Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי סינגפור משרד החינוך (מו) Tier 1 (RGT3/13 ו- RG42/15-G.C.) ו מו Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 וגם MOE2015-T2-1-028 כדי G.C.).

כבר הגיש בקשה לרישום פטנט (פט/179/14/15/PCT) בהתבסס על העבודה שדווחו פה.

RNA oligomers של הרשות הפלסטינית מחייב דופלקס (למשל, 10-מרס) הם מולקולות בגודל בינוני, ובכך יכול להראות electrophoretic ניידות shift בעת איגוד RNAs בגודל דומות או מעט גדול יותר (לדוגמה, 50-מר או קטן יותר). אם RNA הוא גדול יותר באופן משמעותי מאשר הרשות הפלסטינית, טיטור של הרשות הפלסטינית לתוך RNA לא יפעלו עקב שינוי הניידות ג'ל מוגבלת. לפיכך, הרנ א גדולים עשויים להיחתך עבור מבחני דף שאינם denaturing. טיטור של RNA גדול אל הרשות הפלסטינית התווית על-ידי fluorophore מאפשר פיקוח על היווצרות טריפלקס על ידי ג'ל agarose ללא denaturing עם הדגימה טעון באמצע ג'ל40.
עבור ניסוי טיטור מאת שאינם denaturing דף עם ריכוז מוחלט קבוע של RNA, אנחנו בדרך כלל להשתמש ללא תווית של RNA ריכוז 1 מיקרומטר עבור פוסט יעיל מכתים של RNA חופשי, להקות טריפלקס על ידי אתידיום ברומיד. ריכוז ה-RNA המתחילים 0.2 µM ייתכן גם יספיק בהתאם הבונה RNA31. ריכוז RNA ללא תווית (0.2 µM) קובע כי הערכיםד Kניתן למדוד באופן מדויק צריך להיות על 0.2 µM או גדול יותר. צבעי מכתימים אחרים עשוי לשמש כדי לשפר את היעילות מוכתמים. לחלופין, נתונים שלא פורסמו שלנו מראים כי Cy3 RNAs שכותרתו צבען יכול לשמש בניסויים דף שאינו denaturing כדי למדוד את האירועים איגוד חזק.
בשל העובדה כי 2-aminopurine הוא רק בינוני פלורסנט, 2-aminopurine קרינה פלואורסצנטית טיטור מוגבל גם למדידה של האיגוד עם ערכיםד Kקרוב או מעל 0.2 µM31. את הרנ א או הרשות יכולה להיקרא עם צבע בהיר יחסית אורגנים מחייב יחסית חזק על פתרון באמצעות טיטור פלורסצנטיות, אם הכריכה גורמת לשינויים פלורסצנטיות אותות53,54, 55.
האסטרטגיה של פילוח RNA מבנים על ידי איגוד dsRNA Pna נבדקו עבור מספר מוגבל של RNAs. סביר כי איגוד מאפיינים עשויים להשתנות עבור dsRNAs עם יצירות רצפים וזוג בסיס שונים. אדם יכול תמיד לבחור סטרנד פורין עשיר של דופלקס על עיצוב האתר של TFPNAs. זה קריטי להבין איך ברציפות Q· C-G משולשים עשוי להשפיע על יציבות טריפלקס. מחקרים מקיפים יותר תלוית רצף בבירור הדרושים כדי להבין את מאפייני האיגוד תלוית רצף של TFPNAs.
זיקה מחייבת של TFPNAs יכול להיות משופרת נוספת על ידי הגדלת האורך ו/או שינוי עוד יותר את עמוד השדרה ובאוהלי56,57 של TFPNAs. עם זאת, אזור דופלקס רציף לא לעיתים קרובות מורכבים יותר מ- 10 זוגות בסיס רצופים ללא הפרעה על ידי מבנים שאינם-ווטסון-קריק. אחד אולי נזווג TFPNAs עם מולקולות קטנות להכרה הלא-ווטסון-קריק במבנים סמוכים לאזורים dsRNA. בעקרון, המספר המשלים מולקולת TFPNA-קטן צפוי פופולארים זיקה מחייבת וספציפיות ביחס TFPNA או מולקולה קטנה לבד. עם זאת, מאפייני מקשר עבור ההטיה58,59,60,61,62,63,64 כימיים חייב להיות מותאם.
העובדה כי TFPNAs יכול באופן סלקטיבי לאגד dsRNAs על ssRNAs ועל dsDNAs מרמז שזה אפשרי לפתח TFPNAs וגם מאוד שימושי הגששים כימי פוטנציאלי ליגנדים טיפולית באמצעות ויסות dynamics מבניים RNA ואינטראקציות עם חלבונים, מטבוליטים. ספיגת הסלולר של TFPNAs עשויים להקל דרך הבניין עם חודר לתא moieties כמו מולקולות קטנות, פפטידים, חלקיקים, או complexation עם מבנים סופרא מולקולרית כגון ליפוזומים5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. להמשיך functionalization של TFPNAs עם bioimaging תגיות כגון fluorophores ופילטרציה-מיכשור וציוד עשוי לקדם את הזיהוי, הדמיה, והיעדים של מבנים פונקציונליים RNA היצורים החיים.

