Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00
Duration: 9 min 4 s
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इस काम के लिए सिंगापुर शिक्षा मंत्रालय (मो) टियर 1 (RGT3/13 और RG42/15 से k.p.) और मो टीयर 2 (MOE2013-टी-2-024 और MOE2015-टी 1-028 k.p. करने के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था ।

यहां रिपोर्ट किए गए कार्य के आधार पर एक पेटेंट आवेदन (पैट/179/14/15/पीसीटी) दर्ज किया गया है ।

आरएनए डुप्लेक्स-बाइंडिंग ॄणा oligomers (उदा., 10-mers) मध्यम आकार के अणुओं वाले हैं और इस प्रकार एक तुलनीय या थोड़ा बड़ा आकार (उदा., ५०-मेर या छोटे) के साथ RNAs के बंधन पर electrophoretic गतिशीलता पारी दिखा सकते हैं । एक आरएनए ॄणा से काफी बड़ा है, तो अनुमापन में ॄणा के एक सीमित जेल गतिशीलता बदलाव के कारण काम नहीं हो सकता है । इस प्रकार, बड़ी आरएनए गैर denaturing पृष्ठ परख के लिए काट दिया जा सकता है । एक fluorophore-लेबल ॄणा में एक बड़ी आरएनए के अनुमापन जेल४०के बीच में लोड नमूना के साथ एक गैर denaturing agarose जेल द्वारा ट्रिपलेक्स गठन की निगरानी के लिए अनुमति देता है ।
आरएनए की एक निरंतर कुल एकाग्रता के साथ गैर-denaturing पृष्ठ द्वारा एक अनुमापन प्रयोग के लिए, हम आम तौर पर ethidium ब्रोमाइड द्वारा मुक्त आरएनए और ट्रिपलेक्स बैंड के दाग कुशल पद के लिए 1 µ एम के एक unलेबलित आरएनए एकाग्रता का उपयोग करें । ०.२ µ मीटर कम के रूप में एक आरएनए एकाग्रता भी आरएनए का निर्माण के आधार पर पर्याप्त हो सकता है31. अनलेबल्ड आरएनए की एकाग्रता (०.२ µ m) निर्धारित करती है कि Kd मान जो सही तरीके से मापा जा सकता है, लगभग ०.२ µ m या बड़ा होना चाहिए । अंय धुंधला रंजक धुंधला दक्षता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, हमारे अप्रकाशित डेटा का सुझाव है कि Cy3 डाई-लेबल RNAs गैर-denaturing पृष्ठ प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है तंग बाध्यकारी घटनाओं को मापने के लिए ।
तथ्य यह है कि 2-aminopurine केवल मामूली फ्लोरोसेंट है के कारण, 2-aminopurine प्रतिदीप्ति अनुमापन भी ०.२ µ m 31के लिए करीब या ऊपर के पास केd मान के साथ बाइंडिंग की माप तक ही सीमित है । आरएनए या ॄणा प्रतिदीप्ति अनुमापन के माध्यम से समाधान में एक अपेक्षाकृत तंग बंधन को बढ़ाता है के लिए एक अपेक्षाकृत उज्ज्वल डाई के साथ लेबल किया जा सकता है, अगर प्रतिदीप्ति संकेतों में परिवर्तन में बाध्यकारी परिणाम५३,५४, ५५.
