Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Эта работа была поддержана Сингапур Министерство образования (МО) уровня 1 (RGT3/13 и RG42/15 G.C.) и МО Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 и MOE2015-T2-1-028 G.C.).

Подал заявку на патент (ПЭТ/179/14/15/PCT) на основе результатов работы, сообщили здесь.

РНК дуплекс привязки ПНА олигомеров (например, 10-РВК) средних молекул и таким образом могут показать электрофоретической подвижности сдвига после привязки к RNAs с сопоставимой или чуть больше размера (например, 50-mer или меньше). Если РНК значительно больше, чем ПНА, титрование ПНА в РНК могут не работать из-за ограниченной гель перенос удобоподвижности. Таким образом большой РНК могут быть усечены для анализов денатурации страницы. Титрование большой РНК в Флюорофор меченых ПНА позволяет для наблюдения за триплекс формирования по-Денатурирующий гель агарозы с образцом загружен в середине гель40.
Для титрования эксперимент-денатурации страницы с постоянной общей концентрации РНК мы обычно используют немеченого концентрации РНК 1 мкм для эффективного пост пятнать бесплатно РНК и триплекс полос, бромид ethidium. Как низко как 0,2 мкм концентрации РНК также может быть достаточно в зависимости от конструкции РНК31. Концентрация немеченого РНК (0,2 мкм) определяет, что значенияd K, которые можно точно измерить должно быть о 0,2 мкм или больше. Другие красители для окрашивания может использоваться для повышения эффективности окрашивание. Кроме того наши неопубликованные данные показывают, что Cy3 краситель меченых молекул РНК может использоваться в экспериментах не денатурации страницы для измерения жесткой привязки событий.
С тем, что только 2-aminopurine умеренно флуоресцентные, 2-aminopurine флуоресценции титрования ограничивается также измерения привязки со значениямиd Kрядом или выше 0,2 мкм31. РНК или ПНА могут быть помечены с относительно яркие краски для количественной оценки, относительно жесткая привязка в растворе через флуоресценции титрования, если привязки приводит к изменениям в флуоресценции сигналы53,54, 55.
Стратегия целевых структур РНК, РНК привязки PNAs была протестирована на ограниченное количество молекул РНК. Вполне вероятно, что свойства привязки могут отличаться для двуцепочечных РНК с различных последовательностей и базы пару композиций. Всегда можно выбрать стренги богатые пуринами дуплекс для проектирования TFPNAs. Важно, чтобы понять как подряд Q· C-G троек могут повлиять на стабильность триплекс. Более обширные исследования зависит от последовательности явно необходимы для понимания последовательности зависимые привязки свойства TFPNAs.
Сродство TFPNAs можно повысить путем увеличения длины и/или дальнейшего изменения баз и магистралей56,57 TFPNAs. Однако непрерывной дуплекс региона могут не часто состоят из более чем 10 последовательных пар нуклеотидов без нарушения структуры не Уотсона-крика. Один может конъюгат TFPNAs с малых молекул для признания не Уотсона-крика структур прилегающих регионов двуцепочечной ДНК. В принципе конъюгат TFPNA-малые молекулы, как ожидается, повысили сродство и специфичности, по сравнению с TFPNA или только малые молекулы. Однако химические и физические свойства компоновщика для сопряжения58,59,60,61,,6263,64 должны быть оптимизированы.
Тот факт, что TFPNAs выборочно можно связать двуцепочечных РНК над ssRNAs и dsDNAs предполагает, что это позволяет развивать TFPNAs как очень полезные химические датчики и потенциальных терапевтических лиганды путем регулирования РНК структурной динамики и взаимодействия с белков и метаболитов. Клеточного поглощения TFPNAs может быть облегчено путем конъюгации с клеток проникая постановление как малые молекулы, пептиды и наночастиц, или комплексообразованию с супрамолекулярных структур, таких как липосомы5,6 ,12,17,25,,3141,,6566. Функционализация TFPNAs bioimaging Теги флуорофоров и радиоизотопов может способствовать обнаружения, обработки изображений и ориентации функциональных структур РНК в живых организмах.

