность в несущественных генов может быть больше, чем это. Такого рода расчетов обеспечивает один с широкую оценку плотности transposon.</li>
</ol> 7. Объединение Transposon библиотека и хранения <ol><li>после подсчета колоний, добавьте 1 mL фунта (или более, при необходимости) на пластину библиотеки и использовать стерильные разбрасыватель соскрести бактерий от пластины. Удаление бактериальной подвеска и место в коническую пробирку 50 мл или 15 мл. Повторите эти действия для всех плит.</li>
	<li>Vortex подвеска пуле бактерий за полную минуту в приостановлении гомогенизировать.</li>
	<li>Добавить стерильные глицерина в конечной концентрации 20%.
	<ol><li>Подготовить 100 x 20 мкл аликвоты 0,25 мл пробирки легко ре-роста.</li>
		<li>Подготовить по крайней мере два или более 1 мл аликвота в криопробирки.</li>
	</ol></li> <li>Хранить все аликвоты -80 ° c</li></ol>

<ol>
	<li>Camacho, L. R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B., Guilhot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+virulence+gene+cluster+of+Mycobacterium+tuberculosis+by+signature-tagged+transposon+mutagenesis.">Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis.</a> Mol Microbiol. 34 (2), 257-267 (1999).</li><li>Hensel, M., Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M. D., Dalton, E., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+bacterial+virulence+genes+by+negative+selection.">Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection.</a> Science. 269 (5222), 400-403 (1995).</li><li>Glass, J. I., Assad-Garcia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+genes+of+a+minimal+bacterium.">Essential genes of a minimal bacterium.</a> PNAS. 103 (2), 425-430 (2006).</li><li>Salama, N. R., Shepherd, B., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+transposon+mutagenesis+and+essential+gene+analysis+of+Helicobacter+pylori.">Global transposon mutagenesis and essential gene analysis of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 186 (23), 7926-7935 (2004).</li><li>Akerley, B. J., Rubin, E. J., Camilli, A., Lampe, D. J., Robertson, H. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+essential+genes+by+in+vitro+mariner+mutagenesis.">Systematic identification of essential genes by in vitro mariner mutagenesis.</a> PNAS. 95 (15), 8927-8932 (1998).</li><li>Freed, N. E., Bumann, D., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Shigella+Tn-seq+data+with+gold-standard+E.+coli+gene+deletion+data+suggests+rare+transitions+between+essential+and+non-essential+gene+functionality.">Combining Shigella Tn-seq data with gold-standard E. coli gene deletion data suggests rare transitions between essential and non-essential gene functionality.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 1-14 (2016).</li><li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn-seq:+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms.">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nature Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li><li>Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+assay+of+every+Salmonella+Typhi+gene+using+one+million+transposon+mutants.">Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants.</a> Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).</li><li>Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+insertion+mutants+within+libraries+by+deep+sequencing+and+a+genome-wide+screen+for+Haemophilus+genes+required+in+the+lung.">Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung.</a> PNAS. 106 (38), 16422-16427 (2009).</li><li>Chan, K., Kim, C. C., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+detection+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+transposon+mutants+that+cannot+survive+in+macrophages+and+mice.">Microarray-based detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium transposon mutants that cannot survive in macrophages and mice.</a> Infect and Immun. 73 (9), 5438-5449 (2005).</li><li>Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays.">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li><li>Bender, J., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IS10+transposase+mutations+that+specifically+alter+target+site+recognition.">IS10 transposase mutations that specifically alter target site recognition.</a> The EMBO Journal. 11 (2), 741-750 (1992).</li><li>Shafferman, A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+properties+of+the+beta+origin+of+replication+of+plasmid+R6K.">Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K.</a> J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).</li><li>Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+assay+of+every+Salmonella+Typhi+gene+using+one+million+transposon+mutants.">Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants.</a> Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).</li><li>Metcalf, W. W., Jiang, W., Daniels, L. L., Kim, S. K., Haldimann, A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+replicative+and+conjugative+plasmids+carrying+lacZ+alpha+for+cloning,+mutagenesis,+and+allele+replacement+in+bacteria.">Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria.</a> Plasmid. 35 (1), 1-13 (1996).</li><li>Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+analyses+of+insertional+mutants+using+subgenic-resolution+arrays.">Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays.</a> Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).</li><li>Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Sex-factor-affinity+Site+in+E.+coli+as+&#947;&#948;.">Identification of a Sex-factor-affinity Site in E. coli as &#947;&#948;.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45, 135-140 (1981).</li><li>Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+Genome+Sequence+of+Escherichia+coli+K-12.">The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li><li>Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn10+transposon+derivatives+for+insertion+mutagenesis+and+gene+delivery+into+the+chromosome+of+gram-negative+bacteria.">Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.</a> Gene. 160 (1), 59-62 (1995).</li><li>Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+construction+of+pir++Enterobacterial+hosts+for+maintenance+of+R6K+replicon+plasmids.">A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids.</a> BMC Res Notes. 5 (1), 157 (2012).</li><li>Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+and+adaptation+in+a+long-term+experiment+with+Escherichia+coli.">Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.</a> Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).</li><li>Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+transposon+mutant+library+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.</a> PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).</li><li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li></ol>

Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.

Протокол, описанные здесь позволяет на строительство библиотеки плотной вставки. Этот метод позволяет создать библиотеку transposon с более чем 2 x 105 уникальных transposon мутантов с использованием до 5 мл культуры том6. Это сравнительно легко выполнить, использует реагентов в самых основных микробиологические лаборатории, масштабируемой и требует мало дорогостоящее оборудование или Расходные материалы, такие как электропорации кюветы.
Значительным преимуществом этого метода является, что, в теории, пользователь имеет широкую свободу действий в выборе энтеробактерий получателя штаммов. Это бумага, а также другие11, использовать как получателя деформации, E. coli , однако плазмида pJA1 успешно используется с другими энтеробактерий получателей видов, таких как шигеллам Флекснера6 и Salmonella enterica серовар Typhimurium штамм SL134410. Теоретически, γ происхождение репликации (oriR6Kγ) в pJA1 позволяет эта плазмида необходимо поддерживать широкий принимающей диапазон19, позволяя, что получатели штамм является Пир +. Недавно новые методы были описаны позволяют для строительства pir + в диапазоне от энтеробактерий штаммов20, дает дополнительную гибкость. Кроме того300 пары моб региона от RP4 плазмида в pJA1 позволяет сопряженных передачи этой плазмида широкий спектр грам отрицательные бактериальных штаммов19. Проще говоря, этот метод может теоретически использоваться с различными получателями штаммов, до тех пор, как несколько условий: штамм является pir+ и отмеченные антибиотикорезистентности за исключением канамицин и штамм доноров.
Важнейшим шагом в протоколе заключается в оценке правильное количество клеток для плиты в шаге 4.1. Если колонии расположены слишком близко, они конкурируют за питательных веществ на плите и outcompeted меньше подходят мутантов. Это может привести к сокращению общего числа мутантов. В качестве альтернативы если колонии расположены слишком далеко друг от друга, будет слишком мало колоний на плите, и общее количество агар пластин, необходимых для достижения большой библиотеки становится обременительным. Поэтому важным является достижение правильного соотношения численности колонии за тарелку.
Это имеет важное значение для выполнения элементов управления, перечисленных в протоколе, чтобы убедиться, что шаги работают как описано. Особенно при использовании Налидиксовая кислота как борьбе с выбор против штамма доноров, важно, чтобы убедиться, что негативные доноров управления пластины свободны от колоний. Это потому, что там может быть низкий уровень (приблизительно 1 x 10-10)21 спонтанное сопротивления Налидиксовая кислота, дающие ложных срабатываний. Как правило конъюгации и транспонирования составляет приблизительно 2 x 10-4 19. Таким образом конъюгации и транспонирования составляет несколько порядков больше, чем темпы спонтанного устойчивость к налидиксовой кислоты. Таким образом уровень ложных срабатываний по сравнению с истинной транспонирования события является очень низким и считается незначительным, когда протокол работает. Однако если значительно снижаются ставки сопряжения или транспонирования, (от низкой спаривания эффективности и/или отсутствие индукции Транспозаза гена с IPTG) и протокол масштабируется компенсировать это, то количество ложных срабатываний (клоны, не имеют transposon вставлены) также может увеличить.
Некоторые изменения могут быть сделаны для инкубации раз в 3.2 шаги и 3.10. Шаг 3.2 государств, возникающие сопряжения для 6 h, но по нашему опыту, это время может быть разнообразны (т.е., 4-7 ч), не меняя результаты значительно. Кроме того на этапе 3.10, продолжительность времени, которое колоний инкубируют на плитах агара можно также скорректирована. Это может варьироваться в зависимости от среднего удвоить скорость время или роста штамма получателя. Кроме того наш опыт, 18 h принесли различных размеров колонии, указывающий библиотеку разнообразных фитнес. Однако колонии с значительно снижается фитнес может занять больше времени, чтобы расти и таким образом не могут быть видны после 18 ч. Если этот метод используется для найти клонов чрезвычайно сниженным фитнес, могут использоваться более длительное время инкубации и меньшее количество колоний на пластину для уменьшения скученности (т.е., 48 ч, 50-300 колоний).
Дополнительные недостатки этого метода включают в себя, это не возможно использовать получателей штамм, который уже имеет резистентность канамицин. Это может быть возможность замены маркер канамицин сопротивления в pJA1 плазмиды для альтернативного выбора маркера, например хлорамфеникол сопротивление преодолеть этот барьер. Она также может быть стоит отметить, что, теоретически, можно использовать получателей штамм, который устойчив ампициллин, как pJA1 плазмиды, содержащий маркер сопротивления ампициллин теряется вскоре после транспонирования.
Создание плотного transposon библиотеки в генетический фон выбора потенциально выгодными для многих приложений, вниз по течению. Например плотной transposon библиотека может использоваться для выявления ауксотрофных мутантов с помощью реплики обшивка22 или идентификации мутантов, которые дефектных в создании инфекции1,2. Совсем недавно, как стоимость секвенирования ДНК снизилась и новые технологии, такие как следующего поколения последовательности стали обычным явлением, transposon библиотек были использованы с глубоким секвенирования ДНК чтобы разобраться в ген существенности, функции гена и генетических взаимодействий. Некоторые из этих методов рассматриваются в 23 и включать такие методы, как transposon направленных вставки узла виртуализации (TraDIS), transposon последовательности (Tn-seq), высок объём вставки, отслеживание глубокую последовательности (HITS) и вставки последовательность ( INSeq). Все эти вниз по течению методы полагаются на строительство плотной transposon вставки библиотек. В то время как другие векторов может потребоваться использоваться для конкретных методов, ниже по течению, протокол, описанные здесь дает обзор процедурные моменты следовать.

