Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00
Duration: 9 min 4 s
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이 작품은 싱가포르 교육 (MOE) 계층 1의 (RGT3/13 및 RG42/15 G.C.)와 모에 계층 2 (MOE2013-t 2-2-024 및 MOE2015-t 2-1-028 G.C.에)에 의해 지원 되었다.

여기에서 보고 된 작업에 따라 (팻/179/14/15/PCT) 특허 출원을 제기 했다.

RNA 이중 바인딩 PNA 올리고 (예를 들어, 10 메)는 중간 크기의 분자 그리고 따라서 표시할 수 있습니다 바인딩 시 전기 이동 기동성 교대 RNAs를 비교 또는 약간 더 큰 크기 (예를 들어, 50-메 르 또는 더 작은). RNA PNA 보다 상당히 큰 경우에, 제한 된 젤 기동성 교대 때문 RNA에 PNA의 적정 작동 하지 않을 수 있습니다. 따라서, 비 변성 시키기 페이지 분석 실험에 대 한 큰 RNA는 잘릴 수 있습니다. Fluorophore 표시 된 PNA에 큰 RNA의 적정 감시를 위한 세 겹 형성 비 변성 시키기 agarose 젤에 의해 젤40중간 로드 샘플 수 있습니다.
RNA의 일정 총 농도와 비 변성 시키기 페이지 적정 실험을 위해 우리는 일반적으로 효율적인 게시물 ethidium 평범한 사람에 의해 무료 RNA와 트리플 밴드의 얼룩에 대 한 1 µ M의 레이블이 RNA 농도 사용 합니다. RNA 농도 0.2 µ M로 낮은 RNA 구조31에 따라 충분 한 있을 수 있습니다. 레이블이 없는 RNA의 농도 (0.2 µ M)를 정확 하 게 측정 될 수 있다 Kd 값은 0.2 µ M에 대 한 또는 더 큰 이어야 합니다 결정 합니다. 다른 얼룩 염료 착 효율을 향상 시키기 위해 사용할 수 있습니다. 또는 게시 되지 않은 데이터 Cy3 염료-표시 된 RNAs 꽉 바인딩 이벤트 측정 하 비 변성 시키기 페이지 실험에 사용할 수 있습니다 것이 좋습니다.
사실은 2-aminopurine은 적당히 형광만, 2-aminopurine 형광 적정도 Kd 값 0.2 µ M31이상 가까이 바인딩의 측정에 제한 됩니다. RNA 또는 PNA 측정 형광 적정을 통해 솔루션에 상대적으로 꽉 바인딩 바인딩 변경 형광 신호53,54, 경우에 상대적으로 밝은 염료와 함께 표시 될 수 있습니다. 55.
DsRNA 바인딩 PNAs에 의해 RNA 구조를 대상으로 전략 RNAs의 제한 된 수에 대 한 테스트 되었습니다. 바인딩 속성 따라 달라질 수 있습니다 다른 시퀀스와 자료 쌍 작곡으로 dsRNAs 높습니다. 하나는 항상 TFPNAs의 디자인에 대 한 이중의 퓨 린 부유한 가닥을 선택할 수 있습니다. 어떻게 연속 Q·를 이해 하는 것이 중요 C G 세 배는 삼박자의 안정성에 영향을 수 있습니다. 더 광범위 한 시퀀스 종속 연구 명확 하 게 TFPNAs의 시퀀스 종속 바인딩 속성을 이해 하는 것 필요 합니다.
TFPNAs의 바인딩 선호도 길이 증가 및/또는 추가는 기초 및 백본56,57 TFPNAs의 수정 더 향상 될 수 있습니다. 그러나, 연속 이중 지역 수 있습니다 자주 구성 하지 중단 없이 10 개 이상의 연속 기본적인 쌍의 비 왓슨 크릭 구조에 의해. 하나 비 왓슨 크릭 구조 dsRNA 지역에 인접 한의 인식에 대 한 작은 분자와 TFPNAs 켤레 있습니다. 원칙적으로, TFPNA-작은 분자 공액 바인딩 친 화력과 특이성 TFPNA 또는 작은 분자 혼자에 비해 향상 예정입니다. 그러나,는 활용58,59,60,61,,6263,64에 대 한 링커의 화학 및 물리적 특성 최적화 해야 합니다.
