Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Singapore Ministeriet for uddannelse (MOE) Tier 1 (RGT3/13 og RG42/15-G.C.) og MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 og MOE2015-T2-1-028 til G.C.).

En patentansøgning (PAT/179/14/15/PCT) baseret på det arbejde, der er rapporteret her er indgivet.

RNA duplex-bindende PNA oligomerer (f.eks, 10-mers) er mellemstore molekyler og dermed kan vise elektroforese mobilitet Skift ved binding til RNA'er med en sammenlignelig eller lidt større størrelse (fx, 50-mer eller mindre). Hvis en RNA er betydeligt større end PNA, kan titrering af PNA i RNA ikke arbejde på grund af en begrænset gel mobilitet Skift. Således, den store RNA kan afkortes for ikke-denatureringen side assays. Titrering af en stor RNA i en fluorophore-mærket PNA giver mulighed for overvågning af triplex dannelsen af en ikke-denatureringen agarosegel med eksemplet indlæses i midten af gel40.
For en titrering eksperiment af ikke-denatureringen side med en konstant total koncentration af RNA bruger vi typisk en umærket RNA-koncentration på 1 µM til effektiv post farvning af gratis RNA og triplex bands af ethidiumbromid. En RNA koncentration så lavt som 0,2 µM kan også være tilstrækkelige afhængigt af RNA konstruere31. Koncentrationen af den umærkede RNA (0,2 µM) bestemmer, at Kd værdier, der kan måles præcist bør være omkring 0,2 µM eller større. Andre farvning farvestoffer kan bruges til at effektivisere farvning. Alternativt, vores ikke-offentliggjorte data tyder på, at Cy3 dye-mærket RNA'er kan anvendes til ikke-denatureringen side forsøg til at måle tight bindende begivenheder.
At 2-aminopurine er kun moderat fluorescerende, er 2-aminopurine fluorescens titrering også begrænset til måling af bindende med Kd værdier tæt på eller over 0,2 µM31. RNA eller PNA kan være mærket med en forholdsvis lys farve til kvantificering af en forholdsvis stram bindende løsning gennem fluorescens titrering, hvis bindende resulterer i ændringer i fluorescens signaler53,54,, 55.
Strategien med at målrette RNA strukturer af dsRNA-bindende PNAs er blevet testet for et begrænset antal RNA'er. Det er sandsynligt, at bindende egenskaber kan variere for dsRNAs med forskellige sekvenser og basepar kompositioner. Man kan altid vælge purin-rige strand af en duplex for udformningen af TFPNAs. Det er vigtigt at forstå, hvordan træk Q· C-G tredobler kan påvirke stabiliteten i en triplex. Mere omfattende sekvens-afhængige undersøgelser er klart behov for at forstå sekvens-afhængige bindende egenskaber af TFPNAs.
Bindende affinitet af TFPNAs kan forbedres yderligere ved at øge længden og/eller yderligere ændring af baser og rygbenet56,57 af TFPNAs. Men en kontinuerlig duplex region må ikke ofte bestå af mere end 10 på hinanden følgende basepar uden forstyrrelsen af ikke-Watson-Crick strukturer. Man kan konjugerede TFPNAs med små molekyler til anerkendelse af ikke-Watson-Crick strukturer støder op til dsRNA regioner. I princippet forventes en TFPNA-lille molekyle konjugat at have forbedret bindende affinitet og specificitet i forhold til en TFPNA eller lille molekyle alene. Imidlertid de kemiske og fysiske egenskaber af linker til konjugation58,59,60,61,62,63,64 skal optimeres.
Det faktum, at TFPNAs kan selektivt binde til dsRNAs over ssRNAs og dsDNAs antyder, at det er muligt at udvikle TFPNAs som meget nyttige kemiske sonder og potentielle terapeutiske ligander gennem regulering af RNA strukturdynamik og interaktioner med proteiner og metabolitter. Cellulære optagelse af TFPNAs kan lettes gennem konjugering med celle-gennemtrængende fraspaltning som små molekyler, peptider, og nanopartikler eller kompleks med Supramolekylær strukturer såsom Liposomer5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Yderligere kan functionalization af TFPNAs med bioimaging tags som fluorophores og radioisotoper lette afsløringen, billedbehandling, og målretning af funktionelle RNA strukturer i levende organismer.