Создание библиотек transposon мутагенеза в бактерий является полезным для широкого круга приложений, начиная от открытия генов вирулентности в бактериальных патогенов1,2, исследования важно генов3, 4 , 5 , 6, на выявление генетических взаимодействия сетей,7,8,9. Решающее значение для этих исследований является возможность создания большую библиотеку мутантов. Использование транспозонов (короткие фрагменты ДНК, которые случайно вставьте генома) является простое средство нарушения функции гена, как вставки transposon рамка чтения открытая или регулирования региона гена будут часто нарушить функцию или выражение гена.
Здесь приводится метод для создания библиотеки transposon в E. coli или S. Флекснера бактериальных спряжение, используя плазмида pJA110. Есть два основных преимущества использования этой плазмиды. Первое преимущество, что вариант Транспозаза Tn10, выразил от плазмида pJA1 индуцибильный и имеет низкий вставки смещения11,12, означает, что transposon будет случайным образом интегрироваться в геноме когда изопропиловый Β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) добавляется к средствам массовой информации. Transposon содержит маркер сопротивления канамицин, позволяя для отбора мутантов с transposon вставками в хромосомы штамма получателя. Вторым преимуществом плазмида pJA1 является, что он содержит R6K мутант происхождения репликации. R6K мутант происхождение репликации требует лямбда Пир гена в целях поддержания плазмида13. Как плазмида нельзя реплицировать в Пир - штаммов, он будет потеряна в получателя штамм (рис. 1). Это гарантирует, что Транспозаза Tn10 удаляется из ячейки и больше не является активным, дальнейшее сокращение мутаций после первоначального переноса события.
Использование бактериальных спряжение переехать получателя штамм pJA1 плазмиды от доноров штамма выгодно по нескольким причинам. Спряжение простой и недорогой для выполнения и не нужно специальное оборудование, например electroporator. Кроме того, высокая эффективность бактериальной сопряжения позволяет очень большой библиотеки (&#62; 2 x 105 уникальных вставок) чтобы добиться с несколько миллилитров (мл) ночь бактериальной культуры6. Этот процесс занимает около двух часов практического времени, а также время для инкубации и роста бактерий. Лангридж и др. 14 сообщили выполнение 130 electroporations для создания библиотеки transposon мутагенеза размера аналогичен описано здесь8, которая достигается с одного сопряжения. 130 electroporations использования труда интенсивных и длительных подготовка electrocompetent клеток и использование многих дорогих материалов (например, электропорация кюветы), ценой более чем 1000 долларов в одиночку расходных материалов. Другие исследования10 используются аналогичные методы, но с различных штаммов бактерий и достигается гораздо меньших размеров библиотеки (5 х 104 колонии формируя единиц) чем сообщили здесь.
Примечания на штамм доноров: штамм доноров, используемый здесь является штамм E. coli BW2076715 , содержащий плазмида transposon pJA116. Штамм BW20767 может конъюгат другими штаммами, делая передачи плазмида pJA1 высоко эффективным. Кроме того, важно отметить, что BW20767 является лямбда pir +. Как упоминалось ранее, плазмида pJA1 только способен сохраняться в штаммов, содержащий лямбда Пир гена. Этот штамм является канамицин и ампициллин устойчивостью. Плазмида pJA1 содержит маркер сопротивления ампициллин, и маркер сопротивления канамицин содержится в transposon. Этот сорт выращивается с выбором на плазмида с использованием ампициллина на 100 мкг/мл. Это также стоит отметить, что другие штаммы, укрывательство конститутивно выразил Транспозаза генов известны нестабильной и, хотя используется Транспозаза вот под индуцибельной управления, остается низким риском Дырявый выражения. По этой причине предлагается, что прохождение этого штамма должно быть сведено к минимуму и свежие полоска должно приниматься из замороженных культуры подготовки каждой новой библиотеки. Штамм доноров, используемый здесь доступен с нашей лаборатории по запросу.