dsRNA-binding PNAs द्वारा आरएनए संरचनाओं को लक्षित करने की रणनीति RNAs की एक सीमित संख्या के लिए परीक्षण किया गया है । यह संभव है कि बाइंडिंग गुण भिन्न अनुक्रम और आधार युग्म रचनाओं के साथ dsRNAs के लिए भिन्न हो सकते हैं । एक हमेशा TFPNAs के डिजाइन के लिए एक द्वैध के प्यूरिन अमीर किनारा चुन सकते हैं । यह महत्वपूर्ण है समझने के लिए कैसे लगातार क्यू · C-G ट्रिपल एक ट्रिपलेक्स की स्थिरता को प्रभावित कर सकता है । अधिक व्यापक अनुक्रम-निर्भर अध्ययन स्पष्ट रूप से TFPNAs के अनुक्रम पर निर्भर बाध्यकारी गुणों को समझने की जरूरत है ।
TFPNAs के बंधन संबध और आगे की लंबाई में वृद्धि से बढ़ाया जा सकता है और/या आगे कुर्सियां और रीढ़ की५६,TFPNAs के५७ संशोधित । हालांकि, एक निरंतर डुप्लेक्स क्षेत्र अक्सर गैर-वाट्सन-क्रिकेटरों संरचनाओं द्वारा व्यवधान के बिना 10 से अधिक लगातार आधार जोड़े से मिलकर हो सकता है नहीं है । dsRNA क्षेत्रों से सटे गैर-वाट्सन-क्रिकेटरों संरचनाओं की मांयता के लिए एक छोटे अणुओं के साथ TFPNAs संयुग्म हो सकता है । सिद्धांत रूप में, एक TFPNA-छोटे अणु संयुग्म एक TFPNA या छोटे अणु अकेले की तुलना में बढ़ाया बंधन संबध और विशिष्टता की उंमीद है । हालांकि, विकार५८,५९,६०,६१,६२,६३,६४ के लिए लिंकर के रासायनिक और भौतिक गुण अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
तथ्य यह है कि TFPNAs चुनिंदा ssRNAs पर dsRNAs के लिए बाध्य कर सकते है और dsDNAs पता चलता है कि यह आरएनए संरचनात्मक गतिशीलता और साथ बातचीत के विनियमन के माध्यम से बहुत उपयोगी रासायनिक जांच और संभावित चिकित्सीय TFPNAs के रूप में लाइगैंडों विकसित करने के लिए संभव है प्रोटीन्स आणि चयापचयों. सेलुलर TFPNAs के साथ विकार के माध्यम से सुविधा हो सकती है सेल-मर्मज्ञ moieties जैसे छोटे अणुओं, पेप्टाइड्स, और नैनोकणों, या अणुकणिका संरचनाओं के साथ रंग जैसे liposomes5,6 ,12,17,25,31,४१,६५,६६. इसके अलावा fluorophores और radioisotopes जैसे functionalization इमेजिंग टैग के साथ TFPNAs का पता लगाने, इमेजिंग, और रहने वाले जीवों में कार्यात्मक आरएनए संरचनाओं के लक्ष्यीकरण की सुविधा हो सकती है ।

RNAs के विनियमन और विविध जैविक प्रक्रियाओं के catalysis में RNAs ' भूमिकाओं की खोजों में हाल ही में अग्रिमों के कारण महत्वपूर्ण जैव चिह्नों और चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में उभर रहे हैं,1,2,3. परंपरागत रूप से, antisense किस्में वाट्सन-क्रिकेटरों द्वैध गठन3,4,5,6,7,8, के माध्यम से ssRNAs के लिए बाइंड करने के लिए इस्तेमाल किया गया है 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. हाल ही में, ट्रिपलेक्स-बनाने पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (TFPNAs) को Hoogsteen हाइड्रोजन बांडिंग (चित्रा 1)3,28,29के माध्यम से dsRNAs को बांध डिजाइन किया गया है । dsRNA क्षेत्रों पारंपरिक antisense-लक्षित RNAs के बहुमत में मौजूद हैं, पूर्व mRNAs और mRNAs सहित, पूर्व या पंचायती राज-miRNAs3, और कई अंय गैर कोडिंग RNAs1,26,27। TFPNAs का उपयोग कर ट्रिपल कुंडलित गठन के माध्यम से dsRNAs लक्ष्यीकरण अपनी संरचना विशिष्टता के कारण लाभप्रद हो सकता है और RNAs, जो रोगों में dysregulated हैं, उदाहरण के लिए के सामान्य कार्यों को बहाल करने में उपयोग के लिए महान क्षमता का है.