RNAs מתגלים סמנים ביולוגיים חשובים, מטרות טיפוליות, עקב התפתחויות אחרונות התגליות של התפקידים של RNAs בוויסות, זרז של תהליכים ביולוגיים שונים-1,-2,-3. באופן מסורתי, קווצות antisense שימשו כדי לאגד ssRNAs עד ווטסון-קריק היווצרות דופלקס3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. לאחרונה, יוצרי טריפלקס חומצות גרעין פפטיד (TFPNAs) עוצבו כדי לאגד dsRNAs ויה Hoogsteen מימן מליטה28,3,(איור 1)29. אזורים dsRNA נמצאים רוב מסורתיים, ממוקדות antisense RNAs, לרבות pre-mRNAs ו- mRNAs, קדם או פרי-miRNAs3רבים אחרים ללא קידוד RNAs1,26,27. מיקוד dsRNAs דרך סליל משולש היווצרות באמצעות TFPNAs עשוי להיות יתרון עקב ירידה לפרטים שלו מבנה והוא של פוטנציאל גדול לשימוש עבור שחזור פונקציות רגיל של RNAs, אשר dysregulated מחלות, למשל.
שפורסם לאחרונה לעבוד על-ידי. Rozners et al., וגם אנחנו3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, דיווח על המאמצים על שיפור הכריכה סלקטיבי של ששונה TFPNAs לכיוון dsRNAs עם זיקה משופרת. פיתחנו שיטות סינתזה עבור הרשות הפלסטינית מעוצב באופן רציונלי מונומרים (איור 2) כולל thio-pseudoisocytosine (L) מונומר30 ו ציטוזין 5-methyl guanidine-לאחרונה (Q) מונומר31. באמצעות שיטות איפיון ביוכימי, biophysical שונות, הראו Pna קצר יחסית (6-10 שאריות) הופכים שאריות L ו- Q הצג לזיהוי טוב יותר של זוגות בסיס ווטסון-קריק G-C ו- C-G, בהתאמה, ב- dsRNAs. יתר על כן, Pna המכילה שאריות L ו- Q בהשוואה ל- Pna שלא שונתה, להראות מחייב יותר סלקטיבי כלפי dsRNA ssRNA ושל dsDNA. פונקציונליות guanidine42 בבסיס Q מאפשר Pna להזין הלה תאים31.
במעבדה שלנו, אנחנו יוצרים Pna מאת מפחיד-הכימיה ידנית (מפחיד או t- מפחיד ופירושה טרט-butyloxycarbony (ראה איור 2) פפטיד מוצק-שלב הסינתזה שיטה4. הסינתזה של מונומר הרשות הפלסטינית עם מפחיד כמו אמין מגן הקבוצה הוא נוח כמו הקבוצה מפחיד sterically פחות מסורבל בהשוואה fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) אמין מגן הקבוצה, אשר עשוי להיות מועיל במהלך מונומר הרשות הפלסטינית צימוד תמיכה מוצקה. הקבוצה מפחיד הוא חומצה-יציב, ניתן להסיר בקלות על התמיכה מוצק על ידי 20-50% חומצה trifluoroacetic (TFA) דיכלורומתאן (DCM) במהלך סינתזה של הרשות הפלסטינית. סינתיסייזר פפטיד אוטומטי יכול להיות מועסק לסנתז oligomers הרשות הפלסטינית; עם זאת, 3-5-קיפול עודף של הרשות הפלסטינית מונומר יש צורך של סינתיסייזר פפטיד אוטומטית. סינתזה ידנית דורשת באופן משמעותי פחות מונומר הרשות הפלסטינית (2-3-לקפל עודפי), עם כל צימוד בפיקוח בקלות המבחן של הקייזר43. יתר על כן, סינתיסייזרים אוטומטיות רבות אינן תואמות הסינתזה אסטרטגיה מפחיד עקב השימוש של מאכל TFA במהלך השלב להסרת מפחיד.
הרשות הפלסטינית oligomers יכולים להיטהר על-ידי הפוכה-פאזי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (RP-HPLC) ואחריו משקל מולקולרי אפיון על-ידי MALDI-TOF (3 דמויות ו- 4)30, 31. אנו מעסיקים שאינם denaturing דף לפקח על היווצרות טריפלקס, בשל העובדה כי דופלקס RNA חופשי בונה ואת הרשות הפלסטינית מאוגד דופלקסים לעתים קרובות להציג הגירה שונים המחירים (איור 5)30,31 . אין תיוג דרושה אם יעיל פוסט-צביעת יכולה להיות מושגת הן של RNA דופלקס, PNA· רנ א2 להקות טריפלקס. כמות קטנה יחסית של מדגם נדרש לניסויים דף שאינם denaturing. עם זאת, המאגרים טעינה (הדגירה) ואת המאגרים פועל (pH 8.3) לא ניתן אותו, וכתוצאה מכך המידות מצטמצם דופלקסים kinetically יציב, כי pH גבוה יחסית של 8.3 עשוי באופן משמעותי ביציבותה של טריפלקס.
2-Aminopurine הוא איזומר של אדנין (6-aminopurine); עוצמת קרינה פלואורסצנטית 2-aminopurine (עם שיא פליטה-בסביבות 370 ננומטר) רגישות לשינויים מבניים הסביבה המקומית, ולא מתאים הפיקוח על היווצרות טריפלקס עם השאריות 2-aminopurine שולבו ליד איגוד (אתר הרשות הפלסטינית איור 6) 31. שלא כמו רבים אחרים צובעים המוצגים פליטת קרינה פלואורסצנטית לטווח הגלוי, 2-aminopurine-שכותרתו ' RNA ניתן לחשוף לחדר אור ללא צילום הלבנה. בניגוד דף ניסוי שבו מאגר הפעלה של pH 8.3 נדרש לעיתים קרובות, 2-aminopurine המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית טיטור מאפשרת מדידת מחייב פתרון אחד ב- pH שצוין, ובכך עלולה לאפשר את המידה ואת גילוי של חלשה יחסית, כריכת kinetically יציב על שיווי משקל.
UV-ספיגת-זיהה את תרמית ניסויים ההיתוך לאפשר את המדידה של יציבות תרמית של דופלקסים (איור 7)31 : triרכיבי plex30,32,44,45. בהתאם להרכב רצף לאורכה, כור ההיתוך של דופלקסים עלול או עשוי שלא להציג מעבר ברור. ניתן לקבל פרמטרים תרמודינמי אם העקומות חימום וקירור של חופפים. פרמטרים תרמודינמי מדויק ניתן להשיג על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC)32; עם זאת, כמויות גדולות יחסית של דגימות נדרשים בדרך כלל עבור המרכז לטניס בישראל.

