Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

كان يدعمها هذا العمل في سنغافورة وزارة التعليم (وزارة التربية والتعليم) المستوى 1 (RGT3/13 و RG42/15 للمقاول) ووزارة التربية والتعليم المستوى 2 (MOE2013-T2-2-024 و MOE2015-T2-1-028 للمقاول).

قدم طلب براءة (بات/179/14/15/PCT) استناداً إلى الأعمال التي ذكرت هنا.

ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية المزدوجة-ربط الحمض النووي الريبي (مثلاً، 10-الصرف) هي جزيئات متوسطة الحجم، ويمكن أن تظهر هكذا تحول التنقل الغرواني الكهربي عند الربط للكشف مع حجم مماثل أو أكبر قليلاً (مثلاً، 50-مير أو أصغر). إذا الجيش الملكي النيبالي أكبر بكثير من السلطة الوطنية الفلسطينية، قد لا تعمل المعايرة للسلطة الوطنية الفلسطينية في الجيش الملكي النيبالي بسبب تحول تنقل جل محدودة. وبالتالي، قد يتم اقتطاعها كبير الجيش الملكي النيبالي لفحوصات الصفحة غير يشوه. المعايرة الحمض النووي الريبي الكبيرة إلى السلطة الوطنية الفلسطينية المسماة فلوروفوري يسمح برصد تشكيل ثلاثي غير يشوه [اغروس] هلام مع العينة محملة في وسط جل40.
لتجربة معايرة بصفحة غير يشوه بتركيز مجموع ثابت من الجيش الملكي النيبالي، نستخدم عادة بتركيز الحمض النووي الريبي غير مسمى من 1 ميكرومتر لتلطيخ كفاءة وظيفة حرة الجيش الملكي النيبالي وعصابات ثلاثي اثيديوم بروميد. كما قد تكون بتركيز الحمض النووي الريبي منخفضة تصل إلى 0.2 ميكرون كافية اعتماداً على بنية الحمض النووي الريبي31. تمركز الجيش الملكي النيبالي غير مسمى (0.2 ميكرومتر) يحدد أند كالقيم التي يمكن أن تقاس بدقة عن 0.2 ميكرون أو أكبر. يمكن استخدام الأصباغ المصبوغة الأخرى لتعزيز كفاءة المصبوغة. وبدلاً من ذلك، لدينا معطيات غير منشورة تشير إلى أن Cy3 صبغ المسمى الكشف يمكن استخدامها في صفحة غير يشوه تجارب لقياس الأحداث ملزم ضيق.
يرجع ذلك إلى حقيقة أن 2-أمينوبوريني فقط معتدلة الفلورسنت، أيضا محدودة بالقياس للربط مع القيمد كقريبة أو فوق 0.2 ميكرون312-أمينوبوريني fluorescence المعايرة. الجيش الملكي النيبالي أو السلطة الوطنية الفلسطينية قد يكون المسمى مع صبغة زاهية نسبيا للتحديد الكمي ملزم ضيق نسبيا في الحل من خلال المعايرة الأسفار، إذا كان الربط يؤدي إلى تغييرات في الأسفار إشارات53،54، 55.
تم اختبار استراتيجية تستهدف هياكل الحمض النووي الريبي بالمحميات دسرنا الملزمة لعدد محدود من الكشف. ومن المرجح أن ربط خصائص قد تختلف عن دسرناس مع تركيبات مختلفة من تسلسل وزوج قاعدي. قد تختار واحدة دائماً حبلا الغنية البيورين من الوجهين لتصميم تفبناس. من الأهمية بمكان أن نفهم كيف على التوالي Q· ج-ز ثلاثية قد يؤثر على استقرار ثلاثي. وضوح أكثر شمولاً تعتمد على تسلسل الدراسات مطلوبة لفهم خصائص الربط تعتمد على تسلسل تفبناس.
يمكن زيادة تعزيز تقارب ملزم من تفبناس بزيادة الطول و/أو مواصلة تعديل القواعد والعمود الفقري56،57 من تفبناس. ومع ذلك، منطقة الطباعة على الوجهين مستمر قد لا تتكون غالباً من أكثر من 10 أزواج قاعدة متتالية دون انقطاع بهياكل غير واتسون-كريك. واحد قد متزاوجة تفبناس مع جزيئات صغيرة للاعتراف بالهياكل غير واتسون-كريك المتاخمة لمناطق دسرنا. من حيث المبدأ، يتوقع المتقارن جزيء تفبنا صغيرة تعزيز تقارب ملزم وخصوصية بالمقارنة إلى تفبنا أو جزيء الصغيرة وحدها. ومع ذلك، الخصائص الكيميائية والفيزيائية للرابط لتصريف58،،من5960،61،62،63،64 يجب أن يكون الأمثل.
حقيقة أن ربط تفبناس بشكل انتقائي إلى دسرناس أكثر من سرناس ودسدناس تشير إلى أنه من الممكن تطوير تفبناس كمجسات كيميائية مفيدة جداً ويغاندس العلاجية المحتملة من خلال تنظيم ديناميات هيكلية الجيش الملكي النيبالي والتفاعلات مع البروتينات ونواتج الأيض. ويمكن تسهيل امتصاص الخلوية من تفبناس من خلال الاقتران باختراق الخلية مويتيس مثل الجزيئات الصغيرة، الببتيدات، وجسيمات نانوية، أو كومبليكسيشن مع هياكل supramolecular مثل الدهنية5،6 12، ،،من1731،25،41،،من6566. كذلك الروغان تفبناس مع العلامات بيويماجينج مثل فلوروفوريس والنظائر المشعة قد تيسير الكشف عن، التصوير، واستهداف هياكل الحمض النووي الريبي الوظيفية في الكائنات الحية.

