Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Singapore ministerie van onderwijs (MOE) Tier 1 (RGT3/13 en RG42/15 tot G.C.) en MOE fase 2 (MOE2013-T2-2-024 en MOE2015-T2-1-028 aan G.C.).

Een octrooiaanvraag (PAT/179/14/15/pct's) gebaseerd op het werk hier gemeld is ingediend.

RNA duplex-bindende PNA oligomeren (bijv., 10-mers) zijn kleine en middelgrote moleculen en dus kan laten zien elektroforetische mobiliteit verschuiving op bindende aan RNAs met een vergelijkbaar of lichtjes grotere grootte (b.v., 50-mer of kleiner). Als een RNA aanzienlijk groter dan de PNA is, kan titratie van PNA in RNA niet werken als gevolg van een verschuiving van de mobiliteit beperkt gel. Zo kan de grote RNA voor de niet-denaturering pagina testen worden afgekapt. Titratie van een grote RNA in een fluorophore-geëtiketteerden PNA zorgt voor de monitoring van de triplex vorming door een niet-denaturering agarose gel met het monster dat is geladen in het midden van de gel-40.
Voor een titratie experiment door niet-denaturering pagina met een constante totale concentratie van RNA gebruiken we meestal een labelloze RNA concentratie 1 µm voor efficiënte post kleuring van de gratis RNA en triplex bands door ethidiumbromide. Een RNA concentratie zo laag als 0,2 µM volstaan ook afhankelijk van de RNA construct31. De concentratie van de labelloze RNA (0,2 µM) bepaalt dat de Kd waarden die nauwkeurig kunnen worden gemeten over 0,2 µM of groter moeten zijn. Andere kleuring kleurstoffen kunnen worden gebruikt om de kleuring efficiëntie te vergroten. U kunt ook suggereren onze niet-gepubliceerde gegevens dat Cy3 kleurstof-geëtiketteerden RNAs in niet-denaturering pagina experimenten kunnen worden gebruikt voor het meten van de strakke bindende gebeurtenissen.
Wijten aan het feit dat de 2-aminopurine is slechts matig TL, is 2-aminopurine fluorescentie titratie ook beperkt tot het meten van de binding met Kd waarden dicht bij of boven 0,2 µM31. Het RNA of de PNA kan worden aangeduid met een relatief lichte kleurstof voor het kwantificeren van een vrij krap bindend in oplossing door middel van fluorescentie titratie, als de binding in veranderingen in de fluorescentie signalen53,54, resulteert 55.
De strategie van gerichte RNA structuren door dsRNA-bindende PNAs is getest voor een beperkt aantal RNAs. Het is waarschijnlijk dat bindende eigenschappen voor dsRNAs met verschillende reeksen en basenpaar composities variëren kan. Men kan altijd kiezen voor de purine-rijke onderdeel van een duplex voor het ontwerp van TFPNAs. Het is van cruciaal belang om te begrijpen hoe opeenvolgende Q· C-G triples invloed kunnen zijn op de stabiliteit van een triplex. Meer uitgebreide reeks-afhankelijke studies zijn duidelijk nodig om te begrijpen van de reeks-afhankelijke bindende eigenschappen van TFPNAs.
De bindende affiniteit van TFPNAs kan verder worden verbeterd door verhoging van de lengte en/of verdere wijziging van de grondslagen en backbones56,,57 van TFPNAs. Echter kan een continu dubbelzijdig regio niet vaak bestaan uit meer dan 10 opeenvolgende basenparen zonder de verstoring door niet-Watson-Crick structuren. Een kan TFPNAs conjugaat met kleine molecules voor de erkenning van niet-Watson-Crick structuren aan dsRNA regio's grenzen. In principe een TFPNA-kleine molecule conjugaat verwachting bindende affiniteit en specificiteit ten opzichte van een TFPNA of een klein molecuul alleen hebben verbeterd. Echter, de chemische en fysische eigenschappen van de linker voor de vervoeging58,59,60,,61,62,,63,64 moet worden geoptimaliseerd.
Het feit dat TFPNAs selectief aan dsRNAs over ssRNAs en dsDNAs binden kunt vermoeden dat het mogelijk is te ontwikkelen TFPNAs als zeer nuttig chemische sondes en potentiële therapeutische liganden door middel van de verordening van RNA structurele dynamica en interacties met eiwitten en metabolieten. Cellulaire opname van TFPNAs kan worden vergemakkelijkt door de vervoeging met cel-penetrating wordt zoals kleine molecules, peptiden, en nanodeeltjes of complexvorming met supramoleculaire structuren zoals liposomen5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Verder kan functionalization van TFPNAs met bioimaging codes zoals fluorophores en radio-isotopen vergemakkelijken de detectie, imaging, en doelgerichtheid van functionele structuren van het RNA in levende organismen.