Примечания на штамм получателя: получателей деформации может быть штамм выбора, например штаммов E. coli K12-производные лаборатории или штаммов S.flexneri (см. также обсуждение). Получателей штамм должны иметь дополнительную устойчивость к антибиотикам маркер, не являющийся канамицин сопротивления, так что штамм доноров могут быть выбраны против. Для получателя штамма штамм E. coli MG1655 используется здесь с мутацией введены спонтанно налидиксовой кислоты. Спонтанное Налидиксовая кислота мутант был выбран обшивка из 2 мл на ночь культуры в 200 мкл аликвоты на плиты с налидиксовой кислотой на 30 мкг/мл. Один клон MG1655 был выбран, был устойчив к налидиксовой кислоты стать получателя штамм. Кроме того получатели штамм должны быть лямбда Пир негативные, как описано выше.
Обзор: После бактериальной спряжение имеет место и pJA1 плазмиды перешла от штамма доноров в получателя штамм, добавлением IPTG СМИ заставят экспрессии гена ТНП , который находится под контролем IPTG индуцибильный lacIq/Ptac промоутер (рис. 1). ТНП гена на pJA1 это мутант Транспозаза, который имеет более низкой частоте вставки в горячих точках6,10,11. После добавления и индукции с IPTG transposon активируется и случайно вставлены в геноме. Плазмида не может сохраняться в штамм Пир получатель лямбда и теряется.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">0.45 micron nitrocellulose filters (sterile)</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">HAWP02500</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively blotting paper can be used (listed below)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:335px;">Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper</td>
			<td style="width:171px;">GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 &#215; 57 cm</td>
			<td>3030-917</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Metal Forceps, sterile</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>MURRE009/01</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume,&#160; 12.5 mL working volume.</td>
			<td style="width:171px;">Interlab New Zealand</td>
			<td>2303-1090</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:335px;">Sterile glass spreaders</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>NZNZSPREADER</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:335px;">Sterile glass beads</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>HERE1080603</td>
			<td style="width:179px;">Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Nalidixic acid (optional)</td>
			<td style="width:171px;">GoldBio.com</td>
			<td style="width:119px;">N-015-250</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">Ampicillin sodium salt BioChemica</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>APLIA0839.0025</td>
			<td style="width:179px;">prepare according to manufacturer recommendation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Kanamycin sulfate BioChemica</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>APLIA1493.0010</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">IPTG (Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside)&#160;</td>
			<td>Thermofisher New Zealand</td>
			<td>FMTR0393</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">Difco Agar granulated</td>
			<td style="width:171px;">Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand</td>
			<td style="width:119px;">214530</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Luria Broth Base (Miller&#39;s LB Broth Base)</td>
			<td style="width:171px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">12795-084</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Glycerol bidistilled 99,5 %</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>VWRC24388.320</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">15 ml polypropelene sterile conical vials&#160;</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>CORN430791</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td>AXYGMCT-175-C</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile</td>
			<td style="width:171px;">VWR/Global Science New Zealand</td>
			<td style="width:119px;">BDAA352070</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Equipment</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Incubator at 37C</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Autoclave for sterilizing media&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation of a dense transposon insertion library using bacterial conjugation in enterobacterial strains such as escherichia coli or shigella flexneri

