Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00
Duration: 9 min 4 s
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Este trabajo fue apoyado por el Singapur Ministerio de Educación (MOE) nivel 1 (RGT3/13 y RG42/15 a G.C.) y MOE nivel 2 (MOE2013-T2-2-024 y MOE2015-T2-1-028 a G.C.).

Que se haya presentado una solicitud de patente (PAT/179/14/15/PCT) basada en el trabajo reportado aquí.

Oligómeros PNA RNA duplex vinculante (por ejemplo, 10-mers) son moléculas de tamaño mediano y así puede mostrar cambio de movilidad electroforética a enlace de RNAs con un tamaño comparable o ligeramente mayor (por ejemplo, 50-mer o menor). Si un ARN es significativamente mayor que la Prefectura Naval Argentina, valoración de PNA en el RNA puede no funcionar debido a un cambio de movilidad limitada gel. Así, el RNA grande puede truncarse por los análisis de la página no desnaturalizantes. Valoración de un RNA grande en una PNA fluoróforo permite el seguimiento de la formación del triple por un gel de agarosa desnaturalizantes no con la muestra cargada en el gel de40.
Para un experimento de valoración por página no desnaturalizar con una concentración total constante de ARN, por lo general usamos una concentración de RNA sin etiqueta de 1 μm para eficiente post coloración del RNA libre y bandas triples por bromuro de etidio. Una concentración de RNA tan baja como 0.2 μm también puede ser suficiente según el RNA construir31. La concentración del RNA sin etiqueta (0,2 μm) determina que los valores ded de Kque pueden medirse con precisión deben ser de 0,2 μm o más grandes. Otros colorantes de tinción pueden utilizarse para mejorar la eficacia de la coloración. Por otra parte, nuestros datos no publicados sugieren que Cy3 RNAs de marcado tinte puede utilizarse en condiciones no desnaturalizantes página experimentos para medir los eventos atascamiento apretado.
Debido a que sólo es moderadamente fluorescente 2-aminopurina, 2-aminopurina valoración de fluorescencia también es limitada a la medida del enlace con valores ded de Kcerca o por encima de 0,2 μm31. El ARN o la ANP puede etiquetarse con un tinte relativamente brillante para cuantificar un atascamiento relativamente estrecha en la solución a través de la valoración de la fluorescencia, si la Unión resulta en cambios en la fluorescencia señales53,54, 55.
La estrategia de focalización estructuras de ARN por Unión dsRNA PNAs ha sido probada para un número limitado de RNAs. Es probable que enlace propiedades puede variar por dsRNAs con diferentes composiciones de secuencias y pares. Uno siempre puede elegir la hebra rica en purina de un dúplex para el diseño de TFPNAs. Es fundamental entender cómo consecutivos Q· C-G triples pueden afectar la estabilidad de un triplex. Estudios más extensos de la secuencia-dependientes son necesarias para comprender las propiedades de enlace dependiente de la secuencia de TFPNAs.
La afinidad de TFPNAs puede mejorarse aumentando la longitud y/o modificar aún más las bases y redes troncales56,57 TFPNAs. Sin embargo, una región continua de dos caras puede a menudo consiste de más de 10 pares de bases consecutivos sin la interrupción por estructuras de Watson-Crick. Uno puede conjugar TFPNAs con pequeñas moléculas para el reconocimiento de Watson-Crick estructuras adyacentes a las regiones de dsRNA. En principio, se espera que una conjugación de la molécula de TFPNA pequeñas han mejorado la afinidad y especificidad en comparación con un TFPNA o solamente pequeñas moléculas. Sin embargo, las propiedades químicas y físicas de la linker para la conjugación58,59,60,61,62,63,64 debe ser optimizado.
El hecho de que TFPNAs puede atar selectivamente a dsRNAs ssRNAs y dsDNAs sugiere que es posible desarrollar TFPNAs sondas químicas muy útiles como ligandos potenciales terapéuticos a través de la regulación de la dinámica estructural del RNA y las interacciones con proteínas y metabolitos. La absorción celular de TFPNAs puede facilitarse a través de la conjugación con moléculas de penetrar en la célula como moléculas pequeñas, péptidos y nanopartículas, o formación de complejos con estructuras supramoleculares como liposomas5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Funcionalización de TFPNAs con las etiquetas de Bioimagen como fluoróforos y radioisótopos puede facilitar aún más la detección, la proyección de imagen y el señalamiento de estructuras de RNA funcionales en los organismos vivos.