TFPNAs 바인딩할 수 있는 선택적으로 dsRNAs ssRNAs와 dsDNAs는 사실 매우 유용한 화학 프로브 및 RNA 구조 역학 및 상호작용의 규칙을 통해 잠재적인 치료 ligands로 TFPNAs를 개발 하는 것을 제안합니다 단백질 그리고 대사 산물입니다. TFPNAs의 세포질 통풍 관 작은 분자, 펩 티 드, 등 나노 입자, 세포 관통 moieties로 활용 또는 리5,6 같은 supramolecular 구조 complexation을 통해 촉진 될 수 있습니다. ,12,17,25,31,41,,6566. 더 fluorophores 등 radioisotopes bioimaging 태그와 TFPNAs의 기능화 용이 하 게 하는 검색, 이미징, 및 살아있는 유기 체에서 기능 RNA 구조를 대상으로 수 있습니다.

RNAs는 중요 한 생체 및 규칙에서 RNAs의 역할의 발견과 다양 한 생물 학적 과정1,2,3의 촉매의 최근 발전으로 인해 치료 대상으로 등장 하고있다. 전통적으로, 센스 가닥 왓슨 크릭 이중 형성3,,45,6,7,8, ssRNAs 바인딩할 사용 되었습니다. 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. 최근, 펩 티 드 핵 산 세 겹 형성 (TFPNAs) Hoogsteen 수소 결합 (그림 1)3,,2829통해 dsRNAs 바인딩할 설계 되었습니다. dsRNA는 사전 mRNAs와 mRNAs, 사전 또는 pri miRNAs3, 그리고 많은 다른 비 코딩 RNAs1,,2627를 포함 하 여 전통적인 antisense 대상 RNAs의 대부분에 존재. TFPNAs를 사용 하 여 트리플 헬릭스 형성을 통해 dsRNAs 타겟팅의 구조 특이성 때문에 유리한 수 있습니다 고는 dysregulated 질병, 예를 들면 RNAs의 정상적인 기능을 복원에 사용 하기 위해 큰 잠재력입니다.
최근에 출판 된3,,2829,30,31,32,33, Rozners 그 외 여러분, 그리고 우리에 의해 작동 34,35,36,,3738,39,40,41, 개선에 노력을 보고 향상 된 선호도 dsRNAs 향해 수정된 TFPNAs의 선택적 바인딩. Thio-pseudoisocytosine (L) 단위체30 및 guanidine 수정 5-메 틸 시 토 신 (Q) 단위체31를 포함 하 여 합리적으로 설계 된 PNA 단위체 (그림 2)에 대 한 합성 방법을 개발 했습니다. 다양 한 생 화 확 및 생물 특성 방법을 통해 우리는 상대적으로 짧은 PNAs (6-10 잔류물) L과 Q 잔류물 통합 표시 왓슨 크릭 G-C와 C-G 기본적인 쌍의 향상 된 인식 각각 dsRNAs 설명 했다. PNAs L과 Q 잔류물을 포함 하는 또한, ssRNA 이상과 dsDNA dsRNA 향해 더 선택적 바인딩을 표시 수정 되지 않은 PNAs에 비해. Q 자료에 guanidine 기능42 PNAs를 HeLa 세포31입력을 수 있습니다.
우리의 실험실에서 우리는 PNAs 수동 Boc 화학에 의해 합성 (Boc 또는 t-Boc tert-butyloxycarbony에 대 한 서 ( 그림 2참조) 단단한 단계 펩 티 드 합성 방법4. Boc 그룹은 sterically 덜 PNA 모노 머 연결 하는 동안 도움이 될 수 있습니다 그룹을 보호 하는 fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) 아민에 비해 부피가 큰 그룹을 보호 하는 아민으로 Boc와 PNA 단량체의 합성은 편리 합니다 단단한 지원입니다. Boc 그룹 산 정한 이며 제거할 수 있습니다 쉽게 고체 지원에 dichloromethane (DCM)에 20-50 %trifluoroacetic 산 (TFA) PNA 합성 하는 동안. 자동된 펩타이드 합성기 PNA 올리고; 합성 채택 될 수 있다 그러나, 3 5 배 초과 PNA 단위체의 자동된 펩타이드 합성기 필요 합니다. 수동 합성 훨씬 적은 PNA 단위체를 (2-3-배 초과), 각 커플링 쉽게 카이 저 테스트43에 의해 모니터링이 필요 합니다. 또한, 많은 자동된 합성기 호환 되지 않습니다 부식성 TFA의 사용으로 인해 Boc 전략 합성 Boc 제거 단계.
