Name: quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית ברנרד שוורץ ל' עבור הרופא מדענים האוניברסיטה רוקפלר, הקרן לפיתוח טיפולית רוברטסון באוניברסיטה רוקפלר, ואת מרכז ע ש סאקלר וההתערבות ומחקר תזונה- אוניברסיטת רוקפלר.

כל ההליכים אושרו על-ידי אוניברסיטת רוקפלר &#39; s אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש. כל החיות שוכנו בתנאים מסוימים ללא הפתוגן.
 1-ב חוץ גופית כימוטקסיס <ol><li>תרבות THP-1 תאים 6 בשנת 1640 המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI 1640) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 4-(2-hydroxyethyl)-1- חומ...

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

כימות של נדידת תאים חיסוניים יכול להתבצע באמצעות פשוטה, מהירה מבחני גם בתוך vitro וגם ויוו. נדגים את כימוטקסיס במבחנה של ומונוציטים האדם בתגובה שיפוע MCP-1 ו הגדלת מאת סרום. In vivo, splenocytes מאתר התורם באופן שונה עם תווית, בעקבות העברת המאמצת, ששוחזרו מחיות הנמען.
ש?...

חסינות חסון דורש התיאום הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית מורכב של מספר עצום של סוגי תאים על מנת להגיב כראוי על פציעה, זיהום, ליצור self-tolerance. מספר הקולטנים כימוקין עשרות וליגנדים המקביל שלהם התגלו, המנגנונים המולקולריים מתן מאופיין על ידי אילו תאים מסוים ויכולה להיות מכוונת לתוך רקמה ספציפית בזמן מסוים. לפיכך, לומד כימוטקסיס והעברה היא מרכיב הכרחי של מחקר באימונולוגיה. אכן, וזמינותו שתואר במבחנה לאחרונה שימשה ככלי מיון לזיהוי קופקטור chemotactic שמאיץ כימוטקסיס של תאי-T לכיוון נוגדנים 19 ו- 21 C-C3. מטרת בשיטות המתוארות כאן הם להתיר הערכות כמותיות של תאים חיסוניים כימוטקסיס במבחנה , בתוך vivo.
וזמינותו קאמרית בוידן (נדידת תאים, הפלישה) היא שיטה זולה, הדירים מהירה להערכת תא העברה4,5. ב וזמינותו סטנדרטי, התא העליון הוא נזרע עם תאים, מופרדת באמצעות הוספה נקבובי מ. התא התחתון, שאליו העברת התאים. בזמן הרצוי, תאים היגרו בצד התחתון של הקדמי יכול להיות קבוע, עבור כימות מוכתמת מיקרוסקופ אור. אולם, מדידות כאלה להגביל איסוף נתונים נקודת סיום יחיד, שמונע את איסוף נתונים דינאמי, באפשרותך לדרוש אופטימיזציה מקיפה כדי לקבוע את נקודת הזמן האופטימלי לניתוח. . הנה, מספר עיבודים מתוארים כי היתר בזמן אמת, כמותיים, מרובבת מדידות של כימוטקסיס במבחנה.
ללימודים ויוו , משמש נקודת סיום פונקציונלית, כלומר הצטברות תאים בתא רקמות נתון ספציפי. תאי התורם מראש שכותרתו יוכנסו חיות נמען באמצעות העברת המאמצת. אלה בתאי התורם לאחר מכן ניתן לזהות על ידי cytometry זרימה לאחר הקציר רקמות הנמען. הציג גם היא אסטרטגיה משותפת תיוג המאפשר קביעת סחר לסוגי תאים שונים בתוך חיה נמען בודד. שיטה זו מבטלת את הווריאציה בין בעלי חיים הזרקת תאים, ואת חשבונות עבור הפיזיולוגיות השתנות בין בעלי חיים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C1430</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB354597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9998S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant MCP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2e plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein animal health</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Isofluorane anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40um nylon</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml TB syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100228</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115540</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

כימוטקסיס הוא העברה לאורך כימי מסוים מעבר צבע1. נוגדנים הם ציטוקינים chemotactic לקדם סחר הסלולר עם ירידה לפרטים אנטומיים, זמני2. כימוטקסיס הוא פונקציה קריטית של לימפוציטים, תאים חיסוניים אחרים זה יכול להיות באופן כמותי מוערך ב חוץ גופית. כתב יד זה מתאר שיטות המתירים הערכת כימוטקסיס, גם במבחנה וגם ויוו, עבור סוגי תאים מגוונים כולל שורות תאים ותאים מקורית. ה במבחנה, עיצוב מבוסס על צלחת מאפשר השוואת בו-זמנית בתוך מספר תנאים בזמן אמת, ואת יכולה להסתיים תוך 1-4 ח' במבחנה assay תנאים ניתן לטפל להציג אגוניסטים ו antagonists, כמו גם להבדיל כימוטקסיס chemokinesis, וזו תנועה אקראית. עבור ויוו הערכות סחר, תאים חיסוניים יכול להיות עם צבעי פלורסנט מרובים תוויות, המשמש להעברת המאמצת. תיוג דיפרנציאלית של תאים מאפשר לאוכלוסיות לתא מעורב להיות מוחדרים החיה אותו, ובכך להקטין את השונות, להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים עבור ניסוי מופעל כראוי. הגירה לתוך רקמת הלימפה מתרחשת בתוך פחות משעה ולאחר מספר תאי רקמות ניתן לטעום. Cytometry זרימה לאחר הקציר רקמות מאפשר ניתוח מהיר ולא כמותית של דפוסי הנדידה סוגי תאים מרובים.

בעת שימוש calcein-אם צבע, בדיקה ויזואלית של תאים יאשר תווית ספיגת (איור 1). קריאות פלורסנט אוטומטיות יעקבו הגירה כמו תאי המעבר אל החלק התחתון של הקדמי לאורך זמן. נתונים אלו מראים בבירור אינדוקציה של נדידת תאים לכיוון MCP-1, כמו גם על הגדלת של תגובה זו על ידי סרום (<s...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo at JoVE.com

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

מדידת פעילות פרץ גרנולוציט ו מונוציטים Phagocytosis חמצוני בדם אנושי

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murine לימפוציטים תיוג ידי<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-נוגדן קולטן מיקוד עבור<em&gt; In vivo</em&gt; סחר Cell על ידי PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

מחקר בו זמנית של הגיוס של מונוציט Subpopulations תחת זרימה במבחנה

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

הכמת של פעילות כימוכתית מונוציט בVivo ואפיון מקרופאגים הנגזרים מונוציט

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...