Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00
Duration: 9 min 4 s
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Diese Arbeit wurde von der Singapore Ministry of Education (MOE) Stufe 1 (RGT3/13 und RG42/15, g.c.) und MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 und MOE2015-T2-1-028, g.c.) unterstützt.

Eine Patentanmeldung (PAT/179/14/15/PCT) basiert auf der Arbeit hier berichtet wurde eingereicht.

RNA Duplex-Bindung PNA Oligomere (z.B. 10-Mers) sind Moleküle, die mittlere und somit können zeigen elektrophoretische Mobilität Verschiebung auf verbindliche RNAs mit einer vergleichbar oder etwas größeren Größe (z. B., 50-Mer oder kleiner). Wenn eine RNA deutlich größer als die PNA ist, Titration von PNA in RNA funktioniert möglicherweise nicht aufgrund einer begrenzten Gel-Mobilität-Verschiebung. So kann die großen RNA für die nicht-Denaturierung Seite Assays abgeschnitten werden. Titration von eine große RNA in einem Fluorophore beschriftet PNA ermöglicht die Überwachung der triplex Bildung durch ein nicht denaturierenden Agarosegel mit der Probe in der Mitte der Gel40geladen.
Für eine Titration Experiment nicht Denaturierung seitenweise mit konstanter Gesamtkonzentration von RNS verwenden wir in der Regel eine unbeschriftete RNA-Konzentration von 1 µM für effiziente Post Färbung freie RNA und triplex Bands durch Interkalation Bromid. Eine RNA-Konzentration so niedrig wie 0,2 µM kann auch abhängig von der RNA Konstrukt31ausreichen. Die Konzentration der unbeschrifteten RNA (0,2 µM) bestimmt, dass die K-d -Werte, die genau gemessen werden können über 0,2 µM oder größer sein sollte. Andere Färbung Farbstoffe können verwendet werden, um die Färbung Effizienz zu erhöhen. Alternativ zufolge unsere unveröffentlichten Daten Cy3 Farbstoff-markierten RNAs in nicht Denaturierung Seite Experimente verwendet werden können, um die feste Bindung Ereignisse zu messen.
Die 2-Aminopurine nur mäßig Leuchtstoff ist, ist 2-Aminopurine Fluoreszenz Titration auch beschränkt sich auf die Messung der Bindung mit K-d -Werte nahe oder über 0,2 µM31. Die RNA oder PNA kann mit einem relativ hellen Farbstoff zur Quantifizierung eine relativ enge Bindung in Lösung durch Fluoreszenz Titration, wenn die Bindung ergibt sich Änderungen in der Fluoreszenz Signale53,54, beschriftet werden 55.
Die Strategie des Zielens RNA-Strukturen durch DsRNA-Bindung PNAs wurde für eine begrenzte Anzahl von RNAs getestet. Es ist wahrscheinlich, dass bindende Eigenschaften für DsRNAs mit verschiedenen Sequenzen und Basenpaar Kompositionen variieren kann. Man kann immer die Purin-reiche Strang eines Duplex für die Gestaltung der TFPNAs wählen. Es ist wichtig zu verstehen, wie in Folge an C-G-Tripel können die Stabilität der ein Triplex beeinträchtigen. Umfangreichere Studien der reihenfolgeabhängigen sind klar zu verstehen, die reihenfolgeabhängigen Bindungseigenschaften des TFPNAs erforderlich.
Die Bindungsaffinität des TFPNAs kann durch Erhöhung der Länge und/oder weitere Basen und Backbones56,57 des TFPNAs ändern weiter gesteigert werden. Allerdings kann eine kontinuierliche duplex Region nicht oft von mehr als 10 aufeinanderfolgenden Basenpaaren ohne Störung durch nicht-Watson-Crick-Strukturen bestehen. Man kann TFPNAs mit kleinen Molekülen für die Anerkennung von nicht-Watson-Crick-Strukturen an DsRNA Regionen angrenzenden konjugieren. Im Prinzip soll ein TFPNA kleines Molekül Konjugat Bindungsaffinität und Spezifität im Vergleich zu einer TFPNA oder kleines Molekül allein verbessert haben. Jedoch die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Linkers für die Konjugation58,59,60,61,62,63,64 muss optimiert werden.
Die Tatsache, dass TFPNAs selektiv, um DsRNAs über SsRNAs binden können und DsDNAs deutet darauf hin, dass es möglich ist, TFPNAs zu entwickeln, als sehr nützlich chemische Sonden und mögliche therapeutische Liganden durch die Regulierung der RNA Strukturdynamik und Interaktionen mit Proteinen und Metaboliten. Zelluläre Aufnahme von TFPNAs kann erleichtert werden, durch die Konjugation mit Zelle eindringen Moieties wie kleinen Molekülen, Peptiden, und Nanopartikel oder Komplexierung mit supramolekularen Strukturen wie Liposomen5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Weiter kann Funktionalisierung von TFPNAs mit Bioimaging Tags wie Fluorophore und Radioisotopen die Erkennung, imaging und Ausrichtung der funktionalen RNA-Strukturen in lebenden Organismen erleichtern.

