Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Detta arbete stöds av Singapore ministeriet för utbildning (MOE) Tier 1 (RGT3/13 och RG42/15 att G.C.) och MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 och MOE2015-T2-1-028 att G.C.).

En patentansökan (PAT/179/14/15/PCT) som bygger på det arbete som redovisas här har lämnats in.

RNA duplex-bindande PNA oligomerer (t.ex., 10-mers) är medelstora molekyler och därmed kan visa elektroforetiska mobilitet Skift vid bindning till RNAs med en jämförbar eller något större storlek (t.ex., 50-mer eller mindre). Om en RNA är betydligt större än PNA, kanske titrering av PNA i RNA inte fungerar på grund av en begränsad gel rörlighet SKIFT. Således, den stora RNA trunkeras för de icke-denatureringen sida analyserna. Titrering av en stor RNA in en fluorophore-märkt PNA möjliggör övervakning av triplex bildandet av en icke-denatureringen agarosgel med provet laddade mitt gel40.
För ett experiment med titrering av icke-denaturering med en konstant koncentration av RNA använder vi vanligtvis en omärkt RNA-koncentrationen av 1 µM för effektiv post färgning av gratis RNA och triplex band av etidiumbromid. En RNA-koncentrationen så låga som 0,2 µM kan också vara tillräckligt beroende på RNA konstruera31. Koncentrationen av omärkta RNA (0,2 µM) avgör att Kd värdena som kan mätas exakt bör vara om 0,2 µM eller större. Andra färgning färgämnen kan användas för att effektivisera färgning. Alternativt tyder våra opublicerade data på att Cy3 dye-märkt RNAs kan användas i icke-denatureringen sidan experiment för att mäta trånga bindande händelserna.
På grund av att 2-aminopurine är endast måttligt fluorescerande, är 2-aminopurine fluorescens titrering också begränsad till mätningen av bindningen med Kd -värden nära eller över 0,2 µM31. RNA eller PNA kan märkas med en relativt ljus färgämne för att kvantifiera en relativt snäva bindande lösning genom fluorescens titrering, om bindningen resulterar i förändringar i fluorescens signaler53,54, 55.
Strategin med inriktning RNA strukturer av dsRNA-bindande PNAs har testats för ett begränsat antal RNAs. Det är troligt att bindande egenskaper kan variera för dsRNAs med olika sekvenser och baspar kompositioner. Man kan alltid välja purine-rika strand med en duplex för utformningen av TFPNAs. Det är viktigt att förstå hur raka Q· C-G tripplar kan påverka stabiliteten i en triplex. Mer omfattande sekvens-beroende studier tydligt behövs för att förstå sekvens-beroende bindande egenskaper för TFPNAs.
Affinitet för TFPNAs kan förbättras ytterligare genom att öka längden och/eller ytterligare modifiera de baser och ryggrader56,57 i TFPNAs. Dock kan en kontinuerlig duplex region inte ofta bestå av mer än 10 konsekutiva baspar utan störningar av icke-Watson-Crick strukturer. Man kan böja TFPNAs med små molekyler för erkännande av icke-Watson-Crick strukturer intill dsRNA regioner. I princip förväntas ett TFPNA-liten molekyl konjugat ha bättre affinitet och specificitet jämfört med en TFPNA eller liten molekyl ensam. Dock de kemiska och fysikaliska egenskaperna av länkaren för de konjugation58,59,60,61,62,63,64 måste optimeras.
Det faktum att TFPNAs kan selektivt binder till dsRNAs över ssRNAs och dsDNAs tyder på att det är möjligt att utveckla TFPNAs som mycket användbar kemisk sonder och potentiella terapeutiska ligander genom reglering av RNA strukturdynamik och interaktioner med proteiner och metaboliter. Cellernas upptag av TFPNAs kan underlättas genom konjugationen med cell-penetrerande beståndsdelarna som små molekyler, peptider, och nanopartiklar eller komplexbildning med supramolekylär strukturer såsom liposomer5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Funktionalisering av TFPNAs med bioimaging taggar såsom fluorophores och radioisotoper kan ytterligare underlätta upptäckten, imaging och målinrikta funktionella RNA strukturer i levande organismer.