RNA'er fremvækst som vigtige biomarkører og terapeutiske mål, på grund af de seneste fremskridt i opdagelser af RNA'er roller i forordningen og katalyse af forskellige biologiske processer1,2,3. Traditionelt, har antisense-strenge været brugt til at binde til ssRNAs gennem Watson-Crick duplex dannelse3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. for nylig, triplex-dannende peptid nukleinsyrer (TFPNAs) er blevet designet til at binde til dsRNAs via Hoogsteen brint limning (figur 1)3,28,29. dsRNA regioner er til stede i fleste af de traditionelle antisensstoffer-målrettet RNA'er, herunder pre-mRNAs og mRNAs, før eller pri-miRNAs3, og mange andre ikke-kodende RNA'er1,26,27. Målretning dsRNAs gennem triple helix dannelse ved hjælp af TFPNAs kan være en fordel på grund af dens struktur specificitet og er med stort potentiale for brug i genoprette de normale funktioner af RNA'er, som er dysregulated i sygdomme, f.eks.
Den nyligt offentliggjorte arbejde af Rozners et al., og os3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, rapporterede bestræbelser på at forbedre selektiv bindingen af modificerede TFPNAs mod dsRNAs med øget affinitet. Vi har udviklet syntese metoder for rationelt designet PNA monomerer (figur 2), herunder thio-pseudoisocytosine (L) monomer30 og guanidin modificerede 5-methyl cytosin (Q) monomer31. Gennem forskellige biokemiske og biofysiske karakterisering metoder, har vi bevist, at relativt korte PNAs (6-10 restkoncentrationer) indarbejde L og Q restkoncentrationer vis forbedret anerkendelse af Watson-Crick G-C og C-G basepar, henholdsvis i dsRNAs. Derudover Vis sammenlignet med umodificerede PNAs, PNAs med L og Q restkoncentrationer mere selektive bindende mod dsRNA over ssRNA og dsDNA. Guanidin funktionalitet42 i Q base giver PNAs at indtaste HeLa celler31.
I vores laboratorium, vi syntetisere PNAs af den manuelle Boc-kemi (Boc eller t- Boc står for tert-butyloxycarbony (Se figur 2) faststadie syntese metode4. Syntesen af PNA monomer med Boc som Amin beskytte gruppe er praktisk som gruppen Boc er sterically mindre pladskrævende i forhold til fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Amin beskytte gruppe, som kan være gavnlige i PNA monomer kobling den solid støtte. Gruppen Boc er syre-labil og kan nemt fjernes med solid støtte ved 20-50% trifluoreddikesyre (TFA) i dichlormethan (DCM) under PNA syntese. En automatiseret peptid synthesizer kan være ansat til at syntetisere PNA oligomerer; dog er 3-5-fold overskydende af PNA monomer behov for en automatiseret peptid synthesizer. Manuel syntese kræver betydeligt mindre PNA monomer (2-3-fold overskydende), med hver kobling let overvåges af Kaiser test43. Desuden, mange automatiserede synthesizere er ikke kompatible med Boc strategi syntesen fra anvendelse af ætsende TFA under Boc fjernelse trin.
PNA oligomerer kan renses ved omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC) efterfulgt af molekylvægt karakterisering af MALDI-TOF (figur 3 og 4)30, 31. vi ansætter ikke-denatureringen side at overvåge triplex dannelse, skyldes, at frie RNA duplex konstruktioner og PNA bundet triplexes ofte viser forskellige migration satser (figur 5)30,31 . Ingen mærkning er nødvendig, hvis effektive efter farvning kan opnås for begge RNA duplex og PNA· RNA2 triplex bands. En forholdsvis lille mængde af prøven er nødvendig for ikke-denatureringen side eksperimenter. Dog kan lastning (inkubation) buffere og de kører buffere (pH 8.3) ikke være det samme, hvilket resulterer i målinger er begrænset til de kinetisk stabil triplexes, fordi en relativt høj pH-værdi på 8,3 kan betydeligt destabilisere en triplex.
2-Aminopurine er en isomer af adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescens intensitet (med en emission peak på omkring 370 nm) er følsomme over for lokale strukturelle ændringer, og er velegnet til overvågning af triplex dannelse med 2-aminopurine resten indarbejdet i nærheden af PNA bindende () websted Figur 6) 31. i modsætning til mange andre farvestoffer, der viser fluorescens emission i det synlige spektrum, 2-aminopurine-mærket RNA kan blive udsat for rumbelysning uden foto blegning. I modsætning til side eksperiment, hvor en kørende buffer til pH 8.3 er ofte nødvendig, 2-aminopurine baseret fluorescens titrering tillader måling af bindende i én løsning ved en bestemt pH, og således kan tillade måling og registrering af relativt svag og kinetisk ustabil binding ved ligevægt.
UV-absorbans-fundet termisk smeltende eksperimenter tillader måling af termisk stabilitet dobbelthuse (figur 7)31 og triplexes30,32,44,45. Afhængigt af længden og sekvens sammensætning, smeltning af triplexes kan eller kan ikke vise en tydelig overgang. Termodynamiske parametre kan fås, hvis opvarmning og afkøling kurver overlapper hinanden. Nøjagtig termodynamiske parametre kan fås af isotermisk titrering kalorimetri (ITC)32; dog er forholdsvis store mængder af prøver generelt kræves for ITC.