الكشف تتضح كالمؤشرات الحيوية الهامة والأهداف العلاجية، نظراً لأوجه التقدم الأخيرة في اكتشافات الأدوار الكشف في اللائحة والحفز للعمليات البيولوجية المتنوعة1،،من23. تقليديا، قد استخدمت العقاقير خيوط لربط سرناس من خلال واتسون-كريك تشكيل الطباعة على الوجهين3،4،5،6،،من78، 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27-في الآونة الأخيرة، وقد صممت تشكيل ثلاثي الببتيد الأحماض النووية (تفبناس) لربط دسرناس عن طريق الهيدروجين هوجستين الرابطة (الشكل 1)3،،من2829. مناطق دسرنا موجودة في أغلبية الكشف antisense استهدف التقليدية، ما فيها قبل مرناس مرناس، ما قبل أو pri-ميرناس3والعديد من أخرى غير الترميز الكشف1،،من2627. استهداف دسرناس من خلال تشكيل اللولب ثلاثية باستخدام تفبناس قد يكون مفيداً بسبب خصوصيته الهيكل وذات إمكانات كبيرة لاستخدامها في استعادة الوظائف الطبيعية للكشف، وهي dysregulated في الأمراض، على سبيل المثال.
نشرت مؤخرا العمل بواسطة روزنيرس et al.، ولنا3،،من2829،30،31،،من3233، 34،35،36،37،،من3839،،من4041، أفادت الجهود على تحسين ربط تفبناس معدلة نحو دسرناس مع تعزيز تقارب انتقائية. قمنا بتطوير أساليب توليف للسلطة الوطنية الفلسطينية مصممة بطريقة رشيدة مونومرات (الشكل 2) بما في ذلك مونومر الايثير-بسيودويسوسيتوسيني (L)30 و 5-ميثيل تعديل غوانيدين السيتوزين (Q) مونومر31. من خلال مختلف أساليب توصيف البيوكيميائية والفيزيائية، لقد أظهرنا أن المحميات قصيرة نسبيا (6-10 البقايا) تضم بقايا L و Q إظهار تحسين الاعتراف بأزواج قاعدة واتسون-كريك ز-ج وج-ز، على التوالي، في دسرناس. وعلاوة على ذلك، مقارنة بغير معدلة المحميات، المحميات التي تحتوي على بقايا L و Q إظهار ملزمة أكثر انتقائية تجاه دسرنا سرنا ودسدنا. تمكن وظيفة غوانيدين42 في قاعدة ف المحميات لإدخال خلايا هيلا31.
في المختبر، ونحن توليف المحميات بدليل بنك الصين-الكيمياء ( tأو بنك-بنك الصين من أجلها ثالثي-بوتيلوكسيكاربوني (انظر الشكل 2) الببتيد الصلبة-مرحلة التوليف الأسلوب4. توليف مركب السلطة الوطنية الفلسطينية مع بنك الصين كأمين حماية الفريق ملاءمة مجموعة بنك الصين ستيريكالي أقل حجماً بالمقارنة مع أمين فلورينيلميثيلوكسيكاربونيل (معتدلاً) حماية الفريق، الذي قد يكون مفيداً خلال مونومر السلطة الوطنية الفلسطينية اقتران دعم متين. مجموعة بنك الصين هو حمض مجا ويمكن إزالتها بسهولة على دعم متين من 20-50% حمض تريفلورواسيتيك (تفا) في الميثان (DCM) خلال التوليف السلطة الوطنية الفلسطينية. يمكن أن تستخدم المزج الآلي ببتيد لتوليف ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية؛ ومع ذلك، الزائدة 3-5-إضعاف للسلطة الوطنية الفلسطينية مونومر الحاجة إلى المزج الآلي ببتيد. التوليف اليدوي يتطلب أقل بشكل ملحوظ مونومر السلطة الوطنية الفلسطينية (2-3-إضعاف الزائدة)، مع اقتران كل تخضع بسهولة لاختبار كايزر43. وعلاوة على ذلك، العديد من المزج الآلي غير متوافقة مع التوليف استراتيجية بنك الصين بسبب استخدام أكالة تفا أثناء الخطوة إزالة بنك الصين.
يمكن تنقية ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية بعكس مرحلة عالية الأداء اللوني السائل (RP-[هبلك]) يليه وصف الوزن الجزيئي باستخدام TOF (3 أرقام و 4)30، 31-نحن نوظف غير يشوه صفحة لرصد تشكيل ثلاثي، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن الحرة الحمض النووي الريبي مزدوج بنيات والسلطة الوطنية الفلسطينية ملزمة تريبليكسيس غالباً ما تظهر الهجرة مختلف معدلات (الشكل 5)30،31 . لا وسم ضروري إذا أمكن تحقيق كفاءة بعد تلطيخ لكل من الجيش الملكي النيبالي المزدوجة و PNA· الجيش الملكي النيبالي2 ثلاثي العصابات. كمية صغيرة نسبيا من عينة المسبق للتجارب غير يشوه الصفحة. ومع ذلك، في مخازن التحميل (الحضانة) والمخازن المؤقتة قيد التشغيل (درجة الحموضة 8.3) قد لا تكون نفسه، أسفر عن القياسات التي تقتصر على تريبليكسيس كينيتيكالي مستقرة، لأنه قد زعزعة درجة حموضة مرتفعة نسبيا من 8.3 إلى حد كبير ثلاثي.
2-أمينوبوريني ايزومير الأدنين (6-أمينوبوريني)؛ كثافة الأسفار 2-أمينوبوريني (مع ذروة انبعاثات في حوالي 370 نانومتر) حساس للتغيرات البيئة الهيكلية المحلية، وهي مناسبة لرصد تشكيل ثلاثي مع بقايا 2-أمينوبوريني القرب من السلطة الوطنية الفلسطينية ملزمة (الموقع الرقم 6) 31-على عكس العديد من الأصباغ الأخرى التي تظهر الأسفار الانبعاثات في النطاق المرئي، يمكن أن يتعرض الجيش الملكي النيبالي 2-أمينوبوريني-المسمى إلى غرفة الخفيفة دون تبييض الصورة. خلافا لتجربة الصفحة التي غالباً ما تحتاج إلى تشغيل المخزن مؤقت للأس الهيدروجيني 8.3، معايرة الأسفار 2-أمينوبوريني على أساس يسمح بقياس ملزمة في حل واحد في الرقم الهيدروجيني محدد، ومما قد يسمح بالقياس والكشف عن ضعيفة نسبيا و كينيتيكالي غير مستقر ملزم في التوازن.
تجارب الصهر الحراري الكشف عن امتصاص الأشعة فوق البنفسجية تسمح بقياس الثبات الحراري الدوبلكس (الشكل 7)31 وثلاثيللصفيف من نوع plex30،32،،من4445. اعتماداً على تكوين الطول والتسلسل، ذوبان تريبليكسيس قد أو قد لا تظهر تحولاً واضحا. ويمكن الحصول على معلمات دينامي حراري إذا تراكب منحنيات التدفئة والتبريد. ويمكن الحصول على معلمات دينامي حراري دقيقة بمعايرة متحاور القياس (ITC)32؛ ومع ذلك، كميات كبيرة نسبيا من عينات مطلوبة عموما لمركز التجارة الدولية.