РНК превращаются в важных биомаркеров и терапевтических целей, из-за последние достижения в открытий RNAs роли в регулировании и катализа различных биологических процессов1,2,3. Традиционно антисмысловых пряди были использованы для привязки к ssRNAs через Уотсона-крика дуплекс формирования3,4,5,6,,78, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. Недавно, триплекс формирование пептид нуклеиновые кислоты (TFPNAs) были разработаны для привязки к двуцепочечных РНК через Хугстиновские водородных связей (рис. 1)3,,2829. dsRNA регионах присутствуют в большинстве традиционных целевых antisense РНК, включая пре мРНК и мРНК, предварительно или pri адаптивной3и многих других-кодирования RNAs1,26,27. Ориентация двуцепочечных РНК путем формирования «Тройная спираль», с помощью TFPNAs может быть выгодно из-за своей специфики структуры и имеет большой потенциал для использования в восстановлении нормальной функции РНК, которые являются dysregulated заболеваний, например.
Недавно опубликованные работы, Rozners et al.и нас3,28,,2930,,3132,33, 34,35,,3637,,3839,40,41, сообщил усилия по улучшению селективный связывание модифицированных TFPNAs к двуцепочечных РНК с расширенной сходства. Мы разработали методы синтеза для рационально разработан ПНА мономеров (рис. 2) включая Тио pseudoisocytosine (L) на мономера30 и гуанидина модифицированные 5-метил цитозином (Q) мономера31. Через различные биохимические и биофизические характеристики методов мы продемонстрировали относительно короткий PNAs (6-10 остатков) включение L и Q остатков показывают улучшение распознавания Уотсона-крика G-C и C-G пар нуклеотидов, соответственно, в двуцепочечных РНК. Кроме того по сравнению с неизмененной PNAs, PNAs, содержащие остатки L и Q показывают более привязки к двуцепочечной ДНК ssRNA и dsDNA. Функциональность гуанидина42 в базе Q позволяет PNAs ввести НеЬа клетки31.
В нашей лаборатории, мы синтезировать PNAs, ручной БПЦ химия (БПЦ или t- Boc расшифровывается трет butyloxycarbony (см. рис. 2) пептида Твердофазный синтез метод4. Синтез ПНА мономера с Boc как Амин, защищая группы удобен как группа Boc труднодоступных менее громоздким, по сравнению с Амин fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), защиты группы, которые могут быть полезными во время ПНА мономера, муфты твердой поддержки. Группа Boc лабильным кислоты и может быть легко удалена на твердой поддержки на 20-50% trifluoroacetic кислоты (ТФК) в Дихлорметан (DCM) во время синтеза ПНА. Автоматизированный пептид синтезатор может быть использован для синтезировать ПНА олигомеров; Однако избыток 3-5 раза ПНА мономера необходим для автоматизированной пептид синтезатор. Ручной синтеза требует значительно меньше ПНА мономера (2-3 раза избыток), с каждым муфтой, легко контролируется Кайзер тест43. Кроме того многие автоматизированных синтезаторы не совместимы с Boc стратегия синтеза из-за использования агрессивных TFA на этапе удаления БПЦ.
ПНА олигомеров могут быть очищены, реверс фазы высокой производительности жидкостной хроматографии (RP-ВЭЖХ) следуют характеристика молекулярный вес, MALDI-TOF (рисунки 3 и 4)30, 31. Мы используем-денатурации страницы для мониторинга триплекс формирования, с тем, что создает бесплатные РНК дуплекс и ПНА связаны Трёхквартирные часто показывают различные миграции цены (рис. 5)30,31 . Без маркировки требуется если эффективным после окрашивания может быть достигнуто для обоих РНК дуплекс и PNA· РНК2 триплекс полос. Относительно небольшое количество образца необходим для экспериментов денатурации страницы. Однако, Загрузка (инкубации) буферов и работает буферов (рН 8.3) не могут то же самое, в результате измерений, ограничиваясь кинетически стабильной Трёхквартирные, потому что относительно высоких рН 8.3 значительно может дестабилизировать триплекс.
2-Aminopurine является изомером аденин (6-aminopurine); интенсивность флуоресценции 2-aminopurine (с выбросов пика примерно 370 Нм) чувствителен к местной окружающей среде структурных изменений и подходит для мониторинга формирования триплекс с 2-aminopurine остатков включены возле привязки сайта (ПНА Рисунок 6) 31. в отличие от многих других красителей, которые показывают выбросов флюоресценции в видимом диапазоне, 2-aminopurine меченых РНК могут подвергаться номер света без фото отбеливания. В отличие от страницы эксперимент, в котором работает буфер рН 8.3 часто необходима, 2-aminopurine на базе флуоресценции титрования позволяет измерение привязки в одном решении на указанный уровень pH и таким образом может разрешить измерение и определение относительно слабым и кинетически нестабильной привязки в равновесии.
УФ поглощения обнаружены тепловой плавления эксперименты позволяют измерения тепловой стабильности дуплексы (рис. 7)31 и triнаборов30,,3244,45. В зависимости от длины и последовательности композиции таяние Трёхквартирные могут или не могут показать четкие перехода. Термодинамические параметры могут быть получены, если кривые нагрева и охлаждения перекрываются. Точная термодинамических параметров могут быть получены путем изотермического титрования калориметрии (ЦМТ)32; Однако относительно большое количество образцов обычно требуется для ЦМТ.