RNAs entstehen als wichtiger Biomarker und therapeutische Ziele, durch die jüngsten Fortschritte in der Entdeckungen der RNAs Rollen in der Verordnung und Katalyse von diversen biologischen Prozessen1,2,3. Traditionell wurden antisense Stränge zur Bindung an SsRNAs durch Watson-Crick duplex Bildung3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. vor kurzem Triplex-bildende Peptid-Nukleinsäuren (TFPNAs) wurden entwickelt, um DsRNAs über Hoogsteen Wasserstoffbindung (Abbildung 1)3,28,29binden. DsRNA Regionen befinden sich in den meisten der traditionellen Antisense-gezielte RNAs, einschließlich Pre-mRNAs und mRNAs, Pre oder Pri-MiRNAs3und viele andere nicht-kodierende RNAs1,26,27. DsRNAs durch Dreifachhelix Bildung mit TFPNAs Targeting kann aufgrund seiner Struktur Besonderheit vorteilhaft sein und ist mit großem Potenzial für den Einsatz bei der Wiederherstellung der normalen Funktionen der RNAs, die Dysregulated in Krankheiten, zum Beispiel.
Die kürzlich veröffentlichten Arbeiten von Rozners Et Al., und uns3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, berichtet die Bemühungen zur Verbesserung der die selektive Bindung von modifizierten TFPNAs in Richtung DsRNAs mit verstärkten Affinität. Wir haben Synthesemethoden für rational gestalteten PNA Monomere (Abbildung 2) einschließlich Thio-Pseudoisocytosine (L) Monomer30 und Guanidin-modifizierten 5-Methyl Cytosin (Q) Monomer31entwickelt. Durch verschiedene biochemische und biophysikalische Charakterisierungsmethoden haben wir gezeigt, dass relativ kurzen PNAs (6-10 Rückstände) Einbeziehung L und Q Rückstände verbesserte Erkennung von Watson-Crick-G-C- und C-G Basenpaaren, bzw. in DsRNAs zeigen. Darüber hinaus zeigen im Vergleich zu unveränderten PNAs, PNAs, die L und Q Rückstände enthalten mehr selektive Bindung in Richtung DsRNA SsRNA und DsDNA. Die Guanidin-Funktionalität-42 in der Q-Base ermöglicht PNAs HeLa Zellen31eingeben.
In unserem Labor zu synthetisieren wir PNAs durch manuellen Boc-Chemie (Boc oder t- Boc steht für Tert-Butyloxycarbony (siehe Abbildung 2) Festphasen-Peptid-Synthese Methode4. Die Synthese von PNA Monomer mit Boc als das Amin Gruppe zu schützen ist praktisch, da die Boc Group sterisch weniger sperrig im Vergleich zu Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Amin Schutz-Gruppe, die während der Kopplung ist auf PNA-Monomer kann vorteilhaft sein die solide Unterstützung. Die Boc Group ist Säure-labil und kann leicht auf die solide Unterstützung von 20-50 % Trifluoroacetic Säure (TFA) in Dichlormethan (DCM) während der PNA Synthese entfernt. Ein automatisierte Peptid-Synthesizer einsetzbar, PNA Oligomere zu synthetisieren; Allerdings braucht man 3-5-fach Übermaß an PNA Monomer für eine automatisierte Peptid-Synthesizer. Manuelle Synthese erfordert deutlich weniger PNA Monomer (2-3-Fach Selbstbehalt), mit jede Kupplung leicht von der Kaiser-Test43überwacht. Darüber hinaus sind viele automatisierte Synthesizer während der Boc-Schritt Entfernung nicht kompatibel mit der Boc-Strategie-Synthese durch den Einsatz von ätzenden TFA.
Die PNA-Oligomere können durch Reverse-Phase Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) gefolgt von Molekulargewicht Charakterisierung von MALDI-TOF gereinigt werden (Abbildungen 3 und 4)30, 31. beschäftigen wir nicht Denaturierung Seite triplex Bildung zu überwachen, dass freie RNA-Duplex konstruiert und PNA Triplexen oft gebunden zeigen unterschiedliche Migration Rate (Abbildung 5)30,31 . Keine Kennzeichnung ist erforderlich, wenn Post-effiziente Färbung für beide RNA duplex und PNA· erreicht werden kann RNS2 triplex Bands. Eine relativ kleine Menge der Probe ist für nicht-Denaturierung Seite Experimente erforderlich. Jedoch die Belastung (Inkubation) Puffer und die laufenden Puffer (pH 8,3) dasselbe, was in den Messungen wird beschränkt auf die kinetisch stabilen Triplexen, weil ein relativ hoher pH-Wert von 8,3 deutlich ein Triplex destabilisieren kann möglicherweise nicht.
2-Aminopurine ist ein Isomer von Adenin (6-Aminopurine); der 2-Aminopurine Fluoreszenzintensität (mit einer Emission Peak bei etwa 370 nm) ist empfindlich gegen strukturelle Umgebung, und ist geeignet für die Überwachung der triplex Formation mit der 2-Aminopurine Rückstand in der Nähe der PNA Website (verbindlich aufgenommen Abbildung 6) 31. im Gegensatz zu vielen anderen Farbstoffen, die Fluoreszenzemission im sichtbaren Bereich zeigen, 2 Aminopurine beschriftet RNA kann ausgesetzt werden Raumlicht ohne Foto bleichen. Im Gegensatz zu Seite Experiment, in dem ein laufende Puffer pH 8,3 ist oft notwendig, 2-Aminopurine basierte Fluoreszenz Titration ermöglicht die Messung der Bindung in einer Lösung bei einem bestimmten pH-Wert, und so gestatten die Messung und Erfassung von relativ schwach und kinetisch instabil Bindung im Gleichgewicht.
UV-Absorption-erkannt thermische schmelzende Experimente ermöglichen die Messung der thermischen Stabilität von Maisonetten (Abbildung 7)31 und triplexe30,32,44,45. Je nach Länge und Sequenz das Schmelzen des Triplexen kann oder kann nicht zeigen einen deutlichen Übergang. Thermodynamischen Parameter können erhalten werden, wenn die Heiz- und Kurven überlappen. Exakte thermodynamische Parameter erhalten Sie durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC)32; relativ große Mengen an Proben sind jedoch in der Regel erforderlich für ITC.