हाल ही में प्रकाशित Rozners एट अलद्वारा काम करते हैं, और अमेरिका3,28,29,30,31,३२,३३, ३४,३५,३६,३७,३८,३९,४०,४१, सुधार पर प्रयासों की रिपोर्ट एन्हांस्ड अपनत्व के साथ dsRNAs के प्रति संशोधित TFPNAs का चयनात्मक बंधन. हमने तर्कसंगत रूप से डिजाइन किए ॄणा मोनोमर (चित्रा 2) के लिए संश्लेषण विधियों का विकास किया है जिसमें thio-pseudoisocytosine (L) मोनोमर30 और guanidine-संशोधित 5-मिथाइल cytosine (Q) मोनोमर31शामिल हैं । विभिंन जैव रासायनिक और भौतिक लक्षण वर्णन विधियों के माध्यम से, हम प्रदर्शन किया है कि अपेक्षाकृत कम PNAs (6-10 अवशेषों) शामिल एल और क्यू अवशेषों वाटसन की मांयता में सुधार दिखा-क्रिकेटरों जी सी और सी जी आधार जोड़े, क्रमशः, dsRNAs में । इसके अलावा, unसंशोधित PNAs की तुलना में, एल और क्यू अवशेषों युक्त PNAs ssRNA और dsDNA से अधिक dsRNA की ओर अधिक चयनात्मक बाध्यकारी दिखाते हैं । Q आधार में guanidine कार्यक्षमता४२ हेला कक्ष31दर्ज करने के लिए PNAs सक्षम करता है ।
हमारी प्रयोगशाला में, हम मैनुअल बीओसी-रसायन PNAs द्वारा संश्लेषित (बीओसी या टी-बीओसी टर्ट-butyloxycarbony के लिए खड़ा है ( चित्रा 2) ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण विधि4देखें. अमीन की रक्षा समूह के रूप में बीओसी के साथ ॄणा मोनोमर के संश्लेषण बीओसी समूह sterically की तुलना में कम भारी fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) अमीन की रक्षा समूह है, जो ॄणा मोनोमर युग्मन के दौरान लाभप्रद हो सकता है के रूप में सुविधाजनक है ठोस समर्थन । बीओसी समूह अम्ल-labile है और dichloromethane संश्लेषण के दौरान ॄणा (डीसीएम) में 20-50% trifluoroacetic अम्ल (TFA) द्वारा ठोस समर्थन पर आसानी से निकाला जा सकता है. एक स्वचालित पेप्टाइड सिंथेसाइज़र ॄणा oligomers संश्लेषित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है; हालांकि, 3-5-गुना अधिक ॄणा मोनोमर एक स्वचालित पेप्टाइड सिंथेसाइज़र के लिए आवश्यक है । मैनुअल संश्लेषण के लिए काफी कम ॄणा मोनोमर (2-3 गुना अधिक), प्रत्येक युग्मन आसानी से कैसर टेस्ट४३द्वारा निगरानी के साथ) की आवश्यकता है. इसके अलावा, कई स्वचालित सिंथेसाइज़र बीओसी हटाने कदम के दौरान संक्षारक TFA के उपयोग के कारण बीओसी रणनीति संश्लेषण के साथ संगत नहीं हैं ।
ॄणा oligomers से शुद्ध किया जा सकता है रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (आरपी-HPLC) द्वारा आणविक वजन लक्षण वर्णन द्वारा पीछा मालदी-तोफ (आंकड़े 3 और 4)30, 31. हम ट्रिपलेक्स गठन की निगरानी के लिए गैर-denaturing पृष्ठ को नियोजित करते हैं, इस तथ्य के कारण कि मुक्त आरएनए डुप्लेक्स का निर्माण और ॄणा बाउंड triplexes अक्सर विभिन्न माइग्रेशन दरें दर्शाते हैं (चित्र 5)30,31 . कोई लेबलिंग की जरूरत है अगर कुशल पद-धुंधला आरएनए द्वैध और ॄणा के दोनों के लिए प्राप्त किया जा सकता है · आरएनए२ ट्रिपलेक्स बैंड्स. गैर-denaturing पृष्ठ प्रयोगों के लिए नमूना की एक अपेक्षाकृत छोटी राशि की जरूरत है. हालांकि, लोड हो रहा है (मशीन) बफ़र्स और चल रहे बफ़र्स (pH ८.३) वही नहीं हो सकता है, जो माप में जिसके परिणामस्वरूप, काइनेटिक स्थिर triplexes तक सीमित किया जा रहा है, क्योंकि ८.३ के एक अपेक्षाकृत उच्च पीएच काफी एक ट्रिपलेक्स अस्थिर हो सकता है ।
2-Aminopurine adenine (6-Aminopurine) का एक isomer है; 2-aminopurine प्रतिदीप्ति तीव्रता (लगभग ३७० एनएम पर एक उत्सर्जन चोटी के साथ) स्थानीय संरचनात्मक पर्यावरण परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है, और 2-aminopurine ॄणा बंधन साइट के पास शामिल अवशेषों के साथ ट्रिपलेक्स गठन की निगरानी के लिए उपयुक्त है ( चित्र 6) 31. कई अन्य रंगों के विपरीत जो दिखाई देने वाले रेंज में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन दिखाते हैं, 2-aminopurine-लेबल आरएनए बिना फोटो ब्लीचिंग के कमरे की रोशनी से अवगत कराया जा सकता है । पृष्ठ प्रयोग में जो पीएच ८.३ की एक चल बफर अक्सर जरूरत है विपरीत, 2-aminopurine आधारित प्रतिदीप्ति अनुमापन एक निर्दिष्ट पीएच में एक समाधान में बाध्यकारी की माप की अनुमति देता है, और इस तरह माप और अपेक्षाकृत कमजोर का पता लगाने की अनुमति हो सकती है और संतुलन में काइनेटिक अस्थिर बाध्यकारी ।