Transposon мутагенеза является метод, который позволяет нарушению гена через случайные геномной вставки куска ДНК, называется transposon. Ниже протокол описывает метод для высокой эффективности передачи между бактериальных штаммов плазмида, укрывательство transposon, содержащие маркер сопротивления канамицин. Учитывать плазмида Транспозаза кодируется вариант ТНП ген, который вставляет transposon в геном получателя сорт с очень низким инсерционному предвзятости. Таким образом, этот метод позволяет создание крупных мутант библиотек, в которых транспозонов были вставлены в уникальный геномной позиции получателей штамм бактерий кишечной палочки или шигеллам Флекснера . С помощью бактериальных спряжение, в отличие от других методов, таких как электропорации или химические преобразования, крупных библиотек с сотнями тысяч уникальных клоны могут быть созданы. Это дает высокой плотности вставки библиотеки, со вставками, происходящих как часто, как каждые 4-6 пар в несущественных генов. Этот метод превосходит другие методы как позволяет для недорогой, легкий в использовании и высокой эффективности метода для создания библиотеки вставки густой transposon. Transposon библиотека может быть использована в нисходящие приложения, например transposon виртуализации (Tn-Seq), вывести генетических взаимодействия сетей, или более просто, мутационного (вперед генетических) экраны.

После 18 часов роста, плиты должны содержать много колоний с различных размеров колонии (рис. 3). Размеры разные колонии указывают клоны различной фитнес и хороший признак того, что протокол работал. Элементы управления доноров и получателей помощи должны иметь никакого роста на тарелках. С помощью протокола выше должен принести более 2 x 105 колонии формируя единиц (CFU). Расширения протокола к пяти реплицировать спряжения сразу должен принести около 1 х 106 кое. В предыдущей работе, анализ с использованием следующего поколения последовательности указали, что такой масштабной вверх библиотека должна принести &#62; 2 x 105 уникальных вставки6. На очень высоких CFU (т.е., 1 x 10-6 CFU) количество уникальных вставки ожидается плато, как стать представлены все доступные вставками (некритическая).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig1.jpg"> 
Рисунок 1 : Схема бактериальных спряжение и вставки transposon в хромосоме. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig2.jpg"> 
Рисунок 2 : Изображение фильтров, submersed в СМИ фунтов до и после vortexing. Перед vortexing клетки застряли в фильтр, и средства массовой информации ясно. После vortexing средства массовой информации становится мутным, как клетки пришли офф фильтр и в средствах массовой информации. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig3.jpg"> 
Рисунок 3 : (A) представитель плита transposon библиотеки после 18 h роста. (B) крупным планом размеров колонии. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri at JoVE.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Здесь представлен простой метод для создания библиотеки высокой плотности transposon вставки в Escherichia coli или шигеллам Флекснера с использованием бактериальной спряжение. Этот протокол позволяет создание коллекции сотен тысяч уникальных мутантов в бактерии, случайные геномной вставки transposon.

Создание плотного Transposon вставки библиотеки с использованием бактериальной сопряжения в энтеробактерий штаммов таких как Кишечная палочка или шигеллам Флекснера

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Использование<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Для изучения аутофагии-Цитоскелет взаимодействий

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Неинвазивного Модель Neuropathogenic<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Инфекция в новорожденной крысы

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Генерация и нескольких фенотипическая Скрининг высокого содержания<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; транспозонов мутанты

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Один шаг Отрицательный хроматографической очистки<em&gt; Хеликобактерной</em&gt; Активирующий нейтрофилы белок избыточно экспрессируется в<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; В пакетном режиме

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Обнаружение энтерогеморрагические Escherichia Coli колонизации в мышиных принимающей системой неинвазивные в Vivo биолюминесценции

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Сверхэкспрессия и очищение человека<em&gt; Cis</em&gt; -пренилтрансфераза в<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

Высок объём параллельного секвенирования для измерения фитнес Лептоспире interrogans Transposon вставки мутантов во время Золотой сирийского хомяка инфекции

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Легковесные протокол для создания Site-Specifically ацетилированный белков в Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Репликация Ordered, неизбыточной библиотека штамма PA14 Transposon вставки мутантов синегнойной палочки

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...