Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Singapore departementet for utdanning (MOE) Tier 1 (RGT3/13 og RG42/15 til G.H.) og MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 og MOE2015-T2-1-028 til G.H.).

En patentsøknad (PAT/179/14/15/PCT) basert på arbeidet rapporterte her er inngitt.

RNA dupleks-bindende PNA oligomers (f.eks, 10-mers) er mellomstore molekyler og dermed kan vise electrophoretic mobilitet Skift ved binding til RNAs med en tilsvarende eller litt større størrelse (f.eks, 50-mer eller mindre). Hvis en RNA er betydelig større enn PNA, fungerer ikke titrering av PNA i RNA på grunn av en begrenset gel mobilitet SKIFT. Dermed kan den store RNA bli avkortet for ikke-denaturing side analyser. Titrering av en stor i en fluorophore-merket PNA lar for overvåking av triplex dannelsen av en ikke-denaturing agarose gel med prøven lastet i gel40.
For en titrering eksperiment av ikke-denaturing siden med en konstant totale konsentrasjonen av RNA bruker vi vanligvis en umerket RNA konsentrasjon på 1 µM til effektiv innlegget farging av gratis RNA og triplex band av ethidium bromide. En RNA konsentrasjon så lavt som 0,2 µM kan også være tilstrekkelig avhengig RNA konstruere31. Konsentrasjonen av den umerkede RNA (0,2 µM) bestemmer at Kd verdiene som kan måles nøyaktig skal om lag 0,2 µM eller større. Andre flekker fargestoffer kan brukes til å forbedre flekker effektiviteten. Alternativt tyder våre upubliserte data på at Cy3 dye-merket RNAs kan brukes i ikke-denaturing siden eksperimenter for å måle stramt bindende hendelsene.
På grunn av at 2-aminopurine er bare moderat fluorescerende, er 2-aminopurine fluorescens titrering også begrenset til måling av bindingen med Kd verdier nær eller over 0,2 µM31. RNA eller PNA kan merkes med en relativt lys fargestoff for kvantifisering av en relativt stramt bindende i løsning gjennom fluorescens titrering, hvis bindingen resulterer i endringer i fluorescens signaler53,54, 55.
Strategien for målretting RNA strukturer av dsRNA-binding PNAs er testet for et begrenset antall RNAs. Det er sannsynlig at bindende egenskaper kan variere for dsRNAs med forskjellige sekvenser og base par komposisjoner. Man kan alltid velge den purine-rik stranden av en tosidig for design av TFPNAs. Det er viktig å forstå hvordan påfølgende Q· C-G tremannsrom kan påvirke stabiliteten av et tripleks. Mer omfattende sekvens-avhengige studier er et klart behov å forstå egenskapene sekvens-avhengige bindende TFPNAs.
Den forpliktende tilhørighet av TFPNAs kan styrkes ytterligere ved å øke lengden og ytterligere modifisering av baser og stamnett56,57 av TFPNAs. Men kan en kontinuerlig dobbeltsidig region ikke ofte består av mer enn 10 sammenhengende base parene uten avbrudd av ikke-Watson-Crick strukturer. En kan bøye TFPNAs med små molekyler for anerkjennelse av ikke-Watson-Crick strukturer tilstøtende til dsRNA områder. I prinsippet forventes en TFPNA-små molekyl konjugert å har forbedret forpliktende tilhørighet og spesifisitet sammenlignet en TFPNA eller små molekyl alene. Men de kjemiske og fysiske egenskapene av linker for den Bøyning58,59,60,61,62,63,64 må være optimalisert.
Det faktum at TFPNAs kan selektivt binde til dsRNAs ssRNAs og dsDNAs antyder at det er mulig å utvikle TFPNAs som svært nyttig kjemiske sonder og potensielle terapeutiske ligander gjennom regulering av RNA strukturelle dynamikk og interaksjon med proteiner og metabolitter. Mobilnettet opptak av TFPNAs kan bli lettere gjennom Bøyning med celle-gjennomtrengende moieties som små molekyler, peptider og nanopartikler eller complexation med supramolecular strukturer som liposomer5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Ytterligere kan functionalization av TFPNAs med bioimaging koder som fluorophores og radioisotopes forenkle deteksjon, imaging og målretting av funksjonelle RNA strukturer i levende organismer.

