Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00
Duration: 9 min 4 s
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この作品は、(RGT3/13 ・ RG42/15 g. c. に) 教育 (MOE) の層 1 のシンガポール省と萌え層 2 (MOE2013-T2-2-024 と g. c. に MOE2015-T2-1-028) によって支持されました。

ここで報告される作業に基づく特許出願 (パット/179/14/15/PCT) が提出されています。

RNA 二重バインディング PNA オリゴマー (例えば、10 mers) 中型の分子でありこうして示すことができる結合する電気泳動の移動性シフト Rna に同等またはわずかに大きいサイズの (例えば、50 mer またはより小さい)。RNA が PNA よりも著しく大きい場合、RNA に PNA の滴定が限られたゲルの移動性シフトのため機能しません。したがって、ページの非変化試金のため大規模な RNA が切り捨てられます。大規模な RNA の蛍光ラベルの PNA に滴定ゲル40の途中でロード サンプル非変化のアガロースゲル三重鎖形成の監視が可能です。
RNA の一定濃度の非変化ページによる滴定実験のため通常効率的な投稿が無料 RNA と三重のバンドのエチジウム ブロマイドで染色の 1 μ M のラベルの RNA 濃度を使用します。RNA 濃度 0.2 μ M としては RNA 構造31によって十分な場合もあります。ラベル付けされていない RNA 濃度 (0.2 μ M) は 0.2 μ M 程度より大きいこと正確に測定することができるKd値を決定します。他の染色の染料は、染色の効率を高めるために使えます。また、未発表データは、タイトなバインディング イベントを測定する非変化ページ実験で Cy3 色素標識 Rna が使えるをお勧めします。
による 2-アミノプリンは適度蛍光灯のみ、という事実のためにによる 2-アミノプリンの蛍光滴定してKd値 0.2 μ M31以上に近い結合の測定に限られています。蛍光信号53,54,の変化における結合結果する場合蛍光滴定液で比較的タイトなバインドを定量化するための比較的明るい染料 RNA または PNA で付いたことがあります。55。
PNAs の dsRNA バインディングによって RNA の構造を対象とする戦略は、Rna の限られた数のテストされています。シーケンスと塩基組成の異なる二本のバインディング プロパティが異なることが考えられます。1 つは常に TFPNAs の設計のための二重のプリン豊富なストランドを選択可能性があります。どのように連続 q · を理解することが重要C G トリプル、トリプレックスの安定性に影響を与える可能性があります。広範なシーケンスに依存した研究は明らかに TFPNAs の配列依存的結合特性を理解する必要です。
TFPNAs の結合親和性は、長くおよび/または TFPNAs の基盤およびバックボーン用56,57のさらなる変更によってさらに強化できます。ただし、連続二重地域がしばしば成り立たない、中断することがなく 10 以上の連続塩基の非ワトソン Crick 構造によって。TFPNAs を共役 dsRNA 地域に隣接する非ワトソン Crick 構造の認識のための小分子で 1 つ可能性があります。原則として、TFPNA 小分子の共役結合親和性と TFPNA や小さな分子だけに比べて特異性が強化されます。ただし、活用58,59,60,61,62,63,64 リンカーの化学および物理的特性最適化する必要があります。
TFPNAs は ssRNAs と二本、二本に選択的にバインドできますという事実を示唆非常に有用なプローブと RNA 構造力学との相互作用の調節を介して潜在的な治療のリガンドとして TFPNAs を開発することが可能です。タンパク質と代謝産物。低分子、ペプチド、ナノ粒子などの細胞貫通部分の活用やリポソーム56,などの超分子構造との錯形成を通して TFPNAs の細胞内取り込みを促進することがあります。 ,12,17,25,31,41,65,66。さらに蛍光物質や放射性同位元素などのバイオ イメージング タグ TFPNAs の高機能化は、検出、イメージング、および生きている有機体の機能性 RNA の構造のターゲットを促進するかもしれない。

