Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Bu eser Singapur Bakanlığı Eğitim (MOE) Tier 1 (RGT3/13 ve RG42/15-G.C.) ve MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 ve MOE2015-T2-1-028'e G.C.) tarafından desteklenmiştir.

Rapor burada çalışmaları temel bir patent başvurusu (PAT/179/14/15/PCT) şikayetçi oldu.

RNA çift yönlü bağlama PNA reaksiyonlar (örneğin, 10-mers) orta ölçekli moleküllerdir ve böylece elektroforetik hareketlilik shift bağlama üzerine ile karşılaştırılabilir veya biraz daha büyük bir boyut için RNA'ların gösterebilir (örneğin, 50-mer veya daha küçük). Bir RNA PNA önemli ölçüde daha büyük ise, PNA titrasyon RNA içine bir sınırlı jel hareketlilik kayma nedeniyle çalışmayabilir. Böylece, büyük RNA sigara denaturing sayfa deneyleri için kesilebilir. Fluorophore etiketli PNA içine büyük bir RNA'ın titrasyon Tripleks oluşumu bir sigara denaturing özel jel tarafından ortasında jel40yüklü örnek ile izlenmesi için izin verir.
Tarafından sigara denaturing sayfası RNA'ın sürekli bir toplam konsantrasyon ile titrasyon deneme için genellikle 1 µM etiketlenmemiş bir RNA konsantrasyonu verimli sonrası ücretsiz RNA ve Tripleks bantları etidyum bromür tarafından boyama için kullanıyoruz. 0.2 µM düşük bir RNA konsantrasyonu da RNA yapı31bağlı yeterli olabilir. Etiketlenmemiş RNA konsantrasyonu (0.2 µM) belirler doğru ölçülebilir Kd değerler hakkında 0.2 µM veya daha büyük olması gerekir. Diğer boyama boya boyama verimliliği artırmak için kullanılabilir. Alternatif olarak, bizim yayınlanmamış veri boya-RNA'ların etiketli Cy3 sigara denaturing sayfa deneylerde sıkı bağlama olayları ölçmek için kullanılabilir öneririz.
2-aminopurine sadece orta floresan nedeniyle gerçeğini, 2-aminopurine floresan titrasyon da bağlama için Kapat veya 0.2 µM31üstüne Kd değerleri ile ölçülmesi için sınırlıdır. RNA veya PNA bağlama floresan sinyallerini53,54, değişimler sonuçlanırsa solution'ı Floresans titrasyon, bir nispeten sıkı bağlama miktarının için nispeten parlak boya ile etiketli 55.
RNA yapıları dsRNA bağlama PNAs tarafından hedefleme stratejisi RNA'ların sınırlı sayıda için test edilmiştir. Bu farklı ard arda geliş ve baz çifti besteleri ile dsRNAs için bağlama özellikleri değişebilir olasıdır. TFPNAs tasarımı için bir çift yönlü pürin zengini iplikçik birini her zaman. Nasıl üst üste Q· anlamak için önemlidir C-G üç katına bir Tripleks kararlılığını etkileyebilir. Daha geniş sıra bağımlı çalışmalar açıkça TFPNAs sıra bağımlı bağlama özelliklerini anlamak için ihtiyaç vardır.
TFPNAs bağlama benzeşme daha da artan uzunluğu ve/veya daha da üsler ve omurgalarına56,57 TFPNAs değiştirme tarafından gelişmiş olabilir. Ancak, sürekli bir çift yönlü bölge kez 10'dan fazla ardışık baz çifti kesinti olmadan sigara-Watson-Crick yapılar tarafından oluşabilir değil. Bir sigara-Watson-Crick yapıları dsRNA bölgeler için bitişik tanınması için küçük moleküller ile TFPNAs eşlenik. Prensip olarak, bir TFPNA-küçük molekül eşlenik bağlama benzeşme ve özgüllük bir TFPNA ya da küçük molekül yalnız göre gelişmiş bekleniyor. Ancak, konjugasyon58,59,60,61,62,63,64 için bağlayıcı kimyasal ve fiziksel özellikleri optimize edilmiş olması gerekir.