RNAs dukker opp som viktige biomarkers og terapeutiske mål, på grunn av den siste utviklingen i funn av de RNAs roller i regulering og katalyse ulike biologiske prosesser1,2,3. Tradisjonelt har antisense tråder blitt brukt til å binde til ssRNAs til Watson-Crick dobbeltsidig formasjon3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. nylig tripleks-forming peptid nucleic syrer (TFPNAs) er utformet for å binde til dsRNAs via Hoogsteen hydrogen bånd (figur 1)3,28,29. dsRNA områder finnes i fleste tradisjonelle antisense-målrettet RNAs, inkludert pre-mRNAs, mRNAs, pre eller pri-miRNAs3og mange andre ikke-koding RNAs1,26,27. Målretting dsRNAs gjennom trippel helix dannelsen ved hjelp av TFPNAs kan være en fordel på grunn av sin struktur spesifisitet og er stort potensial for bruk i å gjenopprette normal funksjonene av RNAs, som er dysregulated i sykdommer, for eksempel.
Den nylig publiserte arbeider av Rozners et al., og oss3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, rapporterte innsatsen på å forbedre selektiv binding av modifisert TFPNAs mot dsRNAs med forbedret affinitet. Vi har utviklet syntese metoder for rasjonelt designet PNA monomerer (figur 2), inkludert deg selv thio-pseudoisocytosine (L) monomer30 og guanidine endret 5-methyl cytosine (Q) monomer31. Gjennom ulike biokjemiske og Biofysiske karakterisering metoder, har vi vist at relativt kort PNAs (6-10 rester) omfatter L og Q rester vise økt anerkjennelse av Watson-Crick G-C og C-G base parene, henholdsvis i dsRNAs. Videre viser sammenlignet med uforandret PNAs, PNAs inneholder L og Q rester mer selektiv binding mot dsRNA ssRNA og dsDNA. Guanidine funksjonalitet42 i Q-base gir PNAs inn HeLa celler31.
I vårt laboratorium, vi syntetisere PNAs ved manuell Boc-kjemi (Boc eller t- Boc står for tert-butyloxycarbony (se figur 2) solid-fase peptid syntese metode4. Syntese av PNA monomer med Boc som Amin beskytte gruppen er praktisk som gruppen Boc er sterically mindre klumpete i forhold til fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Amin beskytte group, som kan være fordelaktig under PNA monomer kobling den solid støtte. Gruppen Boc er syre-labilt og kan lett fjernes med solid støtte av 20-50% trifluoroacetic syre (TFA) i diklormetan (DCM) under PNA syntese. En automatisert peptid synthesizer kan benyttes til å syntetisere PNA oligomers; 3-5-fold overskudd av PNA monomer er imidlertid nødvendig for en automatisert peptid synthesizer. Manuell syntesen krever betydelig mindre PNA monomer (2-3-fold overkant), med hver kobling lett overvåkes ved Kaiser test43. Videre er mange automatisert synthesizer ikke kompatible med Boc strategi syntese skyldes bruk av etsende TFA i Boc fjerning trinn.
PNA-oligomers kan renses omvendt-fase høyytelses flytende kromatografi (RP-HPLC) etterfulgt av molekylvekt karakterisering av MALDI-TOF (tall 3 og 4)30, 31. vi bruker ikke-denaturing side å overvåke triplex formasjon, skyldes det faktum at gratis RNA dupleks konstruerer og PNA bundet etasjer ofte vise forskjellige overføring priser (figur 5)30,31 . Ingen merking er nødvendig hvis effektiv etter farging kan oppnås både RNA dupleks og PNA· RNA2 triplex band. En relativt liten mengde utvalg er nødvendig for ikke-denaturing siden eksperimenter. Men lasting (inkubasjon) bufferne og kjører bufferne (pH 8.3) kan ikke være det samme, som resulterer i målingene blir begrenset til kinetically stabil etasjer, fordi en relativt høy pH av 8.3 kan betydelig destabilisere et tripleks.
2-Aminopurine er en isomer av adenine (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescens intensiteten (med et utslipp peak på rundt 370 nm) er følsom for lokale strukturelle endringer, og er egnet for overvåking av triplex formasjon med 2-aminopurine rester innlemmet i nærheten PNA bindende område ( Figur 6) 31. i motsetning til mange andre fargestoffer som viser fluorescens utslipp i det synlige området, 2-aminopurine-merket RNA kan bli utsatt for vanlig lys uten bilde bleking. I motsetning til siden eksperiment der en kjører buffer av pH 8.3 er ofte nødvendig, 2-aminopurine basert fluorescens titrering kan måling av binding i en løsning på en angitt pH, og dermed kan tillate måling og påvisning av relativt svake og Kinetically ustabil bindende på likevekt.
UV-absorbansen-oppdaget termisk smeltende eksperimenter tillate måling av termisk stabilitet duplexes (figur 7)31 og tripleksisett30,32,44,45. Avhengig av lengden og rekkefølgen sammensetningen, smelting av etasjer kan eller kan ikke vise en klar overgang. Termodynamisk parametere kan oppnås hvis oppvarming og kjøling kurvene overlapper. Nøyaktig termodynamisk parametere kan fås ved isotermiske titrering calorimetry (ITC)32; men er relativt store mengder prøver vanligvis nødvendig for ITC.