यूवी-अवशोषक का पता लगाया थर्मल पिघलने प्रयोगों डुप्लेक्स की थर्मल स्थिरता की माप की अनुमति (चित्रा 7)31 और त्रिकोणीयplexes30,३२,४४,४५. लंबाई और अनुक्रम संरचना पर निर्भर करता है, triplexes के पिघलने या एक स्पष्ट संक्रमण नहीं दिखा सकते हैं । ताप और शीतलन घटता ओवरलैप अगर ऊष्मा मापदंडों प्राप्त किया जा सकता है । सटीक ऊष्मा मापदंडों इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry (आईटीसी)३२द्वारा प्राप्त किया जा सकता है; हालांकि, अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में नमूनों की आम तौर पर आईटीसी के लिए आवश्यकता होती है ।

<table style="border-collapse:collapse;width:491pt" width="654">
	<colgroup>
		<col style="width:176pt" width="235" />
		<col style="width:116pt" width="155" />
		<col span="3" style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl25" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl74" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">87956</td>
			<td style="width:66pt" width="88"></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&#376;HCl)</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl68" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">532444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B25251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acetic anhyride</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Kaiser Test Kit&#160;</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L06374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Unmodified PNA monomers</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">ASM Research Chemicals GmbH</td>
			<td class="xl70" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B8389 / 47624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Thioanisole</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoromethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A10173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">LiChrosper&#174; 100 RP-18 endcapped (5 &#181;m) LiChroCART&#174; 250-4</td>
			<td class="xl41">Merck Millipore</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">150838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">RNA Oligos&#160;</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">Customized&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">39468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td class="xl41">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">J15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">HEPES&#160;</td>
			<td class="xl41">Lonza</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N.N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">146072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td>
			<td class="xl41">1st Base</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">BUF-3010-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Glycerol&#160;</td>
			<td class="xl45">Promega&#160;</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">H5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethidium bromide (10 mg/mL)</td>
			<td class="xl45">Bio-rad&#160;</td>
			<td class="xl64" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl48" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td>