TFPNAs seçmeli olarak dsRNAs için ssRNAs ve dsDNAs bağlayabilirsiniz aslında çok yararlı kimyasal sonda ve RNA yapısal dinamikleri ve etkileşimleri ile düzenlenmesi yoluyla potansiyel terapötik ligandlar olarak TFPNAs geliştirmek mümkün olduğunu göstermektedir proteinler ve metabolitleri. Hücresel TFPNAs alımını hücre Penetran moieties küçük moleküller, peptidler ve nano tanecikleri gibi ile fiil veya lipozomlar5,6 gibi supramolecular yapıları ile complexation üzerinden kolaylaştırılmış olacak ,12,17,25,31,41,65,66. Daha fazla TFPNAs functionalization fluorophores ve radioisotopes gibi bioimaging etiketlerle algılama, görüntüleme ve canlı organizmalar işlevsel RNA yapıların hedefleme kolaylaştırabilir.

RNA'ların önemli biyolojik ve yönetmelikte RNA'lar rolleri keşifler ve kataliz farklı biyolojik süreçlerin1,2,3son gelişmeler nedeniyle tedavi hedefleri olarak ortaya çıkıyor. Geleneksel olarak, antianlamlı lifler ile Watson-Crick çift yönlü oluşumu3,4,5,6,7,8, ssRNAs bağlamak için kullanılmaktadır 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. son zamanlarda, tripleks oluşturmayan peptit nükleik asitler (TFPNAs) dsRNAs (şekil 1)3,28,29Hoogsteen hidrojen üzerinden bağlamak için tasarlanmıştır. dsRNA bölgeler pre-mRNA'ların ve mRNA'ların, ön veya PRI-miRNAs3ve birçok diğer kodlamayan RNA'ların1,26,27de dahil olmak üzere geleneksel Antisens hedefli RNA'lar çoğunda bulunur. DsRNAs TFPNAs kullanarak üçlü sarmal oluşumu ile hedefleme onun yapısı özgüllüğü nedeniyle avantajlı olabilir ve dysregulated hastalıkları, örneğin olan RNA'ların, normal işlevleri geri yükleme kullanmak için büyük potansiyel olduğunu.
Son Yayınlanan İş Rozners vd.ve bize3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, bildirilen çabaları artırma değiştirilmiş TFPNAs dsRNAs gelişmiş benzeşimli doğru seçmeli bağlama. Biz thio-pseudoisocytosine (L) monomer30 ve guanidin-modified 5-metil sitozin (S) monomer31dahil olmak üzere sentez yöntemleri için mantıklı bir şekilde tasarlanmış PNA monomer (Şekil 2) geliştirdik. Çeşitli Biyokimya ve biyofizik karakterizasyon yöntemleri, nispeten kısa PNAs (6-10 artıkları) L ve Q artıkları birleşmeyle Watson-Crick G-C ve C-G baz çifti, geliştirilmiş tanıma sırasıyla, dsRNAs içinde göstermek göstermiştir. Ayrıca, değiştirilmemiş PNAs için karşılaştırıldığında, L ve Q kalıntılar içeren PNAs daha seçici bağlama dsRNA doğru ssRNA ve dsDNA üzerinde göster. Q Base guanidin işlevselliği42 PNAs HeLa hücreleri31girmenizi sağlar.