Rna の重要なバイオ マーカーおよび調節における Rna の役割の発見と多様な生物学的プロセス1,2,3の触媒の最近の進歩のための治療上のターゲットとして浮上しています。伝統的に、アンチセンス鎖はワトソン Crick 二重形成3,4,5,6,7,8、を ssRNAs にバインドに使用されています。9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. 最近、三重鎖形成性ペプチド核酸 (TFPNAs) は、接合 (図 1)3,28,29Hoogsteen 水素経由で二本にバインドする設計されています。dsRNA 地域は Mrna および Mrna、事前または pri miRNAs3、多く他非コーディング RNAs1,26,27など伝統的なアンチセンス標的 Rna の大部分であります。TFPNAs を使用して三重らせんを形成を通して二本を対象とその構造の特異性のため有利になること、調節不全疾患では、例えば Rna の正常な機能を復元するのに使えない可能性大です。
最近公開された3,28,29,30,31,32,33、Roznersらと私たちの仕事 34,35,36,37,38,39,40,41, 改善の努力を報告強化された関係を持つ二本に向けて変更された TFPNAs の選択的結合。チオ-pseudoisocytosine (L) モノマー30グアニジン変更 5-メチル シトシン (Q) モノマー31など合理的に設計の PNA モノマー (図 2) の合成法を開発しました。さまざまな生化学と生物物理学的評価方法により L と Q 残基を組み込んだ比較的短い PNAs (6-10 残基) が二本でそれぞれ、ワトソン Crick G C と C G の塩基対の認識率が改善を示すことを確認しました。また、L と Q 残基を含む PNAs 未変更 PNAs に比べると、宿主と dsDNA dsRNA の方より選択的バインドを表示しています。Q ベースのグアニジン機能42 HeLa 細胞31を入力する PNAs ができます。
当研究室で合成マニュアルの Boc 化学 PNAs (Boc またはt- Boc の略 tert butyloxycarbony (図 2参照) 固相ペプチド合成方法4。アミンの保護基として Boc と PNA モノマーの合成は、Boc のグループは PNA 単量体結合中に有益であるかもしれないグループを保護する fluorenylmethyloxycarbonyl (fmoc 保護) アミンと比較して立体かさばらず便利なしっかりサポート。Boc のグループは酸に不安定、簡単に削除できます固体支持の 20-50% トリフルオロ酢酸 (TFA) ジクロロ メタン (DCM) で PNA 合成時に。自動ペプチド合成は PNA オリゴマーの合成に用いることができます。ただし、PNA 単量体の 3-5 倍の過剰は、自動ペプチド合成に必要です。手動合成には、大幅に少ない PNA モノマー (2 ~ 3 倍過剰)、各結合カイザー テスト43で容易に監視が必要です。また、多くの自動化されたシンセサイザー Boc 除去ステップ中に腐食性 TFA の使用のため Boc 戦略合成との互換性はありません。
逆相高速液体クロマトグラフィー (クロマトグラフィー) MALDI-TOF の分子量特性評価に続いて、PNA オリゴマーを浄化することが (図 3 と4)30,31. 三重鎖形成を監視するという無料の RNA 二重を構築し、PNA は頻繁におしゃれをバインドされているためにを表示別の移行率 (図 5)30,31ページの非変化を用いて.ラベルは必要ありません RNA 二重と PNA· の両方の効率化後染色が得られるならRNA2三重バンド。比較的少量の試料は、非変性ページ実験に必要です。ただし、読み込み (インキュベーション) バッファーおよび実行バッファー (pH 8.3) できない場合があります同じ 8.3 の比較的高い pH は大きく、トリプレックスを揺るがす可能性がありますので、速度論的に安定したおしゃれに限定されている測定の結果します。
による 2-アミノプリン アデニン (6-アミノプリン); の異性体でありによる 2-アミノプリンの蛍光強度 (約 370 に発光ピークを持つ nm) はローカル構造的な環境変化に敏感とバインド サイト (PNA 近く設立による 2-アミノプリンの残基三重鎖形成の監視に適しています図 6)31. 多く他の染料は目に見える範囲で蛍光性の放出を示すとは異なり 2-アミノプリン標識 RNA が写真漂白なし室内灯に公開できます。実行バッファー pH 8.3 がしばしば必要となるページの実験とは異なりによる 2-アミノプリンの蛍光滴定指定した pH で 1 つのソリューションに結合の測定が可能、測定と比較的弱いの検出可能性があることと速度論的に不安定な平衡のバインディングします。
UV 吸光度検出熱溶融実験許可二重 (図 7)31とトライの熱安定性の測定プレックス30,32,44,45。長さとシーケンスの組成によっておしゃれの融解は、明確な転移を示さないかもしれない。熱力学的パラメーターは、加熱と冷却曲線が重なっている場合に得られるかもしれない。等温滴定熱量測定 (ITC)32; 正確な熱力学的パラメーターを取得します。ただし、比較的大量のサンプルが ITC の一般的に必要です。