RNAs växer fram som viktiga biomarkörer och terapeutiska mål, på grund av de senaste framstegen inom upptäckter av RNASEN roller i förordningen och katalys av olika biologiska processer1,2,3. Traditionellt, har antisense trådar använts för att binda till ssRNAs till Watson-Crick duplex bildandet3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. nyligen, triplex-bilda peptid nukleinsyror (TFPNAs) har utformats för att binda till dsRNAs via Hoogsteen vätebindningen (figur 1)3,28,29. dsRNA regioner är närvarande i flesta traditionella antisense-riktade RNASEN, inklusive pre-mRNA och mRNA, före eller pri-MicroRNA3, och många andra icke-kodande RNAs1,26,27. Inriktning dsRNAs genom Trippel helix formation med hjälp av TFPNAs kan vara fördelaktigt på grund av dess struktur särart och är av stor potential för användning i att återställa normala funktioner av RNASEN, som är dysreglerad i sjukdomar, till exempel.
Den nyligen publicerade arbete av Rozners et al., och oss3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, rapporterade ansträngningar på att förbättra selektiva bindningen av modifierade TFPNAs mot dsRNAs med förbättrad affinitet. Vi har utvecklat syntesmetoder för rationellt designade PNA monomerer (figur 2) inklusive thio-pseudoisocytosine (L) monomer30 och guanidin-modifierad 5-metyl cytosin (Q) monomer31. Genom olika biokemiska och biofysiska karakterisering metoder, har vi visat att relativt kort PNAs (6-10 rester) införliva L och Q rester visar förbättrad erkännande av Watson-Crick G-C och C-G baspar, respektive i dsRNAs. Jämfört med oförändrad PNAs, visar PNAs innehållande L och Q rester dessutom mer selektiv bindning mot dsRNA över ssRNA och dsDNA. De guanidin funktionalitet42 i Q basen gör PNAs ange HeLa celler31.
I vårt laboratorium, vi syntetisera PNAs av manuell Boc-kemi (Boc eller t- Boc står för tert-butyloxycarbony (se figur 2) fasta fasen peptid syntes metod4. Syntesen av PNA monomeren med Boc som den aminen skydda gruppen är bekvämt eftersom gruppen Boc är koalisera mindre skrymmande jämfört med fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) amine skydda gruppen, vilket kan vara fördelaktigt under PNA monomer koppling den fast stöd. Boc gruppen är syra-labila och kan lätt avlägsnas med massivt stöd av 20-50% trifluorättiksyra (TFA) i diklormetan (DCM) under PNA syntes. En automatiserad peptid synthesizer kan användas för att syntetisera PNA oligomerer; 3-5-faldigt överskott av PNA monomer behövs dock för en automatiserad peptid synthesizer. Manuell syntes kräver betydligt mindre PNA monomer (2-3-faldigt överskott), med varje koppling enkelt övervakas av den Kaiser test43. Dessutom är många automatiserade syntar inte kompatibla med Boc strategi syntesen av användning av frätande TFA under Boc borttagning steg.
De PNA oligomererna kan renas genom omvänd-fas högpresterande vätskekromatografi (RP-HPLC) följt av molekylvikt karakterisering av MALDI-TOF (figurerna 3 och 4)30, 31. vi anställa icke-denatureringen sida att övervaka triplex bildandet, på grund av att gratis RNA duplex konstruerar och PNA bunden etage ofta visa olika migration priser (figur 5)30,31 . Ingen märkning behövs om effektiv efter färgning kan uppnås för båda av RNA duplex och PNA· RNA2 triplex band. En relativt liten mängd prov behövs för icke-denatureringen sidan experiment. Lastning (inkubation) buffertar och rinnande buffertar (pH 8,3) kan dock inte samma, vilket resulterar i mätningarna att vara begränsade till de kinetiskt stabila etage, eftersom ett relativt högt pH-värde på 8,3 avsevärt kan destabilisera en triplex.
2-Aminopurine är en isomer av adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescensintensiteten (med ett utsläpp peak på cirka 370 nm) är känslig för närmiljön strukturella förändringar, och är lämplig för övervakning av triplex formation med 2-aminopurine återstoden införlivas nära PNA bindande webbplats () Figur 6) 31. till skillnad från många andra färgämnen som visar fluorescens utsläpp i det synliga området, 2-aminopurine-märkt RNA kan utsättas för rummet ljus utan foto blekning. Till skillnad från sidan experiment där en rinnande buffert pH 8,3 behövs ofta, 2-aminopurine baserat fluorescens titrering tillåter mätning av bindande i en lösning vid angivna pH och därmed kan tillåta mätning och detektering av relativt svaga och kinetiskt instabil bindande vid jämvikt.
UV-absorbans-upptäckt termiska smälttemperatur experiment tillåta mätning av termisk stabilitet duplex (figur 7)31 och triPlex30,32,44,45. Beroende på längd och sekvens sammansättning, smältning av etage kan eller inte kan visa en tydlig övergång. Termodynamiska parametrar kan erhållas om värme- och kylsystem kurvorna överlappar varandra. Korrekt termodynamiska parametrar kan erhållas genom isotermiska titrering calorimetry (ITC)32; dock krävs relativt stora mängder prover generellt för ITC.