<table style="border-collapse:collapse;width:491pt" width="654">
	<colgroup>
		<col style="width:176pt" width="235" />
		<col style="width:116pt" width="155" />
		<col span="3" style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl25" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl74" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">87956</td>
			<td style="width:66pt" width="88"></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&#376;HCl)</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl68" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">532444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B25251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acetic anhyride</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Kaiser Test Kit&#160;</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L06374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Unmodified PNA monomers</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">ASM Research Chemicals GmbH</td>
			<td class="xl70" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B8389 / 47624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Thioanisole</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoromethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A10173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">LiChrosper&#174; 100 RP-18 endcapped (5 &#181;m) LiChroCART&#174; 250-4</td>
			<td class="xl41">Merck Millipore</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">150838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">RNA Oligos&#160;</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">Customized&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">39468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td class="xl41">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">J15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">HEPES&#160;</td>
			<td class="xl41">Lonza</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N.N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">146072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td>
			<td class="xl41">1st Base</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">BUF-3010-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Glycerol&#160;</td>
			<td class="xl45">Promega&#160;</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">H5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethidium bromide (10 mg/mL)</td>
			<td class="xl45">Bio-rad&#160;</td>
			<td class="xl64" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl48" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td>
			<td class="xl49">Hellma Analytics&#160;</td>
			<td class="xl61" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">105.250-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

RNA'er fremvækst som vigtige biomarkører og terapeutiske mål. Der er således stort potentiale i at udvikle kemiske sonder og terapeutiske ligander til anerkendelse af RNA-sekvens og struktur. Kemisk modificerede peptid nukleinsyre (PNA) oligomerer har udarbejdet for nylig, kan genkende RNA dobbelthuse i en sekvens-specifikke måde. PNAs er kemisk stabile med en neutral peptid-lignende rygrad. PNAs kan syntetiseres relativt nemt ved metoden med manuel Boc-kemi faststadie syntese. PNAs er renset med omvendt-fase HPLC, efterfulgt af molekylvægt karakterisering af matrix assisted laser desorption/Ionisation-tidspunktet for flyvning (MALDI-TOF). Non-denatureringen polyacrylamid gel elektroforese (side) teknik letter billeddannelse af triplex dannelsen, fordi omhyggeligt designet gratis RNA duplex konstruktioner og PNA bundet triplexes ofte viser forskellige migration priser. Non-denatureringen side med ethidium bromid post farvning er ofte en nemme og informativ teknik til kendetegner bindende tilhørsforhold og særegenheder af PNA oligomerer. Typisk, flere RNA Hårnåle eller dobbelthuse med enkelt basepar mutationer kan bruges til at karakterisere PNA bindende egenskaber, såsom bindende tilhørsforhold og særpræg. 2-Aminopurine er en isomer af adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescens intensitet er følsomme over for lokale strukturelle ændringer, og er velegnet til overvågning af triplex dannelse med den 2-aminopurine rest indarbejdet i nærheden af PNA bindingssted. 2-Aminopurine fluorescens titrering kan også bruges til at bekræfte den bindende selektivitet af modificerede PNAs mod målrettede dobbelt-strenget RNA'er (dsRNAs) over enkeltstrenget RNA'er (ssRNAs). UV-absorbans-fundet termisk smeltende eksperimenter tillader måling af termisk stabilitet PNA-RNA dobbelthuse og PNA· RNA2 triplexes. Her, vi beskrive syntesen og rensning af PNA oligomerer indarbejde ændrede restkoncentrationer, og beskrive biokemiske og biofysiske metoder til karakterisering af anerkendelse af RNA dobbelthuse af de modificerede PNAs.