RNAs zijn opkomst als belangrijke biomarkers en therapeutische doelen, vanwege de recente vooruitgang in de ontdekkingen van de RNAs rollen in de verordening en katalyse van uiteenlopende biologische processen1,2,3. Van oudsher, antisense strengen hebben gebruikt om te binden aan de ssRNAs t/m Watson-Crick dubbelzijdig vorming3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. onlangs, triplex-vormende peptide nucleïnezuren (TFPNAs) zijn ontworpen om aan dsRNAs via Hoogsteen waterstof binding (Figuur 1)3,28,29te binden. dsRNA regio's zijn aanwezig in de meerderheid van de traditionele antisense-gerichte RNAs, met inbegrip van pre-mRNAs en mRNAs, pre of pri-miRNAs3, en vele andere niet-coderende RNAs1,26,27. Gericht op dsRNAs door triple helix vorming met behulp van TFPNAs kan nuttig zijn, als gevolg van de specificiteit van haar structuur en is van groot potentieel voor gebruik bij het herstel van de normale functies van de RNAs, die dysregulated in ziekten, bijvoorbeeld zijn.
De onlangs gepubliceerde werken door Rozners et al., en ons3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,,37,38,39,40,41, meldde de inspanningen op het verbeteren van de selectieve binding van gemodificeerde TFPNAs naar dsRNAs met uitgebreide affiniteit. We hebben methodes van de synthese voor rationeel ontworpen PNA monomeren (Figuur 2) met inbegrip van thio-pseudoisocytosine (L) monomeer30 en31monomeer guanidine gemodificeerde 5-methyl cytosine (Q) ontwikkeld. Via verschillende biochemische en biofysische karakteriseringsmethoden, hebben wij aangetoond dat relatief korte PNAs (6-10 residuen) waarin L en Q residuen verbeterde erkenning van Watson-Crick G-C en C-G basenparen, respectievelijk, in dsRNAs tonen. Bovendien Toon in vergelijking met ongewijzigde PNAs, PNAs L en Q residuen bevatten meer selectieve binding naar dsRNA over ssRNA en dsDNA. De guanidine functionaliteit42 in de Q-base kunt PNAs HeLa cellen31invoeren.
In ons laboratorium, synthetiseren we PNAs door de handmatige Boc-chemie (Boc of t- Boc staat voor tert-butyloxycarbony (Zie Figuur 2) solid-phase peptide synthese methode4. De synthese van de PNA monomeer met Boc als de bescherming van de groep amine is handig als de Boc-groep sterically minder omvangrijk in vergelijking met fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) amine bescherming van de groep, die kan zinvol zijn tijdens PNA monomeer koppelingshelft is op de stevige steun. De Boc group is zuur-labiele en kan gemakkelijk worden verwijderd op de solide steun door trifluorazijnzuur 20-50% (TFA) in dichloormethaan (DCM) tijdens PNA synthese. Een geautomatiseerde peptide synthesizer kan worden gebruikt voor het synthetiseren van PNA oligomeren; 3-5-voudige overmaat van PNA monomeer is echter nodig voor een geautomatiseerde peptide synthesizer. Handmatige synthese vereist aanzienlijk minder PNA monomeer (2-3-voudige overschot), met elke koppeling gemakkelijk gecontroleerd door de Kaiser test43. Bovendien, vele geautomatiseerde synthesizers zijn niet compatibel met de Boc-strategie-synthese als gevolg van het gebruik van bijtende TFA tijdens de Boc verwijdering stap.
De PNA oligomeren kunnen worden gezuiverd door omgekeerde-fase krachtige vloeibare chromatografie (RP-HPLC) gevolgd door de karakterisering van het moleculair gewicht door MALDI-TOF (figuren 3 en 4)30, 31. we gebruiken niet-denaturering pagina triplex vorming volgen, te wijten aan het feit dat gratis RNA duplex construeert en PNA triplexes vaak gebonden tonen verschillende migratie tarieven (Figuur 5)30,31 . Geen etikettering nodig is als efficiënte na kleuring kan worden bereikt voor beiden het RNA dubbelzijdig en PNA· RNA2 triplex bands. Een relatief kleine hoeveelheid monster nodig is voor niet-denaturering pagina experimenten. Echter de buffers laden (incubatie) en de lopende buffers (pH 8.3) mogelijk niet hetzelfde, wat resulteert in de metingen wordt beperkt tot het kinetisch stabiele triplexes, omdat een relatief hoge pH van 8,3 kan een triplex aanzienlijk destabiliseren.
2-Aminopurine is een isomeer van adenine (6-aminopurine); de intensiteit van de fluorescentie 2-aminopurine (met een uitstoot piek op ongeveer 370 nm) is gevoelig voor plaatselijke structurele omgevingswijzigingen, en is geschikt voor de bewaking van triplex vorming met het residu gedroogd 2-aminopurine opgenomen in de buurt van de bindende site (PNA Figuur 6) 31. in tegenstelling tot vele andere kleurstoffen die fluorescentie emissie in het zichtbare bereik weergeven, 2-aminopurine-geëtiketteerden RNA kan worden blootgesteld aan licht kamer zonder foto bleken. In tegenstelling tot pagina experiment waarin een actieve buffer met pH 8.3 is vaak nodig, 2-aminopurine gebaseerd fluorescentie titratie maakt het meten van bindende in één oplossing met een pH van een opgegeven, en dus mogelijk de meet- en detectie van relatief zwak en kinetisch unstable inbinden in evenwicht.
UV-absorptie-gedetecteerd thermische smeltende experimenten toestaan de meting van de thermische stabiliteit van duplexen (Figuur 7)31 en trisamenstellingen30,32,44,45. Afhankelijk van de lengte en volgorde samenstelling, het smelten van triplexes kan of kan niet tonen een duidelijke overgang. Thermodynamische parameters kunnen worden verkregen als de warmte- en koelingsector bochten elkaar overlappen. Nauwkeurige thermodynamische parameters kunnen worden verkregen door isothermische titratie calorimetrie (ITC)32; relatief grote hoeveelheid monsters zijn echter in het algemeen vereist voor ITC.