<table style="border-collapse:collapse;width:491pt" width="654">
	<colgroup>
		<col style="width:176pt" width="235" />
		<col style="width:116pt" width="155" />
		<col span="3" style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl25" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl74" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">87956</td>
			<td style="width:66pt" width="88"></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&#376;HCl)</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl68" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">532444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B25251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acetic anhyride</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Kaiser Test Kit&#160;</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L06374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Unmodified PNA monomers</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">ASM Research Chemicals GmbH</td>
			<td class="xl70" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B8389 / 47624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Thioanisole</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoromethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A10173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">LiChrosper&#174; 100 RP-18 endcapped (5 &#181;m) LiChroCART&#174; 250-4</td>
			<td class="xl41">Merck Millipore</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">150838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">RNA Oligos&#160;</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">Customized&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">39468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td class="xl41">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">J15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">HEPES&#160;</td>
			<td class="xl41">Lonza</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N.N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">146072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td>
			<td class="xl41">1st Base</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">BUF-3010-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Glycerol&#160;</td>
			<td class="xl45">Promega&#160;</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">H5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethidium bromide (10 mg/mL)</td>
			<td class="xl45">Bio-rad&#160;</td>
			<td class="xl64" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl48" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td>
			<td class="xl49">Hellma Analytics&#160;</td>
			<td class="xl61" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">105.250-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