RNAs están emergiendo como importantes biomarcadores y dianas terapéuticas, debido a los recientes avances en los descubrimientos de los roles de los RNAs en la regulación y la catálisis de procesos biológicos diversos1,2,3. Tradicionalmente, se han utilizado hilos antisentidos para enlazar a ssRNAs a través de Watson-Crick formación duplex3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. recientemente, triplex formando péptidos ácidos nucleicos (TFPNAs) han sido diseñados para enlazar a dsRNAs vía hidrógeno Hoogsteen vinculación (figura 1)3,28,29. dsRNA regiones están presentes en la mayoría de los ARNs antisentido dirigidos tradicionales, incluyendo pre-mRNAs y mRNAs, pre- o pri-miRNAs3y muchos otros no-codificación RNAs1,26,27. DsARNs a través de la formación de la triple hélice con TFPNAs puede ser ventajosa debido a la especificidad de su estructura y es de gran potencial para el uso en la restauración de las funciones normales de las RNAs, que son normales en las enfermedades, por ejemplo.
El recientemente publicado trabajo de Rozners et al.y nosotros3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, informó de los esfuerzos en la mejora de la Unión selectiva de TFPNAs modificados a dsRNAs con mayor afinidad. Hemos desarrollado métodos de síntesis de monómeros PNA racionalmente diseñados (figura 2) incluyendo thio-pseudoisocytosine (L) monómero30 y guanidina-modificado 5-metil citosina (Q) monómero31. A través de varios métodos de caracterización bioquímica y biofísica, hemos demostrado que PNAs relativamente corto (6-10 residuos) incorporación de residuos de L y Q muestren mejor reconocimiento de pares de bases Watson-Crick G-C y C-G, respectivamente, en dsRNAs. Por otra parte, comparado con PNAs sin modificar, PNAs que contiene residuos de L y Q mostraron enlace más selectiva hacia dsARN ssRNA y dsDNA. La funcionalidad de guanidina42 en la base de Q permite PNAs entrar en las células de HeLa31.
En nuestro laboratorio, sintetizamos PNAs por la Boc-química manual (Boc o t- Boc es tert-butyloxycarbony (ver figura 2) de método de síntesis de péptidos de fase sólida4. La síntesis del monómero PNA con Boc como la amina protección de grupo es conveniente que el grupo Boc es sterically menos voluminoso en comparación con la amina fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) protección de grupo, que puede ser beneficioso durante el monómero PNA de acoplamiento la soporte sólido. El grupo Boc es ácido lábil y se puede quitar fácilmente en el soporte sólido por 20-50% de ácido trifluoroacético (TFA) en diclorometano (DCM) durante la síntesis de PNA. Un sintetizador de péptidos automatizada se puede emplear para sintetizar oligómeros PNA; sin embargo, 3-5-fold exceso de monómero PNA es necesario para un sintetizador de péptidos automatizada. Síntesis manual requiere significativamente menos monómero ANP (2-3-fold exceso), con cada acoplamiento fácilmente monitoreado por el Kaiser prueba43. Además, muchos sintetizadores automatizados no son compatibles con la síntesis de la estrategia de Boc debido al uso de TFA corrosivo durante el paso de eliminación de Boc.
Los oligómeros PNA pueden ser purificados por fase reversa cromatografía líquida alto rendimiento (RP-HPLC) seguida de la caracterización del peso molecular por MALDI-TOF (figuras 3 y 4)30, 31. empleamos página no desnaturalizantes para monitorear la triple formación, debido a que construye duplex RNA libre y PNA obligado triplex a menudo muestran diferente migración tasas (figura 5)30,31 . No etiquetado es necesario si la coloración eficiente puede lograrse para ambos el RNA duplex y PNA· Bandas triples de RNA2 . Una relativamente pequeña cantidad de muestra se necesita para no desnaturalizar página experimentos. Sin embargo, los almacenadores intermediarios del cargamento (incubación) y los buffers de corrientes (pH 8,3) pueden no ser el mismo, dando por resultado las medidas se limita a la conexión cinéticamente estable, debido a un pH relativamente alto de 8.3 significativamente puede desestabilizar un triplex.
2-aminopurina es un isómero de la adenina (6-aminopurina); la intensidad de fluorescencia de la 2-aminopurina (con un pico de emisión en alrededor de 370 nm) es sensible a los cambios del entorno estructural y es conveniente para el seguimiento de la formación de triplex con el residuo de la 2-aminopurina incorporados cerca de la Prefectura Naval Argentina (sitio de Unión Figura 6) 31. a diferencia de muchos otros tintes que muestran la emisión de fluorescencia en la gama visible, RNA 2-aminopurina-labeled puede estar expuesto a luz de la habitación sin blanquear de la foto. A diferencia del experimento de la página en la que con frecuencia es necesaria un corriente buffer de pH 8.3, 2-aminopurina basado en titulación de fluorescencia permite la medición de la Unión en una sola solución a un pH determinado y así puede permitir la medición y detección de relativamente débil y enlace cinéticamente inestable equilibrio.
Experimentos de fusión termal detección de absorbancia UV permiten la medición de la estabilidad térmica de dúplex (figura 7)31 y tricomplejos30,32,44,45. Dependiendo de la composición de longitud y secuencia, la fusión de conexión puede o no puede mostrar una transición clara. Parámetros termodinámicos pueden obtenerse si se superponen las curvas de calentamiento y enfriamiento. Parámetros termodinámicos exactos se pueden obtener por titulación isotérmica calorimetría (ITC)32; sin embargo, cantidades relativamente grandes de muestras son generalmente necesarios para la ITC.