<table style="border-collapse:collapse;width:491pt" width="654">
	<colgroup>
		<col style="width:176pt" width="235" />
		<col style="width:116pt" width="155" />
		<col span="3" style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl25" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl74" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">87956</td>
			<td style="width:66pt" width="88"></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&#376;HCl)</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl68" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">532444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B25251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acetic anhyride</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Kaiser Test Kit&#160;</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L06374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Unmodified PNA monomers</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">ASM Research Chemicals GmbH</td>
			<td class="xl70" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B8389 / 47624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Thioanisole</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoromethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A10173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">LiChrosper&#174; 100 RP-18 endcapped (5 &#181;m) LiChroCART&#174; 250-4</td>
			<td class="xl41">Merck Millipore</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">150838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">RNA Oligos&#160;</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">Customized&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">39468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td class="xl41">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">J15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">HEPES&#160;</td>
			<td class="xl41">Lonza</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N.N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">146072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td>
			<td class="xl41">1st Base</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">BUF-3010-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Glycerol&#160;</td>
			<td class="xl45">Promega&#160;</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">H5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethidium bromide (10 mg/mL)</td>
			<td class="xl45">Bio-rad&#160;</td>
			<td class="xl64" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl48" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td>
			<td class="xl49">Hellma Analytics&#160;</td>
			<td class="xl61" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">105.250-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