RNAs entstehen als wichtiger Biomarker und therapeutische Ziele. So gibt es großes Potenzial bei der Entwicklung von chemischen Sonden und therapeutische Liganden für die Anerkennung der RNA-Sequenz und Struktur. Chemisch verändert Peptide Nucleic Acid (PNA) Oligomere vor kurzem entwickelt worden sind, die RNA-Maisonetten in einer Sequenz-spezifische Weise erkennen können. PNAs sind chemisch stabil mit einem neutralen Peptid-ähnliche-Backbone. PNAs können relativ leicht durch das manuelle Boc-Chemie Festphasen-Peptid-Synthese-Verfahren synthetisiert werden. PNAs sind durch Reverse-Phase-HPLC, gefolgt von Molekulargewicht Charakterisierung von Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-Zeit des Fluges (MALDI-TOF) gereinigt. Non-denaturierenden Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) Technik erleichtert die Bildgebung der triplex-Formation, da sorgfältig entworfen, freie RNA duplex konstruiert und PNA Triplexen oft gebunden zeigen unterschiedliche Migration raten. Non-Denaturierung Seite mit Interkalation Bromid Post Färbung ist oft eine einfache und informative Technik zur Charakterisierung der verbindlichen Affinitäten und Besonderheiten der PNA Oligomere. In der Regel mehrere RNA Haarnadeln oder Maisonetten mit einzigen Basenpaar Mutationen lässt sich PNA Bindeeigenschaften wie verbindliche Affinitäten und Besonderheiten charakterisieren. 2-Aminopurine ist ein Isomer von Adenin (6-Aminopurine); die 2-Aminopurine Fluoreszenz-Intensität ist empfindlich gegen strukturelle Umgebung und eignet sich für die Überwachung der triplex Bildung mit der 2-Aminopurine Rückstand in der Nähe der PNA-Bindungsstelle aufgenommen. 2-Aminopurine Fluoreszenz Titration kann auch verwendet werden, um die verbindliche Selektivität der modifizierten PNAs zur gezielten doppelsträngigen RNAs (DsRNAs) über einzelsträngigen RNAs (SsRNAs) zu bestätigen. UV-Absorption-erkannt thermische schmelzende Experimente ermöglichen die Messung der thermischen Stabilität des PNA-RNA Maisonetten und PNA· RNA-2 -Triplexen. Hier beschreiben wir die Synthese und Reinigung von PNA Oligomere Einbeziehung geändert Rückstände und biochemische und biophysikalische Methoden zur Charakterisierung der Anerkennung von RNA Maisonetten durch die modifizierte PNAs beschreiben.