<table style="border-collapse:collapse;width:491pt" width="654">
	<colgroup>
		<col style="width:176pt" width="235" />
		<col style="width:116pt" width="155" />
		<col span="3" style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl25" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl74" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">87956</td>
			<td style="width:66pt" width="88"></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&#376;HCl)</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl68" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">532444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B25251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acetic anhyride</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Kaiser Test Kit&#160;</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L06374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Unmodified PNA monomers</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">ASM Research Chemicals GmbH</td>
			<td class="xl70" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B8389 / 47624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Thioanisole</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoromethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A10173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">LiChrosper&#174; 100 RP-18 endcapped (5 &#181;m) LiChroCART&#174; 250-4</td>
			<td class="xl41">Merck Millipore</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">150838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">RNA Oligos&#160;</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">Customized&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">39468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td class="xl41">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">J15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">HEPES&#160;</td>
			<td class="xl41">Lonza</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N.N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">146072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td>
			<td class="xl41">1st Base</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">BUF-3010-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Glycerol&#160;</td>
			<td class="xl45">Promega&#160;</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">H5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethidium bromide (10 mg/mL)</td>
			<td class="xl45">Bio-rad&#160;</td>
			<td class="xl64" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl48" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td>
			<td class="xl49">Hellma Analytics&#160;</td>
			<td class="xl61" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">105.250-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

РНК превращаются в важных биомаркеров и терапевтических целей. Таким образом существует большой потенциал в развитии химические датчики и терапевтические лигандов для признания РНК последовательности и структуры. Химически изменены пептид нуклеиновой кислоты (PNA) были недавно разработали олигомеров, могут распознавать дуплексы РНК в последовательность конкретным образом. PNAs химически стабильны с нейтральным позвоночника пептид как. PNAs может быть синтезирован сравнительно легко методом ручной БПЦ химия твердофазный пептидного синтеза. PNAs очищаются, реверс фаза ВЭЖХ, следуют молекулярный вес характеристика матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации-время полета (MALDI-TOF). Non Денатурирующий гель полиакриламида электрофореза (страница) техника облегчает изображений формирования триплекс, потому что тщательно продуманные конструкции бесплатно РНК дуплекс и ПНА связаны Трёхквартирные часто показывают различные миграции ставки. Non денатурации страница с окрашивание пост бромид ethidium является часто легко и информативным методом для характеризующие привязки сродства и специфики ПНА олигомеров. Как правило несколько РНК заколки или дуплексы с одной пары мутации может использоваться для характеризуют ПНА привязки свойства, такие как привязка сродства и специфики. 2-Aminopurine является изомером аденин (6-aminopurine); интенсивность флуоресценции 2-aminopurine чувствительна к местной окружающей среде структурных изменений и подходит для мониторинга триплекс формирования с 2-aminopurine остатков включены возле ПНА привязки сайта. 2-Aminopurine флуоресценции титрования может также использоваться для подтверждения привязки избирательность модифицированных PNAs направлении целевых двуцепочечные РНК (двуцепочечных РНК) над одноцепочечной РНК (ssRNAs). УФ поглощения обнаружены тепловой плавления эксперименты позволяют измерения тепловой стабильности PNA-РНК дуплексы и PNA· 2 Трёхквартирные РНК. Здесь мы описываем синтеза и очистки ПНА олигомеров включения изменение остатков и описать биохимические и биофизические методы для характеризации признания РНК дуплексы, модифицированных PNAs.