PNA 올리고 역 상 고성능 액체 착 색 인쇄기 (라인란트-HPLC) MALDI TOF에 의해 분자량 특성 뒤에 의해 순화 될 수 있다 (그림 3 및 4)30, 31. 우리 고용 세 겹 형성 모니터링, 인해는 사실 무료 RNA 이중 구성 및 PNA 바인딩된 triplexes 종종 표시 다른 마이그레이션 속도 (그림 5)30,31 페이지 비 변성 시키기 . 효율적인 포스트 얼룩 RNA 이중 및 PNA· 둘 다를 위해 달성 될 수 있다 필요 없는 라벨 RNA2 트리플 밴드입니다. 비교적 적은 양의 샘플 페이지 실험 비 변성 시키기 위해 필요 하다. 그러나, 로드 (부 화) 버퍼 및 실행 버퍼 (pH 8.3) 않을 수 있습니다 같은, 비교적 높은 pH 8.3의 크게는 삼박자를 불안정 수 있습니다 때문에 접착 안정적인 triplexes 제한 되 고 측정 결과.
2 Aminopurine는 아데닌 (6-aminopurine);의 이성질체 2 aminopurine 형광 강도 (약 370에서 방출 피크 nm) 지역 구조 환경 변화에 민감한 이며 적합 한 바인딩 사이트 (PNA 근처 통합 트리 2 aminopurine 잔류물 형성의 모니터링에 대 한 그림 6) 31. 많은 다른 염료를 보이는 범위에서 형광 방출 쇼와 달리 2 aminopurine 표시 된 RNA 노출 될 수 있습니다 방에 빛 사진 표백 하지 않고. 페이지 실험 pH 8.3의 실행 버퍼 자주 필요 하다, 달리 2-aminopurine 기반으로 형광 적정 바인딩 지정된 pH에 1 개의 해결책에서 사용 하 고 따라서 측정 및 탐지의 상대적으로 약한 수 고 평형에 운동 불안정 바인딩입니다.
자외선 흡 광도 감지 열 용융 실험 허용 duplexes (그림 7)31 와 트라이의 열 안정성 측정플렉스30,32,,4445. 길이 시퀀스 구성에 따라 triplexes의 용 해 되거나 명확한 전환 표시 되지 않을 수 있습니다. 가 열 및 냉각 곡선 겹치면 열역학 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 등온선 적정 열 량 측정 (ITC)32; 여 정확한 열역학 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 그러나, 비교적 많은 양의 샘플은 ITC 일반적으로 필요 합니다.

<table style="border-collapse:collapse;width:491pt" width="654">
	<colgroup>
		<col style="width:176pt" width="235" />
		<col style="width:116pt" width="155" />
		<col span="3" style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl25" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl74" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">87956</td>
			<td style="width:66pt" width="88"></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&#376;HCl)</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl68" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">532444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B25251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acetic anhyride</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Kaiser Test Kit&#160;</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L06374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Unmodified PNA monomers</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">ASM Research Chemicals GmbH</td>
			<td class="xl70" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B8389 / 47624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Thioanisole</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoromethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A10173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">LiChrosper&#174; 100 RP-18 endcapped (5 &#181;m) LiChroCART&#174; 250-4</td>
			<td class="xl41">Merck Millipore</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">150838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">RNA Oligos&#160;</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">Customized&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">39468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td class="xl41">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">J15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">HEPES&#160;</td>