<table style="border-collapse:collapse;width:491pt" width="654">
	<colgroup>
		<col style="width:176pt" width="235" />
		<col style="width:116pt" width="155" />
		<col span="3" style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl25" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl74" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">87956</td>
			<td style="width:66pt" width="88"></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&#376;HCl)</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl68" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">532444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B25251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acetic anhyride</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Kaiser Test Kit&#160;</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L06374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Unmodified PNA monomers</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">ASM Research Chemicals GmbH</td>
			<td class="xl70" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B8389 / 47624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Thioanisole</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoromethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A10173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">LiChrosper&#174; 100 RP-18 endcapped (5 &#181;m) LiChroCART&#174; 250-4</td>
			<td class="xl41">Merck Millipore</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">150838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">RNA Oligos&#160;</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">Customized&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">39468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td class="xl41">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">J15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">HEPES&#160;</td>
			<td class="xl41">Lonza</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N.N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">146072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td>
			<td class="xl41">1st Base</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">BUF-3010-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Glycerol&#160;</td>
			<td class="xl45">Promega&#160;</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">H5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethidium bromide (10 mg/mL)</td>
			<td class="xl45">Bio-rad&#160;</td>
			<td class="xl64" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl48" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td>
			<td class="xl49">Hellma Analytics&#160;</td>
			<td class="xl61" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">105.250-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

RNAs están emergiendo como importantes biomarcadores y dianas terapéuticas. Así, hay gran potencial en el desarrollo de sondas químicas y terapéuticas ligandos para el reconocimiento de la estructura y secuencia de ARN. Modificar químicamente péptidos ácidos nucleicos (PNA) oligómeros se han desarrollado recientemente que puede reconocer dúplex RNA de una manera específica de secuencia. PNAs son químicamente estables con un esqueleto de péptidos como neutral. PNAs se pueden sintetizar relativamente fácilmente por el método de síntesis de péptidos de fase sólida manual de Boc-química. PNAs son purificadas por HPLC de fase inversa, seguido de la caracterización del peso molecular por láser asistida por matriz de desorción/ionización-tiempo de vuelo (MALDI-TOF). Técnica de electroforesis (PAGE) de gel de poliacrilamida no desnaturalizantes facilita la proyección de imagen de la formación de triplex, porque cuidadosamente diseñado gratis RNA duplex construye y PNA obligado triplex a menudo Mostrar tasas de migración diferentes. Página no desnaturalizar con bromuro de etidio post coloración es a menudo una técnica fácil e informativa para la caracterización de las afinidades de Unión y especificidades de oligómeros PNA. Por lo general, múltiples horquillas de RNA o dúplex con mutaciones de pares solo puede utilizarse para caracterizar propiedades de enlace de PNA, como vinculante las afinidades y especificidades. 2-aminopurina es un isómero de la adenina (6-aminopurina); la intensidad de fluorescencia de la 2-aminopurina es sensible a los cambios del entorno estructural y es conveniente para la supervisión de formación de triplex con el residuo de la 2-aminopurina incorporado cerca el sitio de unión de la Prefectura Naval Argentina. 2-aminopurina valoración de fluorescencia puede utilizarse también para confirmar la selectividad de unión de PNAs modificados hacia objetivos RNAs de doble hebra (dsARN) en ARN monocatenario (ssRNAs). Experimentos de fusión termal detección de absorbancia UV permiten la medición de la estabilidad térmica de PNA-ARN dúplex y PNA· Tríplex de2 RNA. Aquí, describimos la síntesis y purificación de oligómeros PNA incorporando modifica residuos y describir los métodos bioquímicos y biofísicos para la caracterización del reconocimiento de dúplex RNA por las PNAs modificados.