<table style="border-collapse:collapse;width:491pt" width="654">
	<colgroup>
		<col style="width:176pt" width="235" />
		<col style="width:116pt" width="155" />
		<col span="3" style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl25" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl74" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">87956</td>
			<td style="width:66pt" width="88"></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&#376;HCl)</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl68" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">532444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B25251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acetic anhyride</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Kaiser Test Kit&#160;</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L06374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Unmodified PNA monomers</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">ASM Research Chemicals GmbH</td>
			<td class="xl70" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B8389 / 47624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Thioanisole</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoromethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A10173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">LiChrosper&#174; 100 RP-18 endcapped (5 &#181;m) LiChroCART&#174; 250-4</td>
			<td class="xl41">Merck Millipore</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">150838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">RNA Oligos&#160;</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">Customized&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">39468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td class="xl41">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">J15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">HEPES&#160;</td>
			<td class="xl41">Lonza</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N.N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">146072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td>
			<td class="xl41">1st Base</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">BUF-3010-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Glycerol&#160;</td>
			<td class="xl45">Promega&#160;</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">H5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethidium bromide (10 mg/mL)</td>
			<td class="xl45">Bio-rad&#160;</td>
			<td class="xl64" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl48" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td>
			<td class="xl49">Hellma Analytics&#160;</td>
			<td class="xl61" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">105.250-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