			<td class="xl41">Lonza</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N.N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">146072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td>
			<td class="xl41">1st Base</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">BUF-3010-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Glycerol&#160;</td>
			<td class="xl45">Promega&#160;</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">H5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethidium bromide (10 mg/mL)</td>
			<td class="xl45">Bio-rad&#160;</td>
			<td class="xl64" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl48" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td>
			<td class="xl49">Hellma Analytics&#160;</td>
			<td class="xl61" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">105.250-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

RNAs 중요 한 바이오 마커 및 치료 대상으로 떠오르고 있다. 따라서, 화학 프로브와 RNA 순서 및 구조의 인식에 대 한 치료 ligands 개발 잠재력이 있다. 화학적 펩 티 드 핵 산 (PNA) 올리고 최근 개발 된 시퀀스 별로 RNA duplexes 인식할 수 있는 수정. PNAs 중립 펩 티 드와 같은 등뼈와 화학적으로 안정 되어 있다. PNAs 수 수 합성 비교적 쉽게 수동 Boc 화학 단단한 단계 펩 티 드 합성 방법에 의해. PNAs 역 상 HPLC, 분자량 특성 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 시간의 비행 (TOF MALDI)에 의해 다음에 의해 정화 된다. 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지) 기술을 용이 하 게 세 겹 형성의 영상 때문에 신중 하 게 설계 된 무료 RNA 이중 구성 및 PNA 바인딩된 triplexes 자주 쇼 다른 마이그레이션 속도. Ethidium 평범한 사람 게시물 얼룩과 비 변성 시키기 페이지 종종 바인딩 친 화력 및 특이성 PNA 올리고의 특성화를 위한 쉽고 유익한 기술입니다. 일반적으로, 여러 개의 동 곳 RNA 또는 단 하나 기본적인 쌍 돌연변이와 duplexes 바인딩 친 화력 및 특이성 등의 PNA 바인딩 속성의 특성을 사용할 수 있습니다. 2 Aminopurine는 아데닌 (6-aminopurine);의 이성질체 2 aminopurine 형광 강도 지역 구조 환경 변화에 민감한 이며 PNA 바인딩 사이트 근처 통합 2 aminopurine 잔류물과 세 겹 형성의 모니터링에 적합. 2-Aminopurine 형광 적정 대상된 더블-좌초 RNAs (dsRNAs)으로 수정된 PNAs 바인딩 선택도 단일 가닥 RNAs (ssRNAs)를 통해 확인 하도 사용할 수 있습니다. 자외선 흡 광도 감지 열 용융 실험 허용 PNA RNA duplexes와 PNA·의 열 안정성 측정 RNA2 triplexes입니다. 여기, 우리는 합성을 설명 하 고 PNA 올리고 통합의 정화 잔류물, 수정 하 고 수정된 PNAs에 의해 RNA duplexes의 인식의 특성에 대 한 생화학 및 생물 방법을 설명.

역 상 HPLC PNA 올리고 정화 수 있습니다. 우리는 순수한 PNA 올리고 HPLC 정화 (그림 3)의 2 라운드와 얻을 수 있습니다. MALDI TOF 분석 (그림 4)는 PNAs의 id는 확인할 수 있습니다.
비 변성 시키기 페이지 바인딩 친 화력 및 특이성 PNA 올리고의 특성화를 위한 쉽고 유익한 기술입니다. 우리 일반적으로 사용 하 여 여러 개의 RNA 헤어핀 또는 duplexes 단 하나 기본적인 쌍 돌연변이와 특성 바인딩 속성 (그림 5). 그림 5 에 표시 된 비 변성 시키기 페이지 데이터 명확 하 게 제안는 Q-및 L-수정 PNA dsRNA 지역 C G 쌍 (그림 5B, 하단 패널)을 인식할 수 없습니다 (그림 5B, 상위 C G 쌍 없이 하나 패널)입니다. T·을 통해이 구체적이 고 향상 된 인식이 이다 A-U, L· G-C, 및 Q· C G PNA· RNA2 기본 트리플 (그림 1A, C, D) 형성. 하나 또는 여러 개의 돌연변이와 다양 한 PNAs 수정된 PNA의 향상 된 바인딩 속성을 보여 주기 위해 사용할 수 있습니다. 우리는 2 mM Mg2 + 외피 버퍼에 추가 영향을 주지 않습니다 바인딩을 나타났습니다 크게31.
우리는 Q L 수정 PNA 타겟된 dsRNA 지역 (그림 6A, 6 C 6 D) 하지만 (그림 6B, 6E 6F) ssRNA 하지 2 aminopurine 형광 적정에 의해 증명 하고있다. PNA P3 Kd 값이 0.8 ± 0.1 µ M 2 aminopurine 표시 된 dsRNA에 바인딩합니다. 370에서 형광 강도 2 aminopurine 라는 ssRNA에 대 한 nm는 ssRNA PNA P3의 바인딩의 부족을 나타내는 다양 한 P3 농도로 비교적 일정 하 게 유지.