<table style="border-collapse:collapse;width:491pt" width="654">
	<colgroup>
		<col style="width:176pt" width="235" />
		<col style="width:116pt" width="155" />
		<col span="3" style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl25" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl74" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">87956</td>
			<td style="width:66pt" width="88"></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&#376;HCl)</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl68" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">532444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B25251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acetic anhyride</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Kaiser Test Kit&#160;</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L06374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Unmodified PNA monomers</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">ASM Research Chemicals GmbH</td>
			<td class="xl70" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B8389 / 47624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Thioanisole</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoromethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A10173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">LiChrosper&#174; 100 RP-18 endcapped (5 &#181;m) LiChroCART&#174; 250-4</td>
			<td class="xl41">Merck Millipore</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">150838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">RNA Oligos&#160;</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">Customized&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">39468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td class="xl41">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">J15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">HEPES&#160;</td>
			<td class="xl41">Lonza</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N.N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">146072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td>
			<td class="xl41">1st Base</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">BUF-3010-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Glycerol&#160;</td>
			<td class="xl45">Promega&#160;</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">H5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethidium bromide (10 mg/mL)</td>
			<td class="xl45">Bio-rad&#160;</td>
			<td class="xl64" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl48" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td>
			<td class="xl49">Hellma Analytics&#160;</td>
			<td class="xl61" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">105.250-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

RNAs zijn opkomst als belangrijke biomarkers en therapeutische doelen. Er is dus groot potentieel bij de ontwikkeling van chemische sondes en therapeutische liganden voor de erkenning van RNA volgorde en structuur. Chemisch gewijzigd Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomeren onlangs hebben ontwikkeld die RNA duplexen op een reeks specifieke wijze kan worden herkend. PNAs zijn chemisch stabiel met een neutrale peptide-achtige backbone. PNAs kunnen gesynthetiseerd worden relatief gemakkelijk door de handmatige Boc-chemie solid-phase peptide synthese methode. PNAs zijn gezuiverd door omgekeerde-fase HPLC, gevolgd door de karakterisering van het molecuulgewicht van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie-tijd van de vlucht (MALDI-TOF). Non-denaturering polyacrylamide-gel elektroforese (pagina) techniek vergemakkelijkt de beeldvorming van de triplex vorming, omdat zorgvuldig ontworpen gratis RNA dubbelzijdig construeert en PNA triplexes vaak gebonden Toon verschillende migratie tarieven. Non-denaturering pagina met ethidium bromide (en) bericht kleuring is vaak een eenvoudig en informatief techniek voor de karakterisering van de bindende affiniteiten en specifieke eigenschappen van PNA oligomeren. Meestal kunnen meerdere RNA haarspelden of duplexen met enkelvoudige basenpaar mutaties worden gebruikt om te karakteriseren PNA bindende eigenschappen, zoals de bindende affiniteiten en specifieke kenmerken. 2-Aminopurine is een isomeer van adenine (6-aminopurine); de intensiteit van de fluorescentie 2-aminopurine is gevoelig voor plaatselijke structurele omgevingswijzigingen, en is geschikt voor de monitoring van triplex vorming met het residu van de 2-aminopurine opgenomen in de buurt van de PNA bindende site. 2-Aminopurine fluorescentie titratie kan ook worden gebruikt ter bevestiging van de bindende selectiviteit van gemodificeerde PNAs naar gerichte double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorptie-gedetecteerd thermische smeltende experimenten toestaan de meting van de thermische stabiliteit van PNA-RNA duplexen en PNA· RNA2 triplexes. Hier beschrijven we de synthese en zuivering van PNA oligomeren opnemen gewijzigd van residuen, en beschrijven van de biochemische en Biofysische methoden voor karakterisering van de erkenning van RNA duplexen door de gewijzigde PNAs.