<table style="border-collapse:collapse;width:491pt" width="654">
	<colgroup>
		<col style="width:176pt" width="235" />
		<col style="width:116pt" width="155" />
		<col span="3" style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl25" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl74" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">87956</td>
			<td style="width:66pt" width="88"></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&#376;HCl)</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl68" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">532444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B25251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acetic anhyride</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Kaiser Test Kit&#160;</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L06374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Unmodified PNA monomers</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">ASM Research Chemicals GmbH</td>
			<td class="xl70" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B8389 / 47624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Thioanisole</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoromethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A10173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">LiChrosper&#174; 100 RP-18 endcapped (5 &#181;m) LiChroCART&#174; 250-4</td>
			<td class="xl41">Merck Millipore</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">150838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">RNA Oligos&#160;</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">Customized&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">39468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td class="xl41">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">J15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">HEPES&#160;</td>
			<td class="xl41">Lonza</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N.N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">146072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td>
			<td class="xl41">1st Base</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">BUF-3010-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Glycerol&#160;</td>
			<td class="xl45">Promega&#160;</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">H5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethidium bromide (10 mg/mL)</td>
			<td class="xl45">Bio-rad&#160;</td>
			<td class="xl64" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl48" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td>
			<td class="xl49">Hellma Analytics&#160;</td>
			<td class="xl61" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">105.250-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

Rna の重要なバイオ マーカーおよび治療上のターゲットとして浮上しています。従って、化学プローブや RNA 配列および構造の認識のため治療上の配位子の開発に大きな可能性があります。化学修飾ペプチド核酸 (PNA) オリゴマーが最近開発されているシーケンス固有の方法で RNA 二重鎖を認識することができます。PNAs は中立的なペプチドのようなバックボーンを持つ化学的に安定しています。PNAs は、その手動 Boc 化学固相ペプチド合成法によるは簡単に比較的合成することができます。PNAs、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化-時間飛行 (MALDI-TOF) の分子量特性によって続いて逆相 HPLC により精製しました。非変化のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) 法を容易に三重鎖形成のイメージングを慎重に設計無料 RNA 二重を構築し、PNA は頻繁におしゃれをバインドされているのでショー別の移行率。エチジウム ブロマイド ポスト染色と非変性のページはしばしば結合親和性と PNA オリゴマーの特異性を特徴付けるための簡単で有益な技術です。通常、複数の RNA のヘアピン構造または単一塩基変異は、PNA のバインディング プロパティ、親和性と特異性のバインドなどの特性評価に使用できます。による 2-アミノプリン アデニン (6-アミノプリン); の異性体でありによる 2-アミノプリンの蛍光強度はローカル構造的な環境変化に敏感な三重鎖形成による 2-アミノプリンの残基の PNA 結合部位付近の監視に適しています。による 2-アミノプリンの蛍光滴定は、一本鎖 Rna (ssRNAs) をバインディング ターゲットの二本鎖 Rna (二本) へ変更された PNAs 性を確認する使用できます。UV 吸光度検出熱溶融実験許可 PNA RNA 二重鎖と PNA· の熱安定性の測定RNA2おしゃれ。ここで合成について述べる、PNA オリゴマーを組み込むの精製残基を変更変更 PNAs によって RNA 二重鎖の認識の生化学的および生物物理学的法を記述します。