RNAs מתגלים סמנים ביולוגיים חשובים, מטרות טיפוליות. לפיכך, יש פוטנציאל אדיר בפיתוח הגששים כימי ליגנדים טיפולית על ההכרה של רצף ה-RNA ומבנה. מבחינה כימית שונה פפטיד חומצת גרעין (הרשות) oligomers פותחו לאחרונה שיכולים לזהות רנ א דופלקסים באופן ספציפי רצף. Pna יציבים מבחינה כימית עם שדרה פפטיד דמוי נייטרלי. Pna יכול להיות מסונתז יחסית בקלות באמצעות השיטה הידנית של סינתזה מוצק-פאזי פפטיד מפחיד-כימיה. Pna וגופם מטוהר באמצעות HPLC הפוכה-פאזי, ואחריו על ידי אפיון משקל מולקולרי לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון-שעה של טיסה (MALDI-TOF). Non-denaturing לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) טכניקה מקלה על ההדמיה של היווצרות טריפלקס, כי תוכנן בקפידה דופלקס חינם RNA בונה הרשות הפלסטינית מאוגד דופלקסים לעיתים קרובות המחירים שונים ההעברה הצג. Non-denaturing דף עם אתידיום ברומיד פוסט מכתים לעתים קרובות טכניקה קלה ואינפורמטיבי עבור אפיון את הזיקות מחייב ואת specificities של הרשות הפלסטינית oligomers. בדרך כלל, RNA סיכות או דופלקסים עם בסיס יחיד זוג מוטציות מרובות ניתן לאפיין את הרשות הפלסטינית מחייב מאפיינים, כגון איגוד הזיקות ו specificities. 2-Aminopurine הוא איזומר של אדנין (6-aminopurine); עוצמת קרינה פלואורסצנטית 2-aminopurine הוא רגיש לשינויים מבניים הסביבה המקומית, מתאים הפיקוח על היווצרות טריפלקס עם השאריות 2-aminopurine שולבו ליד באתר איגוד של הרשות הפלסטינית. 2-Aminopurine קרינה פלואורסצנטית טיטור יכול לשמש גם כדי לוודא את מידת הבררנות איגוד של PNAs ששונה לקראת זוגיות גדילי יישוב RNAs (dsRNAs) מעל חד גדילי RNAs (ssRNAs). UV-ספיגת-זיהה את תרמית ניסויים ההיתוך לאפשר את המדידה של יציבות תרמית של הרשות הפלסטינית-RNA דופלקסים ו PNA· רנ א2 דופלקסים. כאן, אנו מתארים את הסינתזה, טיהור של הרשות הפלסטינית oligomers שילוב שונה משקעים, והוא מתאר שיטות ביוכימיות biophysical פלואורסנציה ההכרה של RNA דופלקסים מאת Pna ששונה.