			<td class="xl49">Hellma Analytics&#160;</td>
			<td class="xl61" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">105.250-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

RNAs महत्वपूर्ण उपमार्क्स और चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में उभर रहे हैं । इस प्रकार, आरएनए अनुक्रम और संरचना की मांयता के लिए रासायनिक जांच और चिकित्सीय लाइगैंडों के विकास में काफी क्षमता है । रासायनिक संशोधित पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (ॄणा) oligomers हाल ही में विकसित किया गया है कि एक अनुक्रम विशेष तरीके से आरएनए डुप्लेक्स पहचान कर सकते हैं । PNAs एक तटस्थ पेप्टाइड की तरह रीढ़ के साथ रासायनिक रूप से स्थिर हैं । PNAs मैनुअल बीओसी-रसायन ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण विधि द्वारा अपेक्षाकृत आसानी से संश्लेषित किया जा सकता है । PNAs रिवर्स चरण HPLC द्वारा शुद्ध कर रहे हैं, मैट्रिक्स द्वारा आणविक वजन लक्षण वर्णन द्वारा पीछा-लेजर desorption/ionization-उड़ान के समय (मालदी-तोफ) । गैर denaturing polyacrylamide जेल ट्रो (पृष्ठ) तकनीक ट्रिपलेक्स गठन के इमेजिंग की सुविधा है, क्योंकि ध्यान से मुक्त आरएनए डुप्लेक्स constructs और ॄणा बाउंड triplexes अक्सर विभिन्न माइग्रेशन दरों दिखा । ethidium ब्रोमाइड पद धुंधला के साथ गैर denaturing पृष्ठ अक्सर निस्र्पक के लिए एक आसान और जानकारीपूर्ण तकनीक है समानताएं ॄणा की बाध्यकारी oligomers और विशिष्टताओं । आम तौर पर, एकाधिक आरएनए hairpins या एक आधार जोड़ी उत्परिवर्तनों के साथ डुप्लेक्स ॄणा बाध्यकारी गुणों, जैसे बाध्यकारी समानताएं और विशिष्टताओं को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 2-Aminopurine adenine (6-Aminopurine) का एक isomer है; 2-aminopurine प्रतिदीप्ति तीव्रता स्थानीय संरचनात्मक पर्यावरण परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है, और 2-aminopurine ॄणा बंधन साइट के पास शामिल अवशेषों के साथ ट्रिपलेक्स गठन की निगरानी के लिए उपयुक्त है । 2-Aminopurine प्रतिदीप्ति अनुमापन भी लक्षित डबल-असहाय PNAs (RNAs) पर एकल-कतरा dsRNAs (RNAs) के प्रति संशोधित ssRNAs की बाध्यकारी selectivity की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यूवी-अवशोषक का पता लगाया थर्मल पिघलने प्रयोगों ॄणा की थर्मल स्थिरता की माप की अनुमति-आरएनए डुप्लेक्स और ॄणा · आरएनए२ triplexes. यहां, हम संश्लेषण और संशोधित अवशेषों को शामिल ॄणा oligomers के शुद्धिकरण का वर्णन, और संशोधित PNAs द्वारा आरएनए द्वैध की मांयता के लक्षण वर्णन के लिए जैव रासायनिक और भौतिक तरीकों का वर्णन ।

रिवर्स-फेज HPLC ॄणा oligomers की शुद्धि की अनुमति देता है । हम HPLC शुद्धि (चित्रा 3) के दो फेरे के साथ शुद्ध ॄणा oligomers प्राप्त कर सकते हैं । PNAs की पहचान मालदी-तोफ एनालिसिस (figure 4) द्वारा पुष्टि की जा सकती है ।
गैर denaturing पृष्ठ ॄणा oligomers के बंधन समानताएं और विशिष्टताओं निस्र्पक के लिए एक आसान और जानकारीपूर्ण तकनीक है । हम आमतौर पर एक आधार जोड़ी उत्परिवर्तनों के साथ एकाधिक आरएनए hairpins या डुप्लेक्स का उपयोग करने के लिए बाध्यकारी गुणों की विशेषताएं (चित्र 5) । आरेख 5 में दिखाया गया गैर-denaturing पृष्ठ डेटा स्पष्ट रूप से सुझाता है कि Q-और L-संशोधित ॄणा एक dsRNA क्षेत्र को C-G pair (figure 5Bके साथ पहचान सकता है, नीचे पैनल) लेकिन एक सी-जी जोड़ी के बिना एक नहीं (चित्रा 5बी, शीर्ष पैनल) । इस विशिष्ट और बढ़ाया मांयता टी के माध्यम से है · अ-य U, L · छ-ग, व Q · प-छ ॄणा · आरएनए2 बेस ट्रिपल (चित्रा 1ए, सी, डी) गठन । एकल या एकाधिक उत्परिवर्तनों के साथ विभिंन PNAs भी एक संशोधित ॄणा के सुधार बाध्यकारी गुणों को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमें पता चला है कि जोड़ने 2 मिमी मिलीग्राम2 + में मशीन बफर बाध्यकारी महत्वपूर्ण31को प्रभावित नहीं करता है.