HPLC de fase inversa permite la purificación de oligómeros PNA. Podemos obtener oligómeros PNA puros con dos rondas de la purificación de HPLC (figura 3). La identidad de los PNAs puede confirmarse por análisis de MALDI-TOF (figura 4).
Página de desnaturalización no es una técnica fácil e informativa para la caracterización de las afinidades de Unión y especificidades de oligómeros PNA. Por lo general utilizamos múltiples horquillas de RNA o dúplex con mutaciones de base par caracterizar propiedades de enlace (figura 5). Los datos de la página de desnaturalización no que se muestra en la figura 5 indican claramente que el Q - y L-modificado PNA puede reconocer una región de dsRNA con un par de C-G (figura 5B, panel inferior) pero no uno sin un par de C-G (figura 5B, superior panel). Este reconocimiento específico y mayor es el T· A-U, L· G-C y Q· C-G PNA· RNA2 base triple (figura 1A, C, D) la formación. Varios PNAs con una o varias mutaciones pueden usarse para demostrar las propiedades de enlace mejorado de un ANP modificado. Hemos demostrado que añadir 2 mM Mg2 + en el tampón de incubación no afecta el atascamiento perceptiblemente31.
Hemos demostrado por titulación de la fluorescencia de la 2-aminopurina que una PNA Q y L modificado se une a una región de dsRNA dirigido (figura 6A, 6 C, 6 D) pero no ssRNA (figura 6B, 6E, 6F). P3 de la Prefectura Naval Argentina se une al dsRNA 2-aminopurina-etiquetados con un valor ded Kde 0,8 ± 0,1 μm. La intensidad de fluorescencia a 370 nm para la 2-aminopurina-labeled ssRNA permanece relativamente constante con la variada concentración de P3, indicando la falta de unión de PNA P3 a la ssRNA.
PNAs con show de residuos (P2 y P3) Q no termo fusión de transiciones (figura 7), no sugiriendo vinculante a la ssRNA. Esto es debido al choque estérico presente en Watson-Crick como par Q-G. En comparación con P1 PNA sin modificar, PNAs P4 y P5 que contiene modificaron L residuos pero sin residuos Q, mostrar disminución de temperatura de fusión para la dúplex RNA-PNA correspondiente debido al choque estérico presente en Watson-Crick como par L-G. Los datos de fusión termal detección de absorbancia UV son consistentes con los datos de valoración de fluorescencia 2-aminopurina, que también muestran que una PNA que contiene residuos de Q y L no se une a ssRNA apreciable (figura 6B, 6E, 6F). Incorpora una base Q es más desestabilizadora que una base de L, como una base Q tiene un choque estérico más importante en la formación de un par de Watson-Crick-como Q-G (figura 1F) comparado con un par de Watson-Crick-como L-G (figura 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Figura 1 : Estructuras químicas de estructuras estable base triple e inestable par. (A, D) PNA· mayor-surco RNA2 base triples de T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) y Q· C-G (D). (E, F) Watson-Crick inestable como pares bajos PNA-RNA L-G (E) y Q-G (F). La letra R representa lo azúcar-fosfato de ARN. Enlaces de hidrógeno están indicados por líneas discontinuas negras. Se reproduce la figura de referencia31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Figura 2 : Estructuras químicas de los monómeros PNA de. Se muestran cuatro monómeros PNA (T, C, L y Q). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Figura 3 : Estructura química de un oligómero PNA y de purificación por RP-HPLC. (A) estructura química de la secuencia PNA P3. (B, C) Datos de RP-HPLC de crudo PNA P3 (B) y volver a PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Figura 4 : Espectro MALDI-TOF de purificada PNA P3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Figura 5 : Horquilla de RNA y las secuencias PNA y caracterización vinculante por página no desnaturalizantes. Horquillas para el pelo (A) RNA (rHP1 y rHP2), PNA P3 y un PNA· RNA2 triplex formado entre PNA P3 y rHP2. Página de desnaturalización no (B) (12%) resultados para rHP1 y atascamiento de rHP2 a PNA P3. El tampón de incubación es 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA 20 mM HEPES, pH 7,5. Las horquillas cargadas de RNA (rHP1 y rHP2) están a 1 μm de 20 μl. Las concentraciones de la Prefectura Naval Argentina en los carriles de izquierda a derecha son 0, 0.2, 0.4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, y 50 μm. PNA P3 no enlazar a rHP1 (panel superior) pero se une a rHP2 (panel inferior). (C) Kd determinación P3 Unión rHP2. La fracción de la formación de triplex (Y) se enfrenta a la concentración de ANP. La figura es adaptada de la referencia31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Figura 6 : Estudio de valoración de fluorescencia de enlace PNA P3a la 2-aminopurina-labeled RNAs. El residuo de la 2-aminopurina es señalado como '2' en la secuencia de RNA. El tampón de incubación es 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA 20 mM HEPES, pH 7,5. (A) un PNA· RNA2 triplex formado entre P3 y un dsRNA etiquetado 2-aminopurina (dsRNA2-2AP). (B) un duplex de PNA-RNA hipotético formado entre P3 y un 2-aminopurina-labeled ssRNA (ssRNA2-2AP). (C, E) Espectros de emisión de fluorescencia para la 2-aminopurina-labeled RNA duplex (1 μm) y ssRNA (1 μm), respectivamente, con variar P3 concentración a pH 7,5. El pico en alrededor de 475 nm es debido a la emisión de fluorescencia débil de la base de la L en la Prefectura Naval Argentina. (D, F) K d determinación basada en las parcelas de la intensidad de fluorescencia de la 2-aminopurina (a 370 nm) de la RNA duplex y ssRNA, respectivamente, frente a concentración de ANP P3. La figura es adaptada de la referencia31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Figura 7 : Termo fusión resultados para dúplex RNA-Prefectura Naval Argentina. El tampón de incubación es 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA 20 mM NaH2PO4, pH 7,5. Todas las muestras contienen 5 μm de RNA monocatenario (ssRNA1) y PNA en 130 μl. (A) RNA monocatenario (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 y P5) y un dúplex de PNA-RNA hipotético formado entre PNA P3 y ssRNA1 en una orientación paralela. El choque estérico está indicado para el Crick de Watson como pares L G Q G. (B) fusión de curvas para diferentes PNAs a ssRNA1. La temperatura de fusión se muestra las curvas con transiciones de fusión. La figura es adaptada de la referencia31.