הפוך-פאזי HPLC מאפשר הטיהור של הרשות הפלסטינית oligomers. אפשר להשיג טהור oligomers הרשות הפלסטינית עם שני סיבובים של HPLC טיהור (איור 3). ניתן לאשר את הזהות של PNAs ניתוח MALDI-תוף (איור 4).
דף denaturing שאינם הוא טכניקה קלה ואינפורמטיבי עבור אפיון את הזיקות מחייב ואת specificities של הרשות הפלסטינית oligomers. בדרך כלל נשתמש RNA סיכות או דופלקסים מרובים עם מוטציות בסיס יחיד זוג כדי לאפיין את מאפייני האיגוד (איור 5). הלא denaturing דף הנתונים שמוצג באיור 5 בבירור מציע Q ו- L-מהונדס PNA יכול לזהות אזור dsRNA עם זוג C-G (איור 5B, החלונית התחתונה) אך לא אחד ללא זוג C-G (איור 5B, טופ לוח). הכרה זאת ספציפית ומשופרות היא דרך t · A-U, L· G-C, ו- Q· C-G PNA· רנ א2 -צורה משולשת הבסיס (איור 1A, C, D). Pna שונים עם מוטציות בודדות או רבות עשוי לשמש גם כדי להדגים את מאפייני איגוד משופרת הרשות הפלסטינית המתוקנת. הראינו כי הוספת 2 מ מ Mg2 + במאגר הדגירה אינה משפיעה על הכריכה באופן משמעותי31.
הראו על ידי טיטור פלורסצנטיות 2-aminopurine המאגד הרשות הפלסטינית Q ו- L-מהונדס אזור dsRNA יישוב (איור 6א, 6 C, 6 D) אולם לא ssRNA (איור 6B 6E, 6F). הרשות הפלסטינית P3 המאגד 2 aminopurine-שכותרתו dsRNA עם ערךד Kשל 0.8 ± 0.1 מיקרומטר. עוצמת קרינה פלואורסצנטית-370 ננומטר עבור ssRNA 2-aminopurine-שכותרתו ' נשאר קבוע יחסית עם ריכוז P3 מגוונת, המציין היעדר קשירה של הרשות הפלסטינית P3 ssRNA.
Pna המכיל Q משקעים (P2, P3) הצג לא תרמית התכה מעברים (איור 7), רומז לא מחייב ssRNA. זאת בשל ההתנגשות הסטריים נוכח ווטסון-קריק. כמו זוג Q-G. בהשוואה ל- P1 הרשות הפלסטינית שלא שונתה, P4 Pna ומכילה P5 ששינה שאריות L אך ללא שאריות Q, הצג ירדה טמפרטורות ההיתוך דופלקסים RNA-הרשות המתאימה בשל ההתנגשות הסטריים נוכח ווטסון-קריק. כמו זוג L-G. UV-ספיגת-זוהה תרמי ההיתוך הנתונים עקביים עם הנתונים טיטור פלורסצנטיות 2-aminopurine, אשר גם מראים כי הרשות הפלסטינית המכילה שאריות Q ו- L אפשרות לאגד ssRNA ניכרת (איור 6B 6E, 6F). בסיס Q הוא חמוד יותר מאשר בסיס L, כמו בסיס Q יש התנגשות הסטריים משמעותית יותר על היווצרות זוג ווטסון-קריק-כמו ש- G (איור 1F) לעומת זוג דמויי קריק ווטסון L G (איור 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
איור 1 : מבנה כימי של מבנים יציבים בסיס משולש ולא יציב זוג בסיסים. (י-ם) מייג'ור-groove PNA· רנ א2 משולשים הבסיס של t · A-U (), C+· G-C (B), L· G-C (ג) ו- Q· C-G (D). (E, F) לא יציב ווטסון-קריק כמו הרשות הפלסטינית-RNA בסיסי זוגות של L-G (E) ו- Q-G (F). האות R מייצגת את עמוד השדרה של סוכר-פוספט של RNA. קשרי מימן מסומנים באמצעות קווים מקווקווים שחור. הדמות המופקת מן ההפניה31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
איור 2 : מבנה כימי של הרשות הפלסטינית מונומרים. מוצגים ארבעה מונומרים הרשות הפלסטינית (T, C, L ו- Q). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
איור 3 : המבנה הכימי של הרשות הפלסטינית אוליגומר וכן טיהור על ידי RP-HPLC- (א) המבנה הכימי של הרצף הרשות הפלסטינית P3. (ב, ג) RP-HPLC נתונים של P3 הרשות הפלסטינית גולמי (B) מחדש לטהר P3 הרשות הפלסטינית (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
איור 4 : MALDI-TOF הספקטרום של P3 הרשות הפלסטינית מטוהרים. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