PNAs 전환 (그림 7)는 ssRNA에 대 한 바인딩을 제안 녹는 아무 열 Q 잔류물 (P2 및 P3) 쇼를 포함 하. 이것은 입체 충돌 왓슨 크릭에서 Q G 쌍 같은 존재입니다. 수정 되지 않은 PNA P1에 비해, PNAs P4 그리고 P5 포함 수정 L 잔류물 하지만 아무 Q 잔류물, 표시 해당 RNA PNA duplexes 입체 충돌 왓슨 크릭에서 L G 쌍 같은 존재 때문에 용융 온도 감소. 자외선 흡 광도 감지 열 녹는 데이터는 2 aminopurine 형광 적정 데이터, 또한 그 질문 및 L 잔류물을 포함 하는 PNA에 바인딩되지 않기 ssRNA appreciably 표시와 일치 (그림 6B, 6E 6F). Q 자료 (그림 1E 왓슨 크릭 같은 L G 쌍에 비해 왓슨 크릭 같은 Q G 쌍 (그림 1F)의 형성에 더 중요 한 입체 충돌 있다 L 자료 보다 더 불안정은 Q 자료 통합 ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
그림 1 : 안정적인 기본 트리플 하 고 불안정 한 기초 쌍 구조의 화학 구조. (A-D) 주요 홈 PNA· T·의 세 배 RNA2 기본 (A) A U, C+· G-C (B), L· G-C (C), 및 Q· C-G (D)입니다. (E, F) L-G (E)와 Q-G (F)의 PNA RNA 기본적인 쌍 같은 불안정 한 왓슨 크릭. 편지 R RNA의 설탕 인산 염 등뼈를 나타냅니다. 수소 결합은 검은색 파선으로 표시 됩니다. 그림 참조31에서 재현 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
그림 2 : PNA 단위체의 화학 구조. 4 PNA 단위체 (T, C, L, 및 Q) 표시 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
그림 3 : PNA 올리고 머와 RP HPLC에 의해 정화의 화학 구조. (A) PNA 시퀀스 P3의 화학 구조. (B, C) 원유 PNA P3의 RP HPLC 데이터 (B) 다시 정화 PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
그림 4 : 정화 PNA P3의 MALDI TOF 스펙트럼. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
그림 5 : RNA 머리 핀 및 PNA 시퀀스와 비 변성 시키기 페이지 바인딩 특성. (A) RNA 헤어핀 (rHP1 및 rHP2), PNA P3, 그리고는 PNA· RNA2 세 겹 PNA P3 및 rHP2 사이 형성. (B) 비 변성 시키기 페이지 (12%) rHP1 및 rHP2 바인딩 PNA P3에 대 한 결과. 인큐베이션 버퍼가 200 m m NaCl, 0.5 m m EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5입니다. 로드 된 RNA 헤어핀 (rHP1 및 rHP2) 20 µ L에 1 µ M에 있다. 오른쪽에서 왼쪽 차선에서 PNA 농도 0, 0.2, 0.4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, 50 µ M. PNA P3 않습니다 하지 바인딩합니다 rHP1 하 고 (위 패널) 하지만 rHP2에 바인딩합니다 (하단 패널). P3 rHP2 바인딩을 위해 (C) Kd 결정. 세 겹 형성 (Y)의 분수는 PNA 농도 대 한 플롯은. 그림은 참조31에서 적응. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
그림 6 : PNA P3 바인딩의 형광 적정 연구2 aminopurine 표시 된 RNAs 하. 2 aminopurine 잔류물 RNA 순서에서 '2'로 지정 됩니다. 인큐베이션 버퍼가 200 m m NaCl, 0.5 m m EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5입니다. (A)는 PNA· RNA2 세 겹 P3 및 2 aminopurine 표시 된 dsRNA (dsRNA2-2AP) 사이 형성. (B) 가상 PNA RNA 이중 P3 및 2 aminopurine 레이블 ssRNA (ssRNA2-2AP) 사이 형성. (C, E) 형광 방출 스펙트럼 2 aminopurine 표시 된 RNA 이중 (1 µ M) 및 ssRNA (1 µ M), 각각,와 P3 농도 pH 7.5에 다양합니다. 약 475에 피크 nm PNA에 L 자료의 약한 형광 방출 예정 이다. (D, F) K d 결정 2 aminopurine 형광 강도 플롯에 따라 (370에서 nm)의 RNA 이중 및 ssRNA, 각각, PNA P3 농도 대. 그림은 참조31에서 적응. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
그림 7 : RNA PNA duplexes에 대 한 결과 용 해 열. 인큐베이션 버퍼 200 m m NaCl, 0.5 m m EDTA, 20 m NaH2포4, pH 7.5 m 이다. 모든 샘플의 단일 가닥 RNA (ssRNA1)와 PNA 130 µ L. (A) 단일 가닥 RNA (ssRNA1)에, PNAs (P1, P2, P3, P4, 및 P5)와 PNA P3 및 평행 방향에 ssRNA1 사이 형성 하는 가상 PNA RNA 이중 5 µ M를 포함. Q-G와 L G 쌍 같은 왓슨 크릭 입체 충돌을 가리킨다. (B) 융해 곡선 다른 PNAs에 대 한 ssRNA1에 바인딩. 녹는 온도 녹는 전환으로 곡선에 대 한 표시 됩니다. 그림은 참조31에서 적응.

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