Omgekeerde-fase HPLC staat de zuivering van PNA oligomeren. We kunnen het verkrijgen van zuivere PNA oligomeren met twee rondes van HPLC zuivering (Figuur 3). De identiteit van de PNAs kan worden bevestigd door de analyse van de MALDI-TOF (Figuur 4).
Non-denaturering pagina is een eenvoudige en informatieve techniek voor de karakterisering van de bindende affiniteiten en specifieke eigenschappen van PNA oligomeren. Wij gebruiken meestal meerdere RNA haarspelden of duplexen met enkelvoudige basenpaar mutaties om karakteriseren bindende eigenschappen (Figuur 5). De niet-denaturering paginagegevens afgebeeld in Figuur 5 duidelijk blijkt dat de Q en L-gemodificeerde PNA een dsRNA-regio met een C-G paar (Figuur 5B, onderste paneel herkent) maar niet zonder een paar van de C-G (Figuur 5B, top deelvenster). Deze specifieke en verbeterde erkenning is door middel van de T· A-U, L· G-C en Q· C-G PNA· De vorming van RNA2 basis triple (Figuur 1A, C, D). Verschillende PNAs met enkelvoudige of meervoudige mutaties kunnen ook worden gebruikt om aan te tonen van de verbeterde bindende eigenschappen van een gemodificeerde PNA. We hebben aangetoond dat het toevoegen van 2 mM Mg2 + in het incubatie-buffer heeft geen invloed op de binding aanzienlijk31.
We hebben aangetoond door 2-aminopurine fluorescentie titratie die een Q en L-gemodificeerde PNA aan een gerichte dsRNA regio (Figuur 6A, 6 C, 6 D) maar niet ssRNA (Figuur 6B, 6E, 6F bindt). PNA P3 bindt aan de 2-aminopurine-geëtiketteerden dsRNA met een K-d -waarde van 0,8 ± 0.1 µM. De intensiteit van de fluorescentie op 370 nm voor de ssRNA 2-aminopurine-label blijft relatief constant met gevarieerde P3 concentratie, die aangeeft het gebrek aan binding van PNA P3 aan de ssRNA.
PNAs met Q residuen (P2 en P3) Toon geen thermische smelten overgangen (Figuur 7), suggereren geen binding met de ssRNA. Dit is te wijten aan de sterische botsing aanwezig in Watson-Crick, zoals Q-G paar. Vergeleken met ongewijzigde PNA P1, PNAs P4 en P5 met gemodificeerde L residuen maar geen Q-residuen, Toon daalde smeltende temperaturen voor de overeenkomstige RNA-PNA duplexen als gevolg van de sterische botsing aanwezig in Watson-Crick, zoals L-G paar. De UV-absorptie-gedetecteerd thermische smeltende gegevens in overeenstemming zijn met de 2-aminopurine fluorescentie titratie gegevens, waaruit ook blijkt dat een PNA Q en L residuen bevatten niet aan de ssRNA aanzienlijk bindt (Figuur 6B, 6E, 6F). Opnemen van een Q-base is meer destabiliserende dan de boekwaarde van een L, zoals een Q-base een belangrijkere sterische botsing in de vorming van een paar met Watson-Crick-achtige Q-G (Figuur 1F is) vergeleken met een paar Watson-Crick-achtige L-G (Figuur 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Figuur 1 : Chemische structuren van stabiele basis triple en onstabiele basenpaar structuren. (A-D) Majoor-groef PNA· RNA2 basis triples van T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C), en Q· C-G (D). (E, F) Unstable Watson-Crick zoals PNA-RNA basenparen van L-G (E) en Q-G (F). De letter R vertegenwoordigt de suiker-fosfaat ruggegraat van RNA. Waterstofbruggen worden aangegeven door zwarte onderbroken lijnen. De afbeelding is gereproduceerd verwijzing €31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Figuur 2 : Chemische structuren van PNA monomeren. Vier PNA monomeren (T, C, L en Q) worden weergegeven. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Figuur 3 : Chemische structuur van een PNA oligomeren en zuivering door RP-HPLC. (A) chemische structuur van de PNA reeks P3. (B, C) RP-HPLC-gegevens van ruwe PNA P3 (B) en opnieuw gezuiverd PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Figuur 4 : MALDI-TOF spectrum van gezuiverde PNA P3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Figuur 5 : RNA haarspeld en PNA sequenties en bindende karakterisering door niet-denaturering pagina. (A) RNA haarspelden (rHP1 en rHP2), PNA P3, en een PNA· RNA2 triplex gevormd tussen PNA P3 en rHP2. (B) niet-denaturering pagina (12%) resultaten voor rHP1 en rHP2 binding aan PNA P3. De incubatie-buffer is 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. De geladen RNA haarspelden (rHP1 en rHP2) zijn op 1 µM in 20 µL. De concentraties van de PNA in banen van links naar rechts zijn 0, 0.2, 0.4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, en 50 µM. PNA P3 bindt niet aan rHP1 (bovenzijde) maar bindt aan rHP2 (onderste paneel). (C) Kd bepaling over P3 binding aan rHP2. De Fractie van triplex vorming (Y) was uitgezet tegen de concentratie van PNA. De figuur wordt aangepast van referentie31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Figuur 6 : Fluorescentie titratie studie van PNA P3 bindendetot 2-aminopurine-geëtiketteerden RNAs. Het 2-aminopurine-residu is aangewezen als '2' in de opeenvolging van RNA. De incubatie-buffer is 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. (A) een PNA· RNA2 triplex gevormd tussen P3 en een 2-aminopurine-geëtiketteerden dsRNA (dsRNA2-2AP). (B) een hypothetische PNA-RNA duplex gevormd tussen P3 en een ssRNA van 2-aminopurine-label (ssRNA2-2AP). (C, E) Fluorescentie emissie spectra voor de 2-aminopurine-geëtiketteerden RNA dubbelzijdig (1 µM) en ssRNA (1 µM), respectievelijk met gevarieerd P3 concentratie bij pH 7.5. De piek op ongeveer 475 nm is te wijten aan de zwakke fluorescentie-emissie van de L-basis in de PNA. (D, F) K d bepaling op basis van de percelen van 2-aminopurine fluorescentie intensiteit (op 370 nm) van het RNA duplex- en ssRNA, respectievelijk versus PNA P3 concentratie. De figuur wordt aangepast van referentie31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Figuur 7 : Thermische smelten resultaten voor RNA-PNA duplexen. De incubatie-buffer is 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7.5. Alle monsters bevatten 5 µM van PNA in 130 µL. (A) Single-stranded RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 en P5) single-stranded RNA (ssRNA1) en een hypothetische PNA-RNA duplex gevormd tussen PNA P3 en ssRNA1 in een parallelle oriëntatie. De sterische botsing is geïndiceerd voor de Watson-Crick zoals Q-G en L-G paren. (B) Melting buigt voor verschillende PNAs binden aan ssRNA1. De smeltende temperaturen worden weergegeven voor de krommen met het smelten van overgangen. De figuur wordt aangepast van referentie31.

Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Volgorde-specifieke en selectieve erkenning van Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs van chemisch gewijzigd Peptide nucleïnezuren

We melden de protocollen voor de synthese en zuivering van Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomeren opnemen gewijzigd residuen. De biochemische en Biofysische methoden voor de karakterisatie van de erkenning van RNA duplexen door de gewijzigde PNAs worden beschreven.

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Levering van nucleïnezuren door middel van Embryo micro-injectie in de Worldwide Landbouw Pest Insect,<em&gt; Middellandse-Zeevlieg</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Atomic Force Microscopy Onderzoek naar DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metabole Labeling en profilering van overdracht RNAs met behulp van Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Cel gebaseerde analyses van SINEUP niet-coderende RNAs die specifiek mRNA vertaling kunnen verbeteren

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overexpressing lang Noncoding RNAs met behulp van gen-activeren CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

In vitro biochemische assays met behulp van biotine etiketten om eiwit-nucleïnezuur interacties te bestuderen

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

High-density DNA en RNA micro arrays-Photolithografische synthese, hybridisatie en voorbereiding van grote nucleïnezuur bibliotheken

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...