الكشف تتضح كالمؤشرات الحيوية الهامة والأهداف العلاجية. وهكذا، هناك إمكانات كبيرة في تطوير المجسات الكيميائية والعلاجية يغاندس للاعتراف بتسلسل الحمض النووي الريبي والهيكل. تعديل الببتيد الحمض النووي (السلطة الفلسطينية) ووضعت مؤخرا ليغومرات التي يمكن التعرف على الحمض النووي الريبي الدوبلكس بطريقة خاصة بتسلسل كيميائيا. المحميات مستقرة كيميائيا مع العمود الفقري مثل الببتيد محايدة. المحميات يمكن توليفها نسبيا بسهولة ببنك الصين-الكيمياء الببتيد الصلبة-مرحلة التوليف الأسلوب اليدوي. يتم تنقيتها المحميات بعكس المرحلة [هبلك]، يليه وصف الوزن الجزيئي بالليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين-وقت الرحلة (استخدام-TOF). تقنية التفريد (صفحة) polyacrylamide هلام يشوه عدم يسهل تصوير تشكيل ثلاثي، حيث مصممة بعناية مجانية الرنا المزدوجة بنيات والسلطة الوطنية الفلسطينية ملزمة تريبليكسيس غالباً ما تظهر معدلات الهجرة المختلفة. عدم يشوه الصفحة مع اثيديوم بروميد وظيفة تلطيخ غالباً أسلوب سهلة وغنية بالمعلومات لوصف الانتماءات الملزمة وخصوصيات ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية. عادة، يمكن استخدام الحمض النووي الريبي دبابيس الشعر أو الدوبلكس مع الطفرات زوج قاعدي واحدة متعددة لتوصيف خصائص ربط السلطة الوطنية الفلسطينية، مثل ربط الصلات وخصوصياتها. 2-أمينوبوريني ايزومير الأدنين (6-أمينوبوريني)؛ كثافة الأسفار 2-أمينوبوريني حساس للتغيرات البيئة الهيكلية المحلية، وهي مناسبة لرصد تشكيل ثلاثي مع بقايا أمينوبوريني 2 أدرجت قرب موقع ربط السلطة الوطنية الفلسطينية. 2-أمينوبوريني fluorescence المعايرة يمكن استخدامها أيضا لتأكيد انتقائية ملزمة للمحميات معدلة نحو الكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل المستهدفة (دسرناس) على واحد--الذين تقطعت بهم السبل الكشف (سرناس). تجارب الصهر الحراري الكشف عن امتصاص الأشعة فوق البنفسجية تسمح بقياس الثبات الحراري للسلطة الوطنية الفلسطينية-الجيش الملكي النيبالي الدوبلكس و PNA· الجيش الملكي النيبالي تريبليكسيس2 . هنا، يمكننا وصف التوليف وتنقية ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية تتضمن تعديل المخلفات، ووصف الطرق البيوكيميائية والفيزيائية لتوصيف للاعتراف بالجيش الملكي النيبالي الدوبلكس بالمحميات معدلة.