<table style="border-collapse:collapse;width:491pt" width="654">
	<colgroup>
		<col style="width:176pt" width="235" />
		<col style="width:116pt" width="155" />
		<col span="3" style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl25" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl74" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">87956</td>
			<td style="width:66pt" width="88"></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&#376;HCl)</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl68" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">532444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B25251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acetic anhyride</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Kaiser Test Kit&#160;</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L06374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Unmodified PNA monomers</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">ASM Research Chemicals GmbH</td>
			<td class="xl70" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B8389 / 47624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Thioanisole</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoromethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A10173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">LiChrosper&#174; 100 RP-18 endcapped (5 &#181;m) LiChroCART&#174; 250-4</td>
			<td class="xl41">Merck Millipore</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">150838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">RNA Oligos&#160;</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">Customized&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">39468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td class="xl41">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">J15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">HEPES&#160;</td>
			<td class="xl41">Lonza</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N.N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">146072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td>
			<td class="xl41">1st Base</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">BUF-3010-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Glycerol&#160;</td>
			<td class="xl45">Promega&#160;</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">H5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethidium bromide (10 mg/mL)</td>
			<td class="xl45">Bio-rad&#160;</td>
			<td class="xl64" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl48" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td>
			<td class="xl49">Hellma Analytics&#160;</td>
			<td class="xl61" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">105.250-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

RNAs växer fram som viktiga biomarkörer och terapeutiska mål. Således finns det stor potential i att utveckla kemiska sonder och terapeutiska ligander för erkännande av RNA-sekvens och struktur. Kemiskt modifierade peptid nukleinsyra (PNA) oligomerer har nyligen framtagits som kan känna igen RNA duplex i en sekvens-specifika sätt. PNAs är kemiskt stabila med en neutral peptid-liknande ryggrad. PNAs kan syntetiseras relativt enkelt av den manuella Boc-kemi fasta fas peptid syntes metoden. PNAs renas genom HPLC med omvänd fas, följt av molekylvikt karakterisering av matrix-assisted laser desorption och jonisering-tid för flygning (MALDI-TOF). Icke-denatureringen Polyakrylamidgelen elektrofores (sidan) teknik underlättar bildtagning av triplex-formationen, eftersom noggrant utformade gratis RNA duplex konstruerar och PNA bunden etage ofta visa olika migration priser. Icke-denatureringen sida med etidiumbromid bromid post färgning är ofta en enkel och informativ teknik för att karaktärisera den bindande samhörighet och särdrag av PNA oligomerer. Vanligtvis kan flera RNA hårnålar eller etagevåningar med enda baspar mutationer användas att karakterisera PNA bindande egenskaper, till exempel bindande samhörighet och särdrag. 2-Aminopurine är en isomer av adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescensintensiteten är känslig för närmiljön strukturella förändringar, och är lämplig för övervakning av triplex bildandet med 2-aminopurine återstoden införlivas nära PNA bindningsstället. 2-Aminopurine fluorescens titrering kan också användas för att bekräfta bindande selektivitet modifierade PNAs mot riktade dubbelsträngat RNA (dsRNAs) över enkelsträngat RNA (ssRNAs). UV-absorbans-upptäckt termiska smälttemperatur experiment tillåta mätning av termisk stabilitet PNA-RNA duplex och PNA· RNA2 etage. Här beskriver vi syntesen och rening av PNA oligomerer införliva ändras rester och beskriva biokemiska och biofysikaliska metoder för karakterisering av erkännande av RNA duplex av de modifierade PNAs.