हम 2 द्वारा प्रदर्शन किया है-aminopurine प्रतिदीप्ति अनुमापन कि एक क्ष और एल संशोधित ॄणा एक लक्षित dsRNA क्षेत्र में बांध (चित्रा 6ए, 6C, 6D) लेकिन नहीं ssRNA (चित्रा 6बी, 6E, 6F) । ०.८ ± ०.१ µ एम के एक Kd मान के साथ 2-aminopurine-लेबल्ड dsRNA को ॄणा p बाइंड कर देता है । 2-aminopurine-लेबल ssRNA के लिए ३७० एनएम पर प्रतिदीप्ति तीव्रता विविध पी 3 एकाग्रता के साथ अपेक्षाकृत स्थिर रहता है, ssRNA के लिए ॄणा p के बंधन की कमी का संकेत है ।
Q अवशेषों से युक्त PNAs (P2 और पी 3) कोई थर्मल पिघलने संक्रमण (चित्रा 7) दिखाने के लिए, ssRNA के लिए कोई बंधन का सुझाव. ऐसा क्यू-जी पेयर की तरह वॉटसन-क्रिकेटरों में मौजूद steric क्लैश के कारण हो रहा है । संशोधित ॄणा P1, PNAs पी 4 और संशोधित एल अवशेषों युक्त P5 की तुलना में, लेकिन कोई क्ष अवशेषों, दिखाने के लिए इसी आरएनए-ॄणा steric में उपस्थित संघर्ष के कारण के लिए पिघलने तापमान में कमी आई वाटसन-जी जोड़ी की तरह क्रिकेटरों । यूवी-अवशोषक का पता लगाया थर्मल पिघलने डेटा 2-aminopurine प्रतिदीप्ति अनुमापन डेटा के साथ संगत कर रहे हैं, जो भी पता चलता है कि एक क्ष और एल अवशेषों युक्त ॄणा ssRNA appreciably (चित्रा 6बी, 6E, 6F) को बांध नहीं है । एक क्ष आधार को शामिल एक एल आधार से अधिक स्थिर है, के रूप में एक q आधार एक वाटसन के गठन में एक अधिक महत्वपूर्ण steric टकराव है क्रिकेटरों-q-g जोड़ी (चित्रा 1एफ) की तुलना में एक वाटसन-क्रिकेटरों की तरह एल-जी जोड़ी (चित्रा 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
चित्र 1 : स्थिर बेस ट्रिपल और अस्थिर आधार जोड़ी संरचनाओं के रासायनिक संरचनाओं । (A-D) प्रमुख-नाली ॄणा · आरएनए2 बेस ट्रिपल ऑफ टी · क-भ (क), ग+· जी सी (ख), L · छ-ग (ग), और Q · C-G (D) । (E, F) L-g (E) और Q-g (F) के ॄणा-आरएनए आधार जोड़े की तरह अस्थिर वाट्सन-क्रिकेटरों । पत्र आर आरएनए के चीनी फॉस्फेट रीढ़ का प्रतिनिधित्व करता है । हाइड्रोजन बांड काले डैश्ड लाइनों द्वारा संकेत कर रहे हैं । यह आंकड़ा संदर्भ31से reproduced है । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
चित्र 2 : ॄणा मोनोमर की रासायनिक संरचनाओं । चार ॄणा मोनोमर (टी, सी, एल, और क्यू) दिखाए जाते हैं । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
चित्र 3 : एक ॄणा oligomer और आरपी-HPLC द्वारा शुद्धि की रासायनिक संरचना । (क) ॄणा अनुक्रम पी पी के रासायनिक संरचना । (B, C) आरपी-क्रूड ॄणा p (B) के HPLC डेटा और पुन: शुद्ध ॄणा पी पी (सी) । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
चित्र 4 : मालदी-प्रशुद्ध ॄणा पी पी पी की तोफ स्पेक्ट्रम । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