<table style="border-collapse:collapse;width:491pt" width="654">
	<colgroup>
		<col style="width:176pt" width="235" />
		<col style="width:116pt" width="155" />
		<col span="3" style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl25" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl74" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">87956</td>
			<td style="width:66pt" width="88"></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&#376;HCl)</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl68" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">532444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B25251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acetic anhyride</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Kaiser Test Kit&#160;</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L06374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Unmodified PNA monomers</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">ASM Research Chemicals GmbH</td>
			<td class="xl70" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B8389 / 47624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Thioanisole</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoromethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A10173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">LiChrosper&#174; 100 RP-18 endcapped (5 &#181;m) LiChroCART&#174; 250-4</td>
			<td class="xl41">Merck Millipore</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">150838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">RNA Oligos&#160;</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">Customized&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">39468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td class="xl41">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">J15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">HEPES&#160;</td>
			<td class="xl41">Lonza</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N.N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">146072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td>
			<td class="xl41">1st Base</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">BUF-3010-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Glycerol&#160;</td>
			<td class="xl45">Promega&#160;</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">H5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethidium bromide (10 mg/mL)</td>
			<td class="xl45">Bio-rad&#160;</td>
			<td class="xl64" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl48" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td>
			<td class="xl49">Hellma Analytics&#160;</td>
			<td class="xl61" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">105.250-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

RNAs dukker opp som viktige biomarkers og terapeutiske mål. Dermed er det stort potensial i å utvikle kjemiske sonder og terapeutiske ligander for anerkjennelse av RNA sekvens og struktur. Kjemisk endret peptid Nucleic Acid (PNA) oligomers er nylig utviklet som kan gjenkjenne RNA duplexes på sekvens-spesifikk måte. PNAs er kjemisk stabil med en nøytral peptid som ryggrad. PNAs kan syntetiseres relativt lett av manuell Boc-kjemi solid-fase peptid syntese metoden. PNAs blir renset ved omvendt-fase HPLC, etterfulgt av molekylvekt karakterisering av matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering-tiden for flygningen (MALDI-TOF). Non-denaturing polyakrylamid gel geleelektroforese (side) teknikk forenkler avbilding av triplex dannelsen, fordi nøye utformet gratis RNA dobbeltsidig konstruerer og PNA bundet etasjer ofte viser forskjellige overføring priser. Non-denaturing side med ethidium bromide innlegget flekker er ofte en lett og informativ teknikk for å karakterisere bindende slektskap og særegenheter av PNA oligomers. Vanligvis kan flere RNA hårnåler eller duplexes enkelt base par mutasjoner brukes til å beskrive PNA bindende egenskaper, for eksempel bindende slektskap og særegenheter. 2-Aminopurine er en isomer av adenine (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescens intensiteten er følsom for lokale strukturelle endringer, og er egnet for overvåking av triplex dannelse med 2-aminopurine rester innlemmet i nærheten av PNA binding området. 2-Aminopurine fluorescens titrering kan også brukes til å bekrefte binding selektivitet av endrede PNAs mot målrettet double-strandet RNAs (dsRNAs) over single-strandet RNAs (ssRNAs). UV-absorbansen-oppdaget termisk smeltende eksperimenter tillate måling av termisk stabilitet av PNA-RNA duplexes og PNA· RNA2 etasjer. Her beskriver vi syntese og rensing av PNA oligomers omfatter endret rester og beskrive biokjemiske og Biofysiske metoder for kategorisering av anerkjennelse av RNA duplexes av de endrede PNAs.