HPLC med omvänd fas tillåter rening av PNA oligomerer. Vi kan få ren PNA oligomerer med två rundor av HPLC rening (figur 3). PNAs identitet kan bekräftas genom MALDI-TOF analys (figur 4).
Icke-denatureringen sida är en enkel och informativ teknik för att karaktärisera den bindande samhörighet och särdrag av PNA oligomerer. Vi använder vanligtvis flera RNA hårnålar eller Duplex med enda baspar mutationer för att karakterisera bindande egenskaper (figur 5). De icke-denaturering sida data visas i figur 5 klart tyder på att den Q - och L-modifierade PNA kan känna igen en dsRNA region med ett C-G par (figur 5B, nedre panelen) men inte en utan ett C-G par (figur 5B, top panelen). Detta specifika och förstärkt erkännande är genom T· A-U, L· G-C och Q· C-G PNA· RNA2 bas triple (figur 1A, C, D) bildas. Olika PNAs med enstaka eller flera mutationer kan också användas för att påvisa förbättrad bindande egenskaper en modifierad PNA. Vi har visat att lägga till 2 mM Mg2 + i inkubation bufferten inte påverkar bindningen betydligt31.
Vi har visat genom 2-aminopurine fluorescens titrering som en Q - och L-modifierade PNA binder till en riktad dsRNA region (figur 6A, 6 C, 6 D) men inte ssRNA (figur 6B, 6E, 6F). PNA P3 binder till den 2-aminopurine-märkt dsRNA med ett Kd -värde på 0,8 ± 0,1 µM. Fluorescensintensiteten på 370 nm för de 2-aminopurine-märkt ssRNA förblir relativt konstant med varierad P3 koncentration, som anger bristen på bindningen av PNA P3 till ssRNA.
PNAs innehållande Q rester (P2 och P3) Visa ingen termisk smältande övergångar (figur 7), vilket tyder på ingen bindning till ssRNA. Detta beror på sterisk clash närvarande i Watson-Crick som Q-G par. Jämfört med oförändrad PNA P1, PNAs P4 och P5 innehållande modifierad L rester men inga Q-rester, Visa minskade smälttemperaturen för de motsvarande RNA-PNA duplex på grund av sterisk clash närvarande i Watson-Crick som L-G par. UV-absorbans-upptäckt termiska smälttemperatur data är konsekventa med 2-aminopurine fluorescens titrering data, som också visar att en PNA som innehåller Q och L rester inte binder till ssRNA avsevärt (figur 6B, 6E, 6F). Införliva en Q-base är mer destabiliserande än en L bas, Q bas har en mer betydande sterisk sammandrabbning i bildandet av ett Watson-Crick-liknande Q-G par (figur 1F) jämfört med ett Watson-Crick-liknande L-G par (figur 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Figur 1 : Kemiska strukturer i stabil bas trippel och instabil baspar strukturer. (A-D) Major-groove PNA· RNA2 bas tripplar av T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) och Q· C-G (D). (E, F) Instabila Watson-Crick som PNA-RNA baspar av L-G (E) och Q-G (F). Bokstaven R representerar socker-fosfat ryggraden i RNA. Vätebindningar indikeras av svarta streckade linjer. Bilden återges från referens31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Figur 2 : Kemiska strukturer i PNA monomerer. Fyra PNA monomerer (T, C, L och Q) visas. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Figur 3 : Kemisk struktur av en PNA oligomer och rening av RP-HPLC. (A) kemisk struktur av PNA sekvensen P3. (B, C) RP-HPLC data av rå PNA P3 (B) och åter renas PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Figur 4 : MALDI-TOF spektrum av renat PNA P3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Figur 5 : RNA hårnål och PNA sekvenser och bindande karakterisering av icke-denatureringen. (A), RNA hårnålar (rHP1 och rHP2), PNA P3, och en PNA· RNA2 triplex bildas mellan PNA P3 och rHP2. (B) icke-denatureringen sida (12%) resultat för rHP1 och rHP2 bindning till PNA P3. Inkubation bufferten är 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. De laddade RNA hårnålar (rHP1 och rHP2) finns på 1 µM i 20 µL. PNA koncentrationerna i körfält från vänster till höger är 0, 0,2, 0,4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, och 50 µM. PNA P3 binder inte till rHP1 (övre panelen) men binder till rHP2 (nedre panelen). (C), Kd bestämning för P3 bindning till rHP2. Fraktionen av triplex bildandet (Y) var plottas mot PNA koncentrationen. Siffran är anpassade från referens31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Figur 6 : Fluorescens titrering studie av PNA P3 bindandetill 2-aminopurine-märkt RNAs. 2-aminopurine återstoden betecknas som '2' i sekvensen RNA. Inkubation bufferten är 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. (A), en PNA· RNA2 triplex bildas mellan P3 och en 2-aminopurine-märkt dsRNA (dsRNA2-2AP). (B) en hypotetisk PNA-RNA duplex bildas mellan P3 och en 2-aminopurine-märkt ssRNA (ssRNA2-2AP). (C, E) Fluorescens utsläpp spectra för 2-aminopurine-märkt RNA duplex (1 µM) och ssRNA (1 µM), respektive, omväxlande med P3 koncentration vid pH 7,5. Toppen vid omkring 475 nm är på grund av svag fluorescens utsläpp av L basen i PNA. (D, F) Karlsson d på grundval av tomterna av 2-aminopurine fluorescensintensiteten (på 370 nm) av RNA duplex och ssRNA, respektive kontra PNA P3 koncentration. Siffran är anpassade från referens31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Figur 7 : Thermal smältande resultat för RNA-PNA duplexrum. Inkubation bufferten är 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7,5. Alla prover som innehåller 5 µM enkelsträngat RNA (ssRNA1) och PNA i 130 µL. (A) enkelsträngat RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 och P5) och en hypotetisk PNA-RNA duplex bildas mellan PNA P3 och ssRNA1 i parallella orientering. Sterisk clash är indicerat för Watson-Crick som Q-G och L-G par. (B) smältning kurvor för olika PNAs bindning till ssRNA1. Smälttemperaturer visas för kurvorna med smältande övergångar. Siffran är anpassade från referens31.

Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sekvens-specifika och selektiv erkännande av dubbelsträngat RNA över enkelsträngat RNA av kemiskt modifierade peptid nukleinsyror

Vi rapporterar protokollen för syntesen och rening av peptid nukleinsyra (PNA) oligomerer införliva ändrades rester. De biokemiska och biofysikaliska metoderna för karakterisering av erkännande av RNA duplex av de modifierade PNAs beskrivs.

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Leverans av nukleinsyror genom Embryo mikroinjektion i Worldwide Agricultural Pest Insekt,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugativ Parning Analyser för sekvensspecifik analys av Transfer proteiner involverade i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Uppfödning och dubbelsträngade RNA-medierad Gene Knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Rävänger</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Atomic Force Microscopy Undersökningar av DNA-lesionsigenkänning i Nucleotide Excision Repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metaboliska märkning och profilering av överföring RNAs använder Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Cell baserat analyser av SINEUP icke-kodande RNAs som specifikt kan förbättra mRNA Översättning

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Avgörande 3'-Termini och sekvenser av begynnande enkelsträngat virala DNA-molekyler under HIV-1 omvänd Transkription i infekterade celler

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Överuttryck av långa icke-kodande RNAs med gen-aktiverande CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

In vitro biokemiska analyser med biotin-märkning för att studera interaktioner mellan protein-nukleinsyror

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Hög densitet DNA och RNA mikromatriser-photolithographic syntes, hybridisering och beredning av stora nukleinsyra bibliotek

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...