Bizim laboratuvar PNAs manuel Boc-kimya tarafından sentez (Boc veya t- Boc duruyor tert-butyloxycarbony için (bkz: Şekil 2) katı fazlı peptid sentez yöntemi4. PNA monomer Boc grup korumak emin olarak ile sentezi Boc grup sterically fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Amin grubu, PNA monomer kaplin sırasında yararlı olabilir korumak ile karşılaştırıldığında daha az hantal olduğu gibi uygun sağlam destek. Boc grup asit değişken ve kolayca sağlam destek 20-%50 trifluoroacetic asit (TFA) diklorometan (DCM) tarafından Filistin Ulusal Yönetimi sentezi sırasında kaldırılabilir. Bir otomatik peptid synthesizer PNA reaksiyonlar sentezlemek için istihdam edilebilir; Ancak, PNA monomer 3 5 kat fazla bir otomatik peptid synthesizer için gereklidir. El ile sentezi önemli ölçüde daha az PNA monomer (2-3-kat fazlası), kolayca Kaiser test43tarafından izlenen her MANŞONLA gerektirir. Ayrıca, birçok otomatik synthesizer Boc kaldırma adımı sırasında Boc strateji sentez aşındırıcı TFA kullanımı nedeniyle ile uyumlu değildir.
Moleküler ağırlık karakterizasyonu MALDI-TOF tarafından takip ters fazlı yüksek performanslı sıvı Kromatografi (RP-HPLC) tarafından Filistin Ulusal Yönetimi reaksiyonlar saflaştırılmış (şekil 3 ve 4)30, 31. biz Tripleks oluşumu izlemek için ücretsiz RNA dubleks oluşturur ve Filistin Ulusal Yönetimi bağlı triplexes kez nedeniyle aslında bu farklı geçiş oranları (şekil 5)30,31 göstermek sayfa denaturing istihdam . Verimli boyama sonrası, RNA çift yönlü ve PNA· için de elde edilebilir hiçbir etiketleme gereklidir RNA2 Tripleks bantları. Örnek nispeten az miktarda sigara denaturing sayfa deneyler için gereklidir. Ancak, yükleme (kuluçka) arabelleği ve çalışan arabellekleri (pH 8.3), 8.3 nispeten yüksek pH önemli ölçüde bir Tripleks istikrarsızlaştırmak çünkü kinetically istikrarlı triplexes için sınırlı olmak ölçümler sonucunda aynı olmayabilir.
2-Aminopurine olan bir izomer adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine floresan yoğunluğu (yaklaşık 370 emisyon zirve ile nm) yerel yapısal çevre değişiklikleri duyarlıdır ve Tripleks oluşumu ile 2-aminopurine kalıntı izleme bağlama Makinası (PNA dahil için uygundur Şekil 6) 31. Floresans emisyon görünür aralığında gösteren birçok diğer boyalar farklı olarak, 2-aminopurine-etiketli RNA Oda ışık fotoğraf beyazlatma olmadan maruz kalabilirler. Sayfa deneme içinde çalışan bir tampon pH 8.3 kez gereklidir, aksine 2-aminopurine göre Floresans titrasyon bağlama ölçümü belirtilen bir pH bir çözüm sağlar ve böylece ölçüm ve nispeten zayıf tespiti izin verebilir ve Kinetically kararsız denge bağlama.
UV Absorbans algılanan termal erime deneyler dubleks (Şekil 7)31 ve tri termal istikrarı ölçümü izinPLEX30,32,44,45. Bağlı olarak uzunluğu ve sıra kompozisyon, triplexes erime veya açık bir geçiş gösterilmeyebilir. Isıtma ve soğutma eğrileri üst üste gelirse termodinamik parametreler temin edilebilir. Doğru termodinamik parametreler izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC)32tarafından elde edilebilir; Ancak, nispeten büyük miktarda örnekleri ITC için genellikle gereklidir.