Реверс фаза ВЭЖХ позволяет очистки ПНА олигомеров. Мы можем получить чистый олигомеров ПНА с двух раундов ВЭЖХ очистки (рис. 3). Личность PNAs могут быть подтверждены MALDI-TOF анализа (рис. 4).
Денатурации номера страницы является легко и информативным методом для характеризующие привязки сродства и специфики ПНА олигомеров. Мы обычно используют несколько РНК заколки или дуплексы с одной пары мутации характеризовать свойства привязки (рис. 5). Денатурации страницы данных показано на рисунке 5 четко показывают что Q и L-модифицированные ПНА можно признать dsRNA региона с парой C-G (рис. 5B, Нижняя панель) но не один, без пара C-G (рис. 5B, топ Группа). Это конкретные и расширение признания — через T· A-U, L· G-C и Q· C-G PNA· 2 базовый тройной (рис. 1A, C, D) образования РНК. Различные PNAs с одной или несколькими мутации могут также использоваться для демонстрации улучшения привязки свойств модифицированных ПНА. Мы показали, что добавление 2 мм Mg2 + в буфере инкубации не влияет на привязку значительно31.
Мы продемонстрировали на титрование флуоресценции 2-aminopurine, PNA, Q и L-изменен привязывается целевых dsRNA региона (рис. 6А, 6 С, 6 D), но не ssRNA (Рисунок 6B, 6E, 6F). ПНА P3 привязывается к 2-aminopurine меченых dsRNA со значениемd K0,8 ± 0,1 мкм. Интенсивности флуоресценции в 370 Нм для ssRNA 2-aminopurine меченых остается относительно постоянным с разнообразный P3 концентрации, указывающее отсутствие привязки ПНА P3 для ssRNA.
PNAs, содержащие Q остатков (P2 и P3) шоу не тепловой плавления переходы (рис. 7), предлагая привязки к ssRNA. Это объясняется их пространственной столкновение, присутствующих в Уотсона-крика как Q-G пара. По сравнению с неизмененной ПНА P1, PNAs P4 и P5 содержащие изменение остатков L, но не Q остатков, показывают снижение температуры плавления для соответствующего РНК-PNA дуплексов вследствие их пространственной столкновение, присутствующих в Уотсона-крика как пара L-G. УФ поглощения обнаружены тепловой плавления данные согласуются с данными титрования флуоресценции 2-aminopurine, который также показывают, что ПНА, содержащие остатки Q и L не привязан к ssRNA заметно (Рисунок 6B, 6E, 6F). Включение Q база является более дестабилизирующее чем L базы, как Q база имеет более значительную их пространственной столкновение в формировании пару Уотсона-крика как Q-G (рис. 1F), по сравнению с парой Уотсона-крика как L-G (рис. 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Рисунок 1 : Химическая структура стабильной базы тройной и нестабильной пары структур. (A-D) Майор паз PNA· РНК2 базовый троек T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) и Q· C-G (D). (E, F) Нестабильная Уотсона-крика как PNA-РНК низкопробных пар L-G (E) и Q-G (F). Буква R представляет основу сахара фосфат РНК. Водородные связи обозначаются черные пунктирные линии. Цифра приводится ссылка31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Рисунок 2 : Химических структур ПНА мономеров. Показаны четыре ПНА мономеров (T, C, L и Q). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Рисунок 3 : Химическая структура очистки, RP-ВЭЖХ и ПНА олигомера. (A) Химическая структура ПНА последовательности P3. (B, C) RP-ВЭЖХ данных сырой ПНА P3 (B) и повторно очищается ПНА P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Рисунок 4 : Спектр MALDI-TOF очищенный ПНА P3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Рисунок 5 : Шпилька РНК и ПНА последовательности и привязки характеристика - денатурации страницы. (A) РНК шпильками (rHP1 и rHP2), ПНА P3 и PNA· РНК2 триплекс образуются между ПНА P3 и rHP2. Для rHP1 и rHP2 привязка для PNA P3 результаты (B) денатурации номера страниц (12%). Инкубационный буфера составляет 200 мм NaCl, 0.5 мм ЭДТА, 20 HEPES, рН 7,5. Загружен заколки РНК (rHP1 и rHP2) находятся на 1 мкм в 20 мкл. ПНА концентрации в строках слева направо, 0, 0,2, 0,4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, и 50 µM. ПНА P3 не привязан к rHP1 (Верхняя панель) но привязывается к rHP2 (Нижняя панель). (C) Kd определение P3 привязки к rHP2. Фракция триплекс формирования (Y) был заговор против концентрации ПНА. Рисунок заимствован из ссылки31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Рисунок 6 : Исследование флуоресценции титрования ПНА P3 привязкик 2-aminopurine меченых молекул РНК. 2-aminopurine остатков обозначается как '2' в РНК последовательности. Инкубационный буфера составляет 200 мм NaCl, 0.5 мм ЭДТА, 20 HEPES, рН 7,5. (A) PNA· РНК2 триплекс образуются между P3 и 2-aminopurine меченых двуцепочечной ДНК (dsRNA2-2АП). (B) гипотетическая PNA-РНК дуплекс образуются между P3 и 2-aminopurine меченых ssRNA (ssRNA2-2АП). (C, E) Спектры флуоресценции выбросов для 2-aminopurine меченых РНК двухуровневый (1 мкм) и ssRNA (1 мкм), соответственно, с разнообразны P3 концентрации при pH 7.5. Пик на около 475 Нм обусловлена слабой флуоресценции выбросов L базы в ПНА. (D, F) K d определение основано на участках интенсивности флуоресценции 2-aminopurine (370 Нм) РНК дуплекс и ssRNA, соответственно, против концентрации ПНА P3. Рисунок заимствован из ссылки31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Рисунок 7 : Тепловой плавления результаты для РНК-PNA дуплексы. Инкубационный буфера составляет 200 мм NaCl, 0.5 мм ЭДТА, 20 NaH2PO4, pH 7.5. Все образцы содержат 5 мкм одноцепочечной РНК (ssRNA1) и ПНА в 130 мкл. (A) одноцепочечной РНК (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 и P5) и гипотетические дуплекс PNA-РНК, образуются между ПНА P3 и ssRNA1 в параллельной ориентации. Их пространственной столкновение указывается для Уотсона-крика как Q-G и L-G пар. (B) плавления кривые для различных PNAs привязки к ssRNA1. Для кривых с плавления переходов указаны температуры плавления. Рисунок заимствован из ссылки31.

Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Последовательность конкретных и избирательное признание двуцепочечной РНК над одноцепочечной РНК, химически изменены пептид нуклеиновых кислот

Мы приводим протоколы для синтеза и очищения пептида нуклеиновой кислоты (PNA) олигомеров включения изменение остатков. Биохимические и биофизические методы для характеризации признания РНК дуплексы, модифицированных PNAs описаны.

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Доставка нуклеиновых кислот через Эмбрион микроинъекции в во всем мире насекомых-вредителей сельского хозяйства,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Конъюгативных Спаривание Анализы для последовательности конкретного анализа переноса белков, участвующих в конъюгации бактерий

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Разведению и двухцепочечную РНК-опосредованный нокдаун гена в Скрыть Beetle,<em&gt; Кожеед пятнистый</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Атомно-силовая микроскопия Исследования распознавания повреждения ДНК при восстановлении эксцизии нуклеотидов

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Метаболические маркировки и профилирование передачи РНК с помощью Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Ячейки на основе анализов SINEUP кодирования РНК, которые могут конкретно улучшить перевод мРНК

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Определение последовательности зарождающейся вирусной ДНК одноцепочечной молекул во время ВИЧ-1 и 3'-Термини обратный транскрипции в инфицированных клетках

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Экспрессирующих длиной некодирующих РНК с помощью активации генов ТРИФОСФАТЫ

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

В vitro биохимические анализы с использованием биотина этикетки для изучения белково-нуклеиновой кислоты взаимодействия

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Микроары ДНК и РНК с высокой плотностью - фотолитографический синтез, гибридизация и подготовка больших нуклеиновой кислоты

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...