चित्र 5 : आरएनए कांटा और ॄणा अनुक्रम और गैर-denaturing पृष्ठ द्वारा बाध्यकारी लक्षण वर्णन। (A) आरएनए hairpins (rHP1 and rHP2), ॄणा p, and A ॄणा · आरएनए 2 ट्रिपलेक्स ॄणा पी3 और rHP2 के बीच गठित । (B) गैर-denaturing पृष्ठ (12%) rHP1 और rHP2 बाइंडिंग के लिए परिणाम ॄणा पी 3 के लिए । इस मशीन बफर २०० mm NaCl, ०.५ mm EDTA, 20 mm HEPES, पीएच ७.५ है । लोडेड आरएनए hairpins (rHP1 और rHP2) २० µ एल में १ µ मीटर पर हैं. बाएं से दाएं गलियों में ॄणा सांद्रता है 0, ०.२, ०.४, 1, १.६, 2, 4, 10, 16, 20, 28, और ५० µ m. ॄणा पी 3 rHP1 (ऊपर पैनल) को बांध नहीं है, लेकिन rHP2 को बांध (नीचे पैनल) । (C) Kd rHP2 के लिए p बाइंडिंग के लिए निर्धारण । ट्रिपलेक्स गठन (वाई) के अंश ॄणा एकाग्रता के खिलाफ साजिश रची गई थी । यह आंकड़ा31संदर्भ से अनुकूलित है । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
चित्र 6 : प्रतिदीप्ति अनुमापन अध्ययन के ॄणा p बाइंडिंगते २-aminopurine-त्यसपछि RNAs । 2-aminopurine अवशेषों को आरएनए अनुक्रम में ' 2 ' के रूप में नामित किया गया है । इस मशीन बफर २०० mm NaCl, ०.५ mm EDTA, 20 mm HEPES, पीएच ७.५ है । (क) एक ॄणा · आरएनए2 ट्रिपलेक्स और एक 2-aminopurine-लेबल dsRNA (dsRNA2-2AP) के बीच गठित । (B) एक काल्पनिक ॄणा-आरएनए डुप्लेक्स p और A 2-aminopurine-लेबल्ड ssRNA (ssRNA2-2AP) के बीच बनाया गया । (ग, ङ) 2-aminopurine-लेबल आरएनए डुप्लेक्स (1 µ m) और ssRNA (1 µ m) के लिए प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा, क्रमशः पीएच ७.५ पर विविध पी 3 एकाग्रता के साथ । लगभग ४७५ एनएम पर पीक ॄणा में एल बेस के कमजोर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के कारण है । (घ, च) कश्मीर 2-aminopurine प्रतिदीप्ति तीव्रता (आरएनए द्वैध और ssRNA के ३७० एनएम) के भूखंडों के आधार पर, क्रमशः ॄणा पी 3 एकाग्रता बनाम निर्धारण । यह आंकड़ा31संदर्भ से अनुकूलित है । <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
चित्र 7 : आरएनए-ॄणा डुप्लेक्स के लिए थर्मल पिघलने के परिणाम । इस मशीन बफर २०० mm NaCl, ०.५ mm EDTA, 20 mm2PO4, ७.५ पीएच है । सभी नमूनों में १३० µ एल में एकल-कतरा आरएनए (ssRNA1) और ॄणा के 5 µ एम होते हैं । (क) एकल कतरा आरएनए (ssRNA1), PNAs (P1, P2, पी 4, और P5) और एक काल्पनिक ॄणा-आरएनए द्वैध एक समानांतर अभिविन्यास में ॄणा पी सी और ssRNA1 के बीच का गठन. Q-g और L-g जोड़े की तरह वाट्सन-क्रिकेटरों के लिए steric क्लैश दर्शाया गया है । (ख) ssRNA1 के लिए अलग PNAs बंधन के लिए पिघलने घटता । पिघलने तापमान पिघलने संक्रमण के साथ घटता के लिए दिखाए जाते हैं । यह आंकड़ा31संदर्भ से अनुकूलित है ।

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Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

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