Name: quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Bernard L. Schwartz programmet for lege forskere ved The Rockefeller University, Robertson terapeutiske utvikling fondet ved Rockefeller University, og Sackler Center for biomedisin og ernæring forskning på den Rockefeller University.

alle prosedyrer ble godkjent av Rockefeller University &#39; s institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. Alle dyrene ble plassert ved bestemte patogen uten betingelser.
 1. I Vitro Chemotaxis <ol><li>kultur THP-1 celler 6 i Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic syre (HEPES, 25 mM) (komplett media), opprettholde tetthet mellom 0,5-1.0 x 10 6 celle...

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

Kvantifisering av immun celle migrasjon kan oppnås ved hjelp av enkle og raske søk både i vitro og i vivo. Vi viser i vitro chemotaxis av menneskelig monocytter svar til et MCP-1 gradering og styrking av serum. I vivo, donor murine splenocytes var ulikt merket og etter adoptivforeldre overføring, gjenvunnet fra mottakeren dyr.
Bruke en plate leser har fordelen av prøvetaking flere tidspunkt (så ofte som hvert 30 s) og automatisere kvantifisering overf?...

Robust immunitet krever kompleks timelige og romlig samordning av en rekke celletyper for å besvare skade, infeksjon og generere self-tolerance. Flere dusin chemokine reseptorer og deres tilsvarende ligander har blitt oppdaget og preget gir molekylære mekanismer av hvilke bestemte celler kan rettes i en bestemt vev på et bestemt tidspunkt. Dermed er studere chemotaxis og overføring en uunnværlig del av immunologi forskning. Faktisk, beskrevet i vitro analysen ble sist brukt som en screening verktøyet for å identifisere chemotactic kofaktor som akselererer chemotaxis av T-celler mot C-C chemokines 19 og 213. Formålet med metodene som er beskrevet her er å tillate kvantitative vurderinger av immun celle chemotaxis i vitro og i vivo.
Boyden (celle migrasjon og invasjonen) kammer analysen er en billig, reproduserbare og rask metode for å vurdere celle migrasjon4,5. I standard analysen, den øvre kammeret er plantet med celler og er atskilt med en porøs sett fra en lavere kammer, der cellene overføre. Da ønskede, kan celler som har migrert til undersiden av sette fast og farget for kvantifisering av * lys. Men slike målinger begrense datainnsamling til en enkelt sluttpunktet, som utelukker dynamisk datainnsamling og kan kreve omfattende optimalisering å bestemme optimale tidspunktet for analyse. Her beskrives flere tilpasninger som tillater sanntid, kvantitative og multiplex målinger av chemotaxis i vitro.
I vivo studier, brukes en funksjonell sluttpunkt, nemlig bestemt akkumulering av celler i en gitt vev kupé. Forhåndsinnstilte merket donor cellene er introdusert i mottakerens dyr gjennom adopsjon overføring. Disse donor cellene kan senere identifiseres av flowcytometri etter mottaker vev innhøsting. Også presentert er en co merking strategi som tillater fastsetting av handel med ulike celletyper i en enkelt mottaker dyr. Denne metoden eliminerer Inter dyr variasjon fra celle injeksjon, og står for fysiologiske Inter dyr variasjon.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C1430</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB354597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9998S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant MCP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2e plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein animal health</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Isofluorane anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40um nylon</td>
			<td>Falcon Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2927</td>
			<td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C2925</td>
			<td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml TB syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100228</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115540</td>
			<td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

Chemotaxis er overføring langs en bestemt kjemiske gradient1. Chemokines er chemotactic cytokiner som fremmer mobilnettet handel med anatomiske og tidsmessige spesifisitet2. Chemotaxis er en viktig funksjon av lymfocytter og andre immunceller som kan kvantitativt vurdert i vitro. Dette manuskriptet beskriver metoder som tillater evaluering av chemotaxis, både i vitro og i vivo, for ulike celletyper inkludert linjer og innfødt celler. Den i vitroplate-basert format tillater sammenligning av flere vilkår samtidig i sanntid, og kan fullføres innen 1-4 h. In vitro analysen forhold kan manipuleres til å introdusere agonister og antagonister, som samt skille chemotaxis fra chemokinesis, som er tilfeldig bevegelse. For i vivo menneskehandel vurderinger, kan immunceller være merket med flere fluorescerende fargestoffer og brukes for adopsjon overføring. Differensial merkingen av celler gir mikset-celle populasjoner introduseres inn i samme dyret, og dermed redusere variansen og redusere antall dyr kreves for et tilstrekkelig drevet eksperiment. Overføringen i lymfoidvev oppstår i så lite som 1 h og flere vev rom kan prøves. Flowcytometri etter vev harvest tillater en rask og kvantitativ analyse av den vandrende mønstre flere celletyper.

Når du bruker calcein-AM fargestoff, vil visuell inspeksjon av celler bekrefte merket uptake (figur 1). Automatisert fluorescerende målinger vil spore overføring som cellene transitt på undersiden av sette over tid. Disse dataene viser tydelig en induksjon av celle migrasjon mot MCP-1 og en styrking av dette svaret av serum (figur 2A). Avhengig av styrken vandrende stimulans, er det en forsinkelse på minst 15 minutter før e...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo at JoVE.com

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Kvantifisere menneskelige Monocyte Chemotaxis In Vitro og Murine lymfocytt menneskehandel Vivo

Protokoller for kvantitativ vurdering av lymfocytt chemotaxis og migrasjon er viktige verktøy for immunologi forskning. Her, er en i vitro protokoll beskrevet at tillatelser sanntid, multiplekset evaluering av celle migrasjon og en utfyllende i vivo teknikk aktivere sporing av innfødte celler milten.

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infeksjon modell for å studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 interaksjoner i Human Primary monocytt-deriverte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analysen for å måle Neutrophil vedheft til Aktiverte primære humane mikrovaskulær endotelceller under statiske betingelser

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyttisolasjonsmetoder fra menneskelig hud for fenotypeanalyser og<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

Måling granulocytt og Monocyte Fagocytose og Oksidativt Burst Aktiviteten i Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymfocytter Merking av<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-antistoff Reseptor for målretting<em&gt; In Vivo</em&gt; Celletrafikken av PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse av lymfocytt-ekstravasasjon ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det menneskelige blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolasjon og In Vitro kultur Murine og menneskelig Alveolar makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

Samtidige studie av rekrutteringen av Monocyte subpopulasjoner Under flyt In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Kvantifisering av monocytt chemotactic aktivitet in vivo og karakterisering av Blood monocytt avledet makrofager

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...