Omvendt-fase HPLC giver mulighed for rensning af PNA oligomerer. Vi kan få ren PNA oligomerer med to runder af HPLC rensning (figur 3). PNAs identitet kan bekræftes ved MALDI-TOF analyse (figur 4).
Non-denatureringen side er en nemme og informativ teknik til kendetegner bindende tilhørsforhold og særegenheder af PNA oligomerer. Vi bruger typisk flere RNA Hårnåle eller dobbelthuse med enkelt basepar mutationer til at karakterisere bindende egenskaber (figur 5). Ikke-denatureringen sidedata vist i figur 5 klart foreslå at den Q - og L-ændring af PNA kan genkende en dsRNA region med en C-G par (fig. 5B, nederste panel) men ikke den ene uden en C-G par (fig. 5B, top panel). Denne specifikke og øget anerkendelse er gennem T· A-U, L· G-C og Q· C-G PNA· RNA2 base triple (figur 1A, C, D) dannelse. Forskellige PNAs med én eller flere mutationer kan også bruges til at påvise forbedret bindende egenskaber af en modificeret PNA. Vi har vist, at tilføje 2 mM Mg2 + i inkubation bufferen ikke påvirker bindingen betydeligt31.
Vi har demonstreret ved 2-aminopurine fluorescens titrering, som en Q - og L-ændring PNA binder til en målrettet dsRNA region (figur 6A, 6 C, 6 D) men ikke ssRNA (fig. 6B, 6E 6F). PNA P3 binder sig til den 2-aminopurine-mærket dsRNA med en Kd værdi på 0,8 ± 0,1 µM. Fluorescens-intensiteten på 370 nm for den 2-aminopurine-mærket ssRNA forbliver relativt konstant med varieret P3 koncentration, som angiver manglen binding af PNA P3 til ssRNA.
PNAs indeholdende Q restkoncentrationer (P2 og P3) Vis ingen termisk smeltende overgange (figur 7), foreslår ingen binding til ssRNA. Dette er på grund af sterisk sammenstød stede i Watson-Crick som Q-G par. Sammenlignet med umodificerede PNA P1, PNAs P4 og P5 indeholdende ændret L rester, men ingen Q restkoncentrationer, Vis faldt smeltende temperaturer til de tilsvarende RNA-PNA dobbelthuse på grund af sterisk sammenstød stede i Watson-Crick ligesom L-G par. De UV-absorbans-fundet termisk smeltende data er i overensstemmelse med 2-aminopurine fluorescens titrering data, som viser også, at en PNA med Q og L restkoncentrationer ikke binde til ssRNA mærkbart (figur 6B, 6E 6F). Indarbejde en Q base er mere destabiliserende end en L base, som en Q base har en mere betydelig sterisk sammenstød i dannelsen af en Watson-Crick-lignende Q-G par (figur 1F) i forhold til en Watson-Crick-lignende L-G par (figur 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Figur 1 : Kemiske strukturer af stabil base tredobbelt og ustabile basepar strukturer. (A-D) Major-groove PNA· RNA2 base tripler af T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C), og Q· C-G (D). (E, F) Ustabile Watson-Crick som PNA-RNA basepar af L-G (E) og Q-G (F). Bogstavet R repræsenterer sukker-fosfat rygraden i RNA. Hydrogenbindinger er angivet med sort stiplede linjer. Tallet er gengivet fra reference31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Figur 2 : Kemiske strukturer af PNA monomerer. Fire PNA monomerer (T, C, L og Q) er vist. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Figur 3 : Kemiske struktur af en PNA oligomer og rensning af RP-HPLC. (A) kemiske struktur af PNA sekvens P3. (B, C) RP-HPLC data af rå PNA P3 (B) og igen renset PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Figur 4 : MALDI-TOF spektrum af renset PNA P3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Figur 5 : RNA hårnål og PNA sekvenser og bindende karakterisering af ikke-denatureringen side. (A) RNA Hårnåle (rHP1 og rHP2), PNA P3, og en PNA· RNA2 triplex dannet mellem PNA P3 og rHP2. (B) ikke-denatureringen side (12%) resultater af rHP1 og rHP2 binding til PNA P3. Inkubation buffer er 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. De indlæste RNA Hårnåle (rHP1 og rHP2) er på 1 µM i 20 µL. PNA koncentrationer i baner fra venstre mod højre er 0, 0,2, 0,4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, og 50 µM. PNA P3 binder sig ikke til rHP1 (toppanelet) men binder sig til rHP2 (nederste panel). (C) Kd bestemmelse for P3 binding til rHP2. Brøkdel af triplex dannelse (Y) var plottes PNA koncentration. Tallet er tilpasset fra reference31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Figur 6 : Fluorescens titrering undersøgelse af PNA P3 bindendetil 2-aminopurine-mærket RNA'er. 2-aminopurine resten er udpeget som '2' i RNA-sekvens. Inkubation buffer er 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. (A) en PNA· RNA2 triplex dannet mellem P3 og en 2-aminopurine-mærket dsRNA (dsRNA2-2AP). (B) en hypotetisk PNA-RNA duplex dannet mellem P3 og en 2-aminopurine-mærket ssRNA (ssRNA2-2AP). (C, E) Fluorescens emission spectra 2-aminopurine-mærket RNA duplex (1 µM) og ssRNA (1 µM), henholdsvis varieret med P3 koncentration på pH 7,5. Peak på omkring 475 nm er på grund af svag fluorescens emission af L base i PNA. (D, F) K d bestemmelse baseret på parceller af 2-aminopurine fluorescens intensitet (på 370 nm) af RNA duplex og ssRNA, henholdsvis versus PNA P3 koncentration. Tallet er tilpasset fra reference31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Figur 7 : Thermal smeltende resultater for RNA-PNA dobbelthuse. Inkubation buffer er 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7,5. Alle prøver indeholder 5 µM enkeltstrenget RNA (ssRNA1) og PNA i 130 µL. (A) enkeltstrenget RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 og P5) og en hypotetisk PNA-RNA duplex dannet mellem PNA P3 og ssRNA1 i en parallel orientering. Sterisk sammenstød er indiceret til Watson-Crick som Q-G og L-G par. (B) smeltende kurver for forskellige PNAs binding til ssRNA1. De smeltende temperatur er vist for kurver med smeltende overgange. Tallet er tilpasset fra reference31.

Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sekvens-specifikke og selektiv anerkendelse af dobbelt-strenget RNA'er over enkeltstrenget RNA'er af kemisk modificerede peptid nukleinsyrer

Vi rapporterer protokoller til syntese og rensning af peptid nukleinsyre (PNA) oligomerer indarbejde ændrede restkoncentrationer. De biokemiske og biofysiske metoder til karakterisering af anerkendelse af RNA dobbelthuse af de modificerede PNAs er beskrevet.

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Levering af nukleinsyrer gennem Embryo Mikroinjektion i Worldwide Agricultural Pest Insekt,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugering Parring Analyser for Sekvens-specifik analyse af Transfer proteiner involveret i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Opdræt og dobbelt-strenget RNA-medieret Gene Knockdown i Skjul Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Atomic Force Microscopy Undersøgelser af DNA Lesion Recognition i Nucleotide Excision Repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metaboliske mærkning og profilering af overførsel RNA'er ved hjælp af Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Celle baseret Assays af SINEUP ikke-kodende RNA'er, der specifikt kan forbedre mRNA Oversættelse

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Afgørende 3'-Termini og sekvenser af spirende enkeltstrenget Viral DNA molekyler i HIV-1 omvendt transkription i inficerede celler

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overekspression længe Noncoding RNA'er ved hjælp af gen-aktivering CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

In vitro biokemiske assays ved hjælp af biotin etiketter til at studere Protein-nukleinsyre interaktioner

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

High-density DNA og RNA-mikroarrays-Photolithographic syntese, hybridisering og fremstilling af store nukleinsyre biblioteker

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...