איור 5 : סיכת ראש ה-RNA, רצפים של הרשות הפלסטינית ואפיון מחייב מאת דף שאינם denaturing. סיכות (A) RNA (rHP1 ו- rHP2), הרשות הפלסטינית P3, PNA· רנ א2 טריפלקס נוצרו בין הרשות הפלסטינית P3 rHP2. דף Non-denaturing (B) (12%) תוצאות עבור rHP1 ו- rHP2 מחייב את הרשות הפלסטינית P3. המאגר הדגירה הוא 200 מ מ NaCl, 0.5 מ מ EDTA, 20 מ מ. HEPES, pH 7.5. סיכות RNA טעון (rHP1 ו- rHP2) הינם 1 מיקרומטר ב 20 µL. הריכוזים הרשות הפלסטינית הנמצאים בסמטאות משמאל לימין הם 0 0.2 0.4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, ו- 50 מיקרומטר. הרשות הפלסטינית P3 אפשרות לאגד rHP1 (לוח העליון) אבל נקשר rHP2 (פאנל התחתונה). (ג) Kנחישותd עבור איגוד P3 כדי rHP2. השבר של היווצרות טריפלקס (Y) הייתה להתוות נגד הריכוז הרשות הפלסטינית. הדמות היא ממאמרו של הפניה31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
איור 6 : קרינה פלואורסצנטית טיטור מחקר של איגוד הרשות הפלסטינית P3כדי הנקרא-2-aminopurine RNAs. השאריות 2-aminopurine מיועדת כמו '2' ברצף ה-RNA. המאגר הדגירה הוא 200 מ מ NaCl, 0.5 מ מ EDTA, 20 מ מ. HEPES, pH 7.5. (א) PNA· רנ א2 טריפלקס נוצרו בין P3 של dsRNA 2-aminopurine-שכותרתו ' (dsRNA2-2AP). דופלקס הרשות הפלסטינית-RNA היפותטי (B) A נוצר בין P3 ssRNA 2-aminopurine-שכותרתו ' (ssRNA2-2AP). (C, E) קרינה פלואורסצנטית ספקטרום הפליטה עבור 2-aminopurine-שכותרתו ' RNA דופלקס (1 מיקרומטר) ו ssRNA (1 מיקרומטר), בהתאמה, עם מגוון P3 ריכוז ב- pH 7.5. הפסגה-בסביבות 475 nm נובע פליטת קרינה פלואורסצנטית חלש הבסיס L הרשות הפלסטינית. (D, F) K נחישות d בהתבסס על העלילות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית 2-aminopurine (ב- 370 ננומטר) של RNA דופלקס, ssRNA, בהתאמה, לעומת הרשות הפלסטינית P3 ריכוז. הדמות היא ממאמרו של הפניה31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
איור 7 : תרמית התכה תוצאות ה-RNA-PNA דופלקסים. המאגר הדגירה הוא 200 מ מ NaCl, 0.5 מ מ EDTA, 20 מ מ NaH2PO4, pH 7.5. כל הדגימות להכיל 5 מיקרומטר RNA חד-גדילי (ssRNA1), ואת הרשות הפלסטינית ב- 130 µL. (א) RNA חד-גדילי (ssRNA1), Pna (P1, P2, P3, P4 ו P5) היפותטי דופלקס הרשות הפלסטינית-RNA שנוצר בין הרשות הפלסטינית P3 ssRNA1 בכיוון מקביל. הקלאש הסטריים הוא הצביע עבור ווטסון-מהנחל כמו ש- G ו- L-G זוגות. התכה (B) ' עקומות ' עבור Pna שונים מחייב את ssRNA1. טמפרטורות ההיתוך מוצגים על העיקולים עם התכה מעברים. הדמות היא ממאמרו של הפניה31.

Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

אנחנו מדווחים הפרוטוקולים לסינתזה ולשנות טיהור של פפטיד חומצת גרעין (הרשות) oligomers שילוב משקעים. שיטות אפיון ההכרה של RNA דופלקסים מאת Pna ששונה הביוכימי, biophysical מתוארים.

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

מבחני מזווג Conjugative עבור ניתוח רצף ספציפי של חלבוני העברה מעורבים קוניוגציה

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ&quot;א סתר החיפושית,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

כוח מיקרוסקופי אטומי חקירות של דלקת הנגע הכרה תיקון כריתה נוקליאוטידים

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

תא המבוסס על מבחני של SINEUP ללא קידוד RNAs זה במיוחד יכולה לשפר את התרגום mRNA

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

3'-Termini הקובע ורצפים של מולקולות Nascent חד גדילי ה-DNA הנגיפי במהלך HIV-1 הפוך שעתוק בתאים נגועים

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overexpressing RNAs Noncoding זמן באמצעות הפעלת גנים CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

בצפיפות גבוהה DNA ו-RNA מיקרומערכים-פוטוליתוגרפיה סינתזה, היברידיזציה והכנת ספריות גרעין גדול חומצות

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...