Reverse-Phase-HPLC ermöglicht die Reinigung von PNA Oligomere. Wir erhalten reine PNA Oligomere mit zwei Runden der HPLC-Reinigung (Abbildung 3). Die Identität des PNAs kann durch MALDI-TOF-Analyse (Abbildung 4) bestätigt werden.
Non-Denaturierung Seite ist eine einfache und informative Technik zur Charakterisierung der verbindlichen Affinitäten und Besonderheiten der PNA Oligomere. Wir verwenden in der Regel mehrere RNA Haarnadeln oder Maisonetten mit einzigen Basenpaar Mutationen Bindeeigenschaften (Abbildung 5) zu charakterisieren. Die nicht Denaturierung Seitendaten in Abbildung 5 dargestellten vorschlagen deutlich, dass die Q - und L-modifizierte PNA eine DsRNA-Region mit einem C-G-paar (Abbildung 5B, Bodenplatte) erkennen kann aber keiner ohne ein C-G-paar (Abbildung 5B, top Panel). Diese besondere und verbesserte Anerkennung ist durch die T· A-U, L· G-C und an C-G PNA· RNS2 base Triple (Abbildung 1A, C, D) Bildung. Verschiedene PNAs mit einzelnen oder mehreren Mutationen können auch verwendet werden, die verbesserten Bindungseigenschaften von einem modifizierten PNA zu demonstrieren. Wir haben gezeigt, dass 2 mM Mg2 + in der Inkubation Puffer hinzufügen die Bindung nicht beeinflusst erheblich31.
Wir haben 2-Aminopurine Fluoreszenz Titration zeigen, die eine Q und L geändert PNA an eine gezielte DsRNA Region (Abbildung 6A, 6 C, 6D) aber nicht SsRNA (Abbildung 6B, 6E, 6F bindet). PNA P3 bindet an die 2-Aminopurine-Label DsRNA mit einem K-d -Wert von 0,8 ± 0,1 µM. Die Fluoreszenzintensität auf 370 nm für die 2-Aminopurine-Label SsRNA bleibt relativ konstant mit abwechslungsreichen P3-Konzentration, zeigt den Mangel an Bindung von PNA P3 an der SsRNA.
PNAs mit Q Rückstände (P2 und P3) zeigen keine thermische Übergänge (Abbildung 7), schlägt keine Bindung an die SsRNA schmelzen. Dies ist aufgrund der sterischen Zusammenstoß in Watson-Crick wie Q-G paar vorhanden. Im Vergleich zu unveränderten PNA P1, PNAs P4 und P5 mit geändert L Rückstände aber keine Q-Rückstände, Show sank Schmelztemperaturen für die entsprechenden RNA-PNA-Maisonetten aufgrund der sterischen Zusammenstoß in Watson-Crick wie L-G paar vorhanden. Die UV-Absorption-erkannt schmelzenden Temperaturdaten sind konsistent mit den 2-Aminopurine Fluoreszenz-Titration-Daten, die auch zeigen, dass ein PNA mit Q und L Rückstände nicht merklich zu SsRNA bindet (Abbildung 6B, 6E, 6F). Einbindung der Q-Base ist mehr als eine L-Basis, destabilisierenden, wie eine Q-Base einen bedeutenderen sterischen Zusammenstoß bei der Bildung der Watson-Crick-wie Q-G zwei (Abbildung 1F hat) im Vergleich zu ein paar Watson-Crick-wie L-G (Abbildung 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Abbildung 1 : Chemische Strukturen der stabilen Basis Dreibett- und instabilen Basenpaar Strukturen. (A-D) Major-Nut PNA· RNS2 base verdreifacht sich der T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) und an C-G (D). (E, F) Instabile Watson-Crick wie PNA-RNA Basenpaare des L-G (E) und Q-G (F). Der Buchstabe R steht das Zucker-Phosphat-Rückgrat der RNA. Wasserstoffbrücken sind durch schwarz gestrichelte Linien angezeigt. Die Figur ist aus Referenz31abgebildet. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Abbildung 2 : Chemische Strukturen von PNA Monomere. Vier PNA Monomere (T, C, L und Q) werden angezeigt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Chemische Struktur von einem PNA Oligomer und Reinigung mittels RP-HPLC. (A) chemische Struktur der PNA Sequenz P3. (B, C) RP-HPLC-Daten von Rohöl PNA P3 (B) und wieder gereinigt PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Abbildung 4 : MALDI-TOF-Spektrum der gereinigten PNA P3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Abbildung 5 : RNA-Haarnadel und PNA-Sequenzen und verbindliche Charakterisierung nicht Denaturierung seitenweise. (A) RNA Haarnadeln (rHP1 und rHP2), PNA P3 und