Omvendt-fase HPLC gjør rensing av PNA oligomers. Vi kan få ren PNA oligomers med to runder av HPLC rensing (Figur 3). Identiteten til PNAs kan bli bekreftet av MALDI-TOF analyse (Figur 4).
Non-denaturing side er en enkel og informativ teknikk for å karakterisere bindende slektskap og særegenheter av PNA oligomers. Vi bruker vanligvis flere RNA hårnåler eller duplexes enkelt base par mutasjoner som karakteriserer bindingsegenskapene (figur 5). Ikke-denaturing siden dataene vist i figur 5 foreslå klart at den Q - og L-endret PNA kan gjenkjenne et dsRNA område med en C-G (figur 5B, nedre panelet) men ikke en uten noen C-G (figur 5B, øverst til panel). Dette bestemte og forbedret anerkjennelse er gjennom T· A-U, L· G-C og Q· C-G PNA· RNA2 base triple (figur 1A, C, D) formasjon. Ulike PNAs ett eller flere mutasjoner kan også brukes til å vise forbedrede Bindingsegenskapene for en modifisert PNA. Vi har vist at å legge 2 mM Mg2 + i inkubasjon bufferen ikke påvirker bindingen betydelig31.
Vi har vist av 2-aminopurine fluorescens titrering som en Q - og L-endret PNA binder til en målrettet dsRNA regionen (figur 6A, 6 C, 6 D), men ikke ssRNA (figur 6B, 6E, 6F). PNA P3 binder til 2-aminopurine-merket dsRNA med Kd verdien 0,8 ± 0,1 µM. Fluorescens intensiteten på 370 nm for 2-aminopurine-merket ssRNA forblir relativt konstant med variert P3 konsentrasjon, som indikerer manglende binding av PNA P3 å ssRNA.
PNAs som inneholder Q rester (P2 og P3) viser ingen termisk smelter overganger (figur 7), foreslår ingen binding til ssRNA. Dette skyldes steric clash stede i Watson-Crick som Q-G par. Sammenlignet med uforandret PNA P1, PNAs P4 og P5 inneholder endret L rester men ingen Q rester, viser redusert smeltingen temperaturer for de tilsvarende RNA-PNA duplexes på grunn av steric clash stede i Watson-Crick som L-G par. UV-absorbansen-oppdaget termisk smeltende dataene er i samsvar med 2-aminopurine fluorescens titrering dataene, som viser at en PNA som inneholder Q og L rester ikke kan bindes til ssRNA merkbart (figur 6B, 6E, 6F). Omfatter en Q base er mer destabiliserende enn en L base, som Q base har en mer betydelig steric sammenstøt i dannelsen av en Watson-Crick som Q-G par (figur 1F) sammenlignet med en Watson-Crick som L-G par (figur 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Figur 1 : Kjemiske strukturer av stabil base tremannsrom og ustabil base par strukturer. (A-D) Major-groove PNA· RNA2 base tremannsrom av T· A-U (en), C+· G-C (B), L· G-C (C) og Q· C-G (D). (E, F) Ustabil Watson-Crick som PNA-RNA base parene av L-G (E) og Q-G (F). Bokstavene representerer sukker-fosfat ryggraden i RNA. Hydrogenbindinger angis av svart stiplede linjer. Figuren er gjengitt fra referanse31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Figur 2 : Kjemiske strukturer av PNA monomerer. Fire PNA monomerer (T, C, L og Q) vises. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Figur 3 : Kjemisk struktur av PNA oligomer og rensing av RP-HPLC. (A) kjemisk struktur av PNA sekvensen P3. (B, C) RP-HPLC data av råolje PNA P3 (B) og nytt renset PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Figur 4 : MALDI-TOF spekteret av renset PNA P3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Figur 5 : RNA hårnål og PNA sekvenser og bindende karakterisering av ikke-denaturing side. (A) RNA hårnåler (rHP1 og rHP2), PNA P3 og en PNA· RNA2 triplex dannet mellom PNA P3 og rHP2. (B) ikke-denaturing siden (12%) resultater for rHP1 og rHP2 binding til PNA P3. Inkubasjon bufferen er 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. De lastet RNA hårnåler (rHP1 og rHP2) er på 1 µM i 20 µL. De PNA konsentrasjonene i baner fra venstre til høyre er 0, 0,2, 0,4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28 og 50 µM. PNA P3 ikke kan bindes til rHP1 (toppanelet) men binder seg til rHP2 (nedre panelet). (C) Kd besluttsomhet for P3 binding til rHP2. Brøkdel av triplex dannelse (Y) var plottet mot PNA konsentrasjonen. Figuren er tilpasset fra referanse31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Figur 6 : Fluorescens titrering studie av PNA P3 bindendetil 2-aminopurine-merket RNAs. 2-aminopurine rester er utpekt som '2' i RNA sekvensen. Inkubasjon bufferen er 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. (A) en PNA· RNA2 triplex dannet mellom P3 og en 2-aminopurine-merket dsRNA (dsRNA2-2AP). (B) en hypotetisk PNA-RNA dupleks dannet mellom P3 og en 2-aminopurine-merket ssRNA (ssRNA2-2AP). (C, E) Fluorescens utslipp spectra for 2-aminopurine-merket RNA dobbeltsidig (1 µM) og ssRNA (1 µM), henholdsvis variert med P3 konsentrasjon ved pH 7.5. En topp på rundt 475 nm er svak fluorescens utslipp av L base i PNA. (D, F) K d fastsettelse basert på plott av 2-aminopurine fluorescens intensitet (på 370 nm) av RNA dupleks og ssRNA, henholdsvis versus PNA P3 konsentrasjon. Figuren er tilpasset fra referanse31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Figur 7 : Thermal smelter resultater for RNA-PNA duplexes. Inkubasjon bufferen er 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7.5. Alle prøver inneholder 5 µM single-strandet RNA (ssRNA1) og PNA i 130 µL. (A) Single-strandet RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 og P5) og en hypotetisk PNA-RNA tosidig dannet mellom PNA P3 og ssRNA1 i en parallell retning. Steric clash er indisert for Watson-ballen som Q-G og L-G par. (B) smelter kurver for ulike PNAs binding til ssRNA1. De smeltingen temperaturene vises for kurver med smeltende overganger. Figuren er tilpasset fra referanse31.

Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sekvens-spesifikke og selektiv anerkjennelse av Double-strandet RNAs over Single-strandet RNAs av kjemisk endret peptid nukleinsyrer

Vi rapporterer protokollene for syntese og rensing av peptid Nucleic Acid (PNA) oligomers omfatter endret rester. Biokjemiske og Biofysiske metodene for karakterisering av anerkjennelse av RNA duplexes av de endrede PNAs er beskrevet.

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Levering av nukleinsyrer gjennom Embryo Mikroinjeksjon i Worldwide Agricultural Pest Insect,<em&gt; Appelsinflue</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugerbare Mating Analyser for sekvens-spesifikk analyse av Transfer proteiner involvert i Konjugasjon

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Oppdrett og Double-stranded RNA-mediert Gene knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Atomic Force Microscopy Undersøkelser av DNA Lesion Recognition i Nucleotide Excision Repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metabolsk merking og profilering av overføring RNAs bruker Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Cellen basert analyser av SINEUP ikke-koding RNAs som spesielt kan forbedre mRNA oversettelse

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Bestemme 3-Termini og sekvenser av begynnende Single-strandet virus-DNA molekyler i HIV-1 reversere transkripsjon i infiserte celler

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overexpressing lang Noncoding RNAs med aktivering av Gene CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

I vitro biokjemiske analyser ved hjelp av biotin etiketter for å studere protein-nukleinsyre acid interaksjoner

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Høy tetthet DNA og RNA Microarrays-Photolithographic syntese, hybridisering og utarbeidelse av store nukleinsyre acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...