[هبلك] عكس المرحلة يتيح تنقية ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية. يمكننا الحصول على نقي ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية بجولتين من تنقية [هبلك] (الشكل 3). يمكن تأكيد هوية المحميات بتحليل استخدام TOF (الشكل 4).
عدم يشوه الصفحة تقنية سهلة وغنية بالمعلومات لوصف الانتماءات الملزمة وخصوصيات ليغومرات السلطة الوطنية الفلسطينية. ونحن عادة استخدام متعددة من الحمض النووي الريبي دبابيس الشعر أو الدوبلكس مع الطفرات واحد زوج قاعدي لتوصيف خصائص الربط (الشكل 5). غير يشوه صفحة البيانات هو موضح في الشكل 5 تشير بوضوح أن س-L-تعديل والسلطة الوطنية الفلسطينية يمكن التعرف على منطقة دسرنا مع زوج ج-ز (الشكل 5بمن اللوحة السفلية) لكن لا أحد دون زوج ج-ز (الشكل 5بمن أعلى الفريق). هذا الاعتراف محددة وتعزيز من خلال T· أ-يو، L· ز-C، و Q· ج-ز PNA· الجيش الملكي النيبالي2 تشكيل قاعدة ثلاثية (الشكل 1أ، ج، د). قد تستعمل أيضا المحميات المختلفة مع الطفرات مفردة أو متعددة لإظهار خصائص محسنة ملزمة تعديل السلطة الوطنية الفلسطينية. وقد أظهرنا أن إضافة 2 مم Mg2 + في المخزن المؤقت للحضانة لا يؤثر في الربط إلى حد كبير31.
لقد أظهرنا بمعايرة الأسفار 2-أمينوبوريني الذي يربط بين السلطة الوطنية الفلسطينية تعديل ف ول المنطقة المستهدفة دسرنا (الشكل 6أ، ج 6، 6 د) ولكن لا سرنا (الشكل 6ب، 6E 6F). السلطة الوطنية الفلسطينية P3 يربط دسرنا 2-أمينوبوريني-المسمى بقيمة 0.8 ± 0.1 ميكرومترد ك. كثافة الفلورية في 370 نانومتر لسرنا 2-أمينوبوريني-المسمى تظل ثابتة نسبيا مع تركيز P3 المتنوعة، مما يشير إلى عدم وجود ربط P3 السلطة الوطنية الفلسطينية إلى سرنا.
المحميات التي تحتوي على عرض البقايا (P2 و P3) Q الحرارية لا انصهار التحولات (الشكل 7)، مما يوحي لا ربط لسرنا. هذا سبب الصدام الفراغية موجودة في واتسون-كريك مثل زوج س-ز. مقارنة بغير معدلة السلطة الوطنية الفلسطينية P1، تعديل P4 المحميات و P5 التي تحتوي على بقايا L ولكن لا توجد بقايا ف، إظهار انخفضت درجات الحرارة ذوبان الدوبلكس الجيش الملكي النيبالي-السلطة الوطنية الفلسطينية المقابلة بسبب اشتباك الفراغية موجودة في واتسون-كريك مثل زوج لز. البيانات الصهر الحراري الكشف عن امتصاص الأشعة فوق البنفسجية تتسق مع البيانات المعايرة الأسفار 2-أمينوبوريني، والتي تظهر أيضا أن السلطة الوطنية الفلسطينية التي تحتوي على مخلفات ف ول لا ربط سرنا ملحوظ (الشكل 6ب، 6E 6F). تتضمن قاعدة ف زعزعة الاستقرار أكثر من قاعدة للأم، قاعدة ف حدث اشتباك الفراغية أكثر أهمية في تشكيل زوج واتسون-كريك-مثل فز (الشكل 1و) بالمقارنة مع زوج واتسون-كريك-مثل لام-ز (الشكل 1ه ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
الشكل 1 : الهياكل الكيميائية هياكل مستقرة قاعدة ثلاثية وغير مستقرة زوج قاعدي. (أ-د) PNA· الرئيسية--الاخدود الجيش الملكي النيبالي2 قاعدة ثلاثة أمثاله من T· أ-U ()، ج+· ز-ج (ب)، L· ز-ج (C)، و Q· ج-ز (د). (ه، و) غير مستقرة واتسون-كريك مثل السلطة الوطنية الفلسطينية-الجيش الملكي النيبالي قاعدة أزواج لز (ه) وفز (F). ويمثل الحرف R السكر – فوسفات العمود الفقري للجيش الملكي النيبالي. الإشارة السندات الهيدروجين بواسطة خطوط متقطعة سوداء. ويرد هذا الرقم من مرجع31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
الشكل 2 : الهياكل الكيميائية للسلطة الوطنية الفلسطينية مونومرات. تظهر أربعة مونومرات السلطة الوطنية الفلسطينية (ر، ج ول و Q). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