eine PNA· RNS2 triplex zwischen PNA P3 und rHP2 gebildet. (B) nicht-Denaturierung Seite (12 %) ergibt sich für rHP1 und rHP2 Bindung an PNA P3. Die Inkubation Puffer ist 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. Die geladenen RNA Haarnadeln (rHP1 und rHP2) sind bei 1 µM in 20 µL. Die PNA-Konzentrationen in Bahnen von links nach rechts sind 0, 0,2, 0,4, 1, 1,6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, und 50 µM. PNA P3 bindet nicht an rHP1 (Oberseite) aber bindet an rHP2 (Bodenplatte). (C) Kd Bestimmung für P3 Bindung an rHP2. Der Anteil der triplex Bildung (Y) war gegen die PNA-Konzentration aufgetragen. Die Figur ist aus Referenz31angepasst. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Abbildung 6 : Fluoreszenz Titration Studie der PNA P3 Bindungzu 2 Aminopurine beschriftet RNAs. Der 2-Aminopurine Rückstand wird als "2" in der RNA-Sequenz bezeichnet. Die Inkubation Puffer ist 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. (A) eine PNA· RNS2 triplex zwischen P3 und eine 2-Aminopurine-Label DsRNA (dsRNA2-2AP) gebildet. (B) ein hypothetisches PNA-RNA Maisonette zwischen P3 und eine 2-Aminopurine-mit der Bezeichnung SsRNA (ssRNA2-2AP) gebildet. (C, E) Fluoreszenz-Emissionsspektren für die 2-Aminopurine-Label RNA duplex (1 µM) und SsRNA (1 µM), abwechslungsreich, bzw. mit P3-Konzentration bei pH 7,5. Der Peak bei etwa 475 nm ist durch die schwache Fluoreszenzemission von der L-Basis in der PNA. (D, F) K d Bestimmung basiert auf den Grundstücken der Fluoreszenzintensität 2-Aminopurine (370 nm) des RNA-Duplex und SsRNA, bzw. im Vergleich zu PNA P3 Konzentration. Die Figur ist aus Referenz31angepasst. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Abbildung 7 : Thermische schmelzen Ergebnisse für RNA-PNA Maisonetten. Die Inkubation Puffer ist 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7,5. Alle Proben enthalten 5 µM einsträngige RNA (ssRNA1) und PNA in 130 µL. (A) Single-Stranded RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 und P5) und eine hypothetische PNA-RNA-Maisonette zwischen PNA P3 und ssRNA1 in einer parallelen Ausrichtung gebildet. Die sterische Zusammenstoß ist für die Watson-Crick wie Q-G und L-G-Paare angegeben. (B) Melting Kurven für verschiedene PNAs Bindung an ssRNA1. Die Schmelztemperaturen werden für die Kurven mit schmelzender Übergänge angezeigt. Die Figur ist aus Referenz31angepasst.

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Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren

Wir berichten über die Protokolle für die Synthese und Reinigung von Peptid-Nukleinsäure (PNA) Oligomere Einbeziehung geändert Rückstände. Die biochemischen und biophysikalischen Methoden zur Charakterisierung der Anerkennung von RNA Maisonetten durch die modifizierte PNAs werden beschrieben.

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Forschung

Genetik

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Atommikroskopie Untersuchungen zur DNA-Läsionserkennung bei der Nucleotide Excision Repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metabolische Etikettier- und Profilierung des Transfer-RNAs mit Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Zellbasierte Assays der SINEUP nicht-kodierende RNAs, die speziell mRNA Übersetzung verbessern können

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Bestimmende 3'-Termini und Sequenzen der im Entstehen begriffenen einsträngige virale DNA-Moleküle während HIV-1 Reverse Transkription in infizierten Zellen

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Überexprimierenden lange forensisches RNAs mit Gen-Aktivierung CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

High-Density DNA und RNA Mikroarrays - Photolithographische Synthese, Hybridisierung und Vorbereitung von großen Nukleinsäurebibliotheken

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...