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Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Reconocimiento de secuencia específica y selectivo de RNAs de doble cadena sobre ARN monocatenario de modifica químicamente los ácidos nucleicos péptidos

Divulgamos los protocolos para la síntesis y purificación de oligómeros del péptido de ácido nucleico (PNA) incorporando modificado residuos. Se describen los métodos bioquímicos y biofísicos para la caracterización del reconocimiento de dúplex RNA por las PNAs modificados.

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Investigación

Genética

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Conjugación de apareamiento Los ensayos para el análisis específico de la secuencia de proteínas de transferencia que participan en la conjugación bacteriana

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Investigaciones de Microscopía de Fuerza Atómica de Reconocimiento de Lesión de ADN en Reparación de Excisión de Nucleótidos

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Etiquetado metabólico y perfiles de RNAs de transferencia utilizando Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Celular basado en análisis de SINEUP no-codificación RNAs que específicamente pueden mejorar la traducción del mRNA

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Determinante 3'-Termini y secuencias de las moléculas de ADN Viral naciente en HIV-1 Reverse transcripción en células infectadas

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Overexpressing larga Noncoding RNAs mediante activación de gen CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Microarrays de ADN y ARN de alta densidad - Síntesis fotolitográfica, hibridación y preparación de grandes bibliotecas de ácido nucleico

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...