الشكل 3 : التركيب الكيميائي أوليجومير السلطة الوطنية الفلسطينية وتنقية بالبرنامج العادي [هبلك]- (أ) التركيب الكيميائي لتسلسل السلطة الوطنية الفلسطينية P3. (ب، ج) بيانات RP-[هبلك] من النفط الخام السلطة الوطنية الفلسطينية P3 (ب) وإعادة تنقية P3 السلطة الوطنية الفلسطينية (ج). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
الشكل 4 : TOF استخدام الطيف لتنقية السلطة الوطنية الفلسطينية P3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
الشكل 5 : دبوس الجيش الملكي النيبالي وتسلسل السلطة الوطنية الفلسطينية وتوصيف ملزم بغير يشوه الصفحة. (أ) الجيش الملكي النيبالي دبابيس الشعر (rHP1 و rHP2)، P3 السلطة الوطنية الفلسطينية، و PNA· تشكيل الجيش الملكي النيبالي2 ثلاثي بين السلطة الوطنية الفلسطينية P3 و rHP2. (ب) عدم يشوه الصفحة (12 في المائة) نتائج rHP1 و rHP2 ملزم للسلطة الوطنية الفلسطينية P3. المخزن المؤقت الحضانة 200 ملم كلوريد الصوديوم، 0.5 مم يدتا، 20 مم حبيس، درجة الحموضة 7.5. دبابيس الشعر تحميل الجيش الملكي النيبالي (rHP1 و rHP2) على 1 ميكرومتر في 20 ميليلتر. السلطة الوطنية الفلسطينية وتركيزات في الممرات من اليسار إلى اليمين هي 0، 0.2، 0.4، 1، 1.6، 2، 4، 10، 16، 20، 28، 50 ميكرومتر. P3 السلطة الوطنية الفلسطينية عدم ربط rHP1 بربط (اللوحة العلوية) لكن rHP2 (أسفل اللوحة). (ج) كد عزم للربط P3 ل rHP2. وكان رسم جزء صغير تشكيل ثلاثي (Y) مقابل تركيز السلطة الوطنية الفلسطينية. هذا الرقم مقتبس من مرجع31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
الرقم 6 : دراسة المعايرة fluorescence P3 السلطة الفلسطينية ملزمةللكشف 2-أمينوبوريني-المسمى. '2' في تسلسل الحمض النووي الريبي يعين بقايا 2-أمينوبوريني. المخزن المؤقت الحضانة 200 ملم كلوريد الصوديوم، 0.5 مم يدتا، 20 مم حبيس، درجة الحموضة 7.5. (أ) PNA· تشكيل الجيش الملكي النيبالي2 ثلاثي بين P3 ودسرنا 2-أمينوبوريني-المسمى (dsRNA2-2AP). (ب) افتراضية السلطة الوطنية الفلسطينية-الحمض النووي الريبي مزدوج شكلت بين P3 وسرنا 2-أمينوبوريني-المسمى (ssRNA2-2AP). (ج، ه) أطياف الانبعاث الأسفار 2-أمينوبوريني--يسمى الرنا المزدوجة (1 ميكرومتر) وسرنا (1 ميكرومتر)، على التوالي، مع تفاوت تركيز P3 في درجة الحموضة 7.5. الذروة في حوالي 475 نيوتن متر سبب انبعاث fluorescence ضعف قاعدة L في السلطة الوطنية الفلسطينية. (د، و) ك يستند تحديد د قطع 2-أمينوبوريني fluorescence كثافة (في 370 نانومتر) من الحمض النووي الريبي مزدوج وسرنا، على التوالي، مقابل تركيز P3 السلطة الوطنية الفلسطينية. هذا الرقم مقتبس من مرجع31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
الشكل 7 : الحراري ذوبان النتائج للجيش الملكي النيبالي-السلطة الوطنية الفلسطينية الدوبلكس- المخزن المؤقت الحضانة 200 ملم كلوريد الصوديوم، 0.5 مم يدتا، 20 مم نة2بو4، درجة الحموضة 7.5. جميع العينات تحتوي على 5 ميكرومتر واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي (ssRNA1) والسلطة الوطنية الفلسطينية في واحد--الذين تقطعت بهم السبل رنا 130 ميليلتر. (A) (ssRNA1) والمحميات (P1 و P2، P3, P4 و P5) والوجهين السلطة الوطنية الفلسطينية-الجيش الملكي النيبالي افتراضية شكلت بين السلطة الوطنية الفلسطينية P3 و ssRNA1 في اتجاه مواز. يشار الصدام الفراغية لواطسون-كريك مثل فز وأزواج لز. انصهار (ب) منحنيات للمحميات المختلفة الملزمة إلى ssRNA1. يتم عرض درجات الحرارة ذوبان للمنحنيات مع ذوبان التحولات. هذا الرقم مقتبس من مرجع31.

Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

الاعتراف الخاصة بتسلسل وانتقائية بالكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل على الكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل بتعديل كيميائيا الببتيد الأحماض النووية

نحن تقرير البروتوكولات للتوليف وتنقية ليغومرات الببتيد الأحماض النووية (السلطة الفلسطينية) التي تتضمن تعديل للمخلفات. ويرد وصف أساليب البيوكيميائية والفيزيائية لوصف الاعتراف بالجيش الملكي النيبالي الدوبلكس بالمحميات معدلة.

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

تسليم الأحماض النووية من خلال حقن مكروي الأجنة في مكافحة الحشرات الحشرات الزراعية العالمية،<em&gt; آفة Ceratitis الرؤيسية</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

اقترانية التزاوج فحوصات لتحليل تسلسل محدد من البروتينات نقل تشارك في الإقتران البكتيرية

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل،<em&gt; Dermestes المبقعة</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

القوة الذرية المجهري التحقيقات من الحمض النووي الآفة الاعتراف في إصلاح ختان النوكليوتيدات

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

وسم الأيضية والتنميط لنقل الكشف باستخدام ماكروارايس

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

الخلية على أساس فحوصات للكشف التي يمكن أن تعزز على وجه التحديد مرناً الترجمة غير الترميز سينيوب

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

3 '-تيرميني وتسلسل الجزيئات الوليدة الدنا الفيروسي واحد-الذين تقطعت بهم السبل أثناء فيروس نقص المناعة البشرية-1 تحديد عكس النسخ في الخلايا المصابة

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overexpressing الكشف فضله منذ فترة طويلة باستخدام الجينات-تفعيل كريسبر

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

في المختبر الاختبارات البيوكيميائية باستخدام تسميات البيوتين لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

الحمض النووي عالي الكثافة وmicroarrays RNA - التوليف الضوئي، والتهجين وإعداد مكتبات الأحماض النووية الكبيرة

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...