逆相高速液体クロマトグラフィーでは、PNA オリゴマーの浄化をことができます。我々 は、高速液体クロマトグラフィー精製 (図 3) の 2 つのラウンドで純粋な PNA オリゴマーを取得できます。MALDI-TOF 分析 (図 4) によって、PNAs の id を確認できます。
非変性のページは結合親和性と PNA オリゴマーの特異性を特徴付けるため簡単で有益な手法です。私たち通常使用複数の RNA のヘアピン構造や二重単一塩基変異を持つバインディング プロパティ (図 5) を特徴付けるため。非変化ページのデータを図 5に示すように明確に示唆している、Q と L-修飾 PNA C G ペア (図 5B底板) で dsRNA 領域を認識できる (図 5B、トップ C G ペアがないものではないが、パネル)。この特定と強化された認識は、T·、A U、L·G-C、および q ·C G PNA·RNA2基本トリプル (図 1A C D) の形成。1 つまたは複数の遺伝子変異を有する様々 な PNAs も変更された PNA の改良された結合特性を発揮する使えます。インキュベーション バッファーに 2 mM Mg2 +を追加するバインドは影響しませんを示した大幅31。
Q と L 変更の PNA にバインド ターゲット dsRNA 地域 (図 6A, 6 C, 6 D) がいない宿主 (図 6B、6 e、6 f) による 2-アミノプリン蛍光滴定法により実証しました。PNA P3 は 0.8 ± 0.1 μ M のKのd値を持つ 2-アミノプリン ラベル dsRNA にバインドします。370 で蛍光強度 2-アミノプリン ラベル宿主の nm、宿主の PNA P3 結合の欠如を示す、P3 濃度が異なると比較的一定している残る。
PNAs の融解転移 (図 7)、宿主へのバインドがないことを示すない熱 Q 残留 (P2、P3) ショーを含みます。これ立体衝突 Q G ペアのようなワトソン Crick に存在ためです。未変更の PNA P1 と比較して、PNAs P4 と P5 を含む変更 L 残基がない Q 残留、ショーは立体衝突 L G ペアのようなワトソン Crick の存在により対応する RNA PNA デュープレックスの溶解温度を減少しました。UV 吸光度検出熱溶融データも Q と L 残基を含む PNA は宿主にかなりバインドできません表示による 2-アミノプリンの蛍光滴定データと一致している (図 6B、6 e、6 階)。Q ベース ワトソン Crick 様 L G ペア (図 1E と比較してワトソン Crick 様 Q G ペア (図 1F) の形成でより重要な立体衝突があり、L ベースよりもより不安定 Q ベースを組み込むことは).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
図 1: 安定した基本トリプルと不安定な塩基対の構造の化学構造。(A ~ D)主要な溝 PNA·T· の RNA2基本組(A) A U, C+·G-C (B) L·G C (C)、および q ·C G (D)。(E, F)L G (E) と (F) - G の Q の PNA RNA 塩基対のような不安定なワトソン Crick。R の文字は、RNA の糖リン酸塩のバックボーンを表します。水素結合は、黒の破線で示されます。図は参照31から再現します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
図 2: PNA 単量体の化学構造。4 PNA モノマー (T、C、L、および Q) が表示されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
図 3: PNA オリゴマーと RP hplc 精製の化学構造。(A) PNA シーケンス P3 の化学構造。(B、C)原油の PNA P3 のクロマトグラフィー データ (B) PNA P3 を再精製 (C)。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
図 4:精製 PNA P3 の MALDI-TOF スペクトル。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
図 5:RNA のヘアピンと PNA シーケンスおよび非変化のページによるバインディングの評価。(A) RNA のヘアピン (rHP1 と rHP2)、PNA P3 と、PNA·PNA P3 と rHP2 間に RNA2三重が形成されました。(B) 非変性ページ (12%) は、rHP1 と PNA P3 への rHP2 結合の結果します。インキュベーション バッファーは 200 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、20 mM HEPES、pH 7.5 です。読み込まれた RNA のヘアピン (rHP1 と rHP2) は、20 μ L で 1 μ M にあります。左から右への車線で PNA 濃度が 0、0.2、0.4、1、1.6、2、4、10、16、20、28、50 μ M. PNA P3 にバインドされません rHP1 と rHP2 (上部パネル) がバインド (底板)。(C) Kd定量 rHP2 P3 バインディングのため。三重鎖形成 (Y) の割合は、PNA の濃度に対してプロットしました。図は参照31から適応です。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
図 6: PNA P3 バインディングの蛍光滴定法の研究2-アミノプリン標識 Rna。による 2-アミノプリンの残渣は、RNA シーケンスに '2' として指定されます。インキュベーション バッファーは 200 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、20 mM HEPES、pH 7.5 です。(A)、PNA·P3 と 2-アミノプリン ラベル dsRNA (dsRNA2 2AP) 間に RNA2三重が形成されました。P3 と 2-アミノプリン ラベル宿主 (ssRNA2 2AP) 間に (B) A 仮想 PNA RNA 二重が形成されました。(C、 E)蛍光発光スペクトル 2-アミノプリン標識 RNA 二重 (1 μ M) と宿主 (1 μ M) のそれぞれと様々 な pH 7.5 で P3 濃度。ピークで約 475 nm は PNA の L ベースの弱い蛍光発光によるもの。(D, F)Kによる 2-アミノプリンの蛍光強度のプロットに基づくd定量 (370 で nm) の RNA 二重と宿主、PNA P3 濃度対それぞれ。図は参照31から適応です。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
図 7: 熱溶融性二本鎖 RNA PNA の結果。インキュベーション バッファーは 200 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、20 mM NaH2PO4、pH 7.5 です。すべてのサンプルには、単一座礁させた RNA (ssRNA1) ・ 130 μ。 (A) 単一座礁させた rna (ssRNA1) PNA、PNAs (P1、P2、P3、P4、P5) PNA P3 と平行方向に ssRNA1 間に形成された仮説的な PNA RNA 二重の 5 μ M が含まれています。Q G と L G ペアのようなワトソン Crick の立体の衝突は示されます。異なる PNAs の曲線に (B) 溶融 ssRNA1 へのバインディングします。溶ける温度が融点が遷移曲線の表示されます。図は参照31から適応です。

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Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

今回は合成のためのプロトコル、ペプチド核酸 (PNA) オリゴマーを組み込むの精製変更残基。PNAs の変更によって RNA 二重鎖の認識の特性の生化学的および生物物理学的方法を説明します。

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