<table style="border-collapse:collapse;width:491pt" width="654">
	<colgroup>
		<col style="width:176pt" width="235" />
		<col style="width:116pt" width="155" />
		<col span="3" style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl25" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl74" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">87956</td>
			<td style="width:66pt" width="88"></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&#376;HCl)</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl68" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">532444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B25251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acetic anhyride</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Kaiser Test Kit&#160;</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L06374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Unmodified PNA monomers</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">ASM Research Chemicals GmbH</td>
			<td class="xl70" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B8389 / 47624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Thioanisole</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoromethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A10173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">LiChrosper&#174; 100 RP-18 endcapped (5 &#181;m) LiChroCART&#174; 250-4</td>
			<td class="xl41">Merck Millipore</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">150838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">RNA Oligos&#160;</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">Customized&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">39468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td class="xl41">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">J15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">HEPES&#160;</td>
			<td class="xl41">Lonza</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N.N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">146072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td>
			<td class="xl41">1st Base</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">BUF-3010-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Glycerol&#160;</td>
			<td class="xl45">Promega&#160;</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">H5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethidium bromide (10 mg/mL)</td>
			<td class="xl45">Bio-rad&#160;</td>
			<td class="xl64" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl48" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td>
			<td class="xl49">Hellma Analytics&#160;</td>
			<td class="xl61" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">105.250-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

RNA'ların önemli biyolojik ve tedavi hedefleri ortaya çıkıyor. Böylece, büyük bir potansiyel kimyasal sonda ve RNA sıralama ve yapı tanınması için tedavi ligandlar geliştirmede olmasıdır. Peptit nükleik asit (reaksiyonlar son zamanlarda geliştirilen RNA dubleks bir fingerprinting şekilde anlayacağı şekilde PNA) kimyasal olarak değiştirilmiş. PNAs kimyasal olarak tarafsız bir peptid gibi omurga ile stabildir. PNAs nispeten kolayca el ile Boc-kimya katı fazlı peptid sentez yöntemi tarafından sentez. PNAs ters fazlı HPLC, matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma-tarafından uçuş süresi (MALDI-TOF) molekül ağırlığı karakterizasyonu tarafından takip tarafından saf. Sigara denaturing polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) tekniği Tripleks oluşumu görüntüleme Haritayı farklı geçiş oranları çünkü dikkatle tasarlanmış ücretsiz RNA çift yönlü oluşturur ve Filistin Ulusal Yönetimi triplexes kez bağlı kolaylaştırır. Etidyum bromür yazı boyama ile sigara denaturing sayfa kez bağlama benzeşim ve Filistin Ulusal Yönetimi reaksiyonlar özelliklerine karakterize bir kolay ve bilgilendirici tekniktir. Genellikle, birden çok RNA saç tokaları veya dubleks tek baz çifti mutasyonlar ile PNA bağlama özellikleri, benzeşim ve özelliklerine bağlama gibi karakterize etmek için kullanılabilir. 2-Aminopurine olan bir izomer adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine floresan yoğunluğu yerel yapısal çevre değişiklikleri duyarlıdır ve Tripleks oluşumu ile yakın PNA bağlama bölgesi dahil 2-aminopurine kalıntı izleme için uygundur. 2-Aminopurine floresan titrasyon hedeflenen çift iplikçikli RNA'ların (dsRNAs) doğru değiştirilmiş PNAs bağlama selectivity üzerinde tek iplikçikli RNA'ların (ssRNAs) onaylamak için de kullanılabilir. PNA-RNA Dubleks ve PNA· termal istikrarı ölçümü UV Absorbans algılanan termal erime deneyler izin RNA2 triplexes. Burada, biz bir sentez tanımlamak ve birleşmeyle PNA reaksiyonlar arıtma artıkları değiştiren ve RNA dubleks değiştirilmiş PNAs tarafından tanınması karakterizasyonu için Biyokimya ve biyofizik yöntemleri açıklanmaktadır.

Ters fazlı HPLC PNA reaksiyonlar arıtma sağlar. Biz saf PNA reaksiyonlar HPLC arıtma (şekil 3) iki tur ile elde edebilirsiniz. PNAs kimliğini MALDI-TOF analiz (şekil 4) tarafından onaylanabilir.
Sigara denaturing sayfa bağlama benzeşim ve Filistin Ulusal Yönetimi reaksiyonlar özelliklerine karakterize için kolay ve bilgilendirici bir tekniktir. Biz genellikle birden fazla RNA saç tokaları veya dubleks tek baz çifti mutasyonlar ile bağlama özellikleri (şekil 5) tanımlamak için kullanın. Şekil 5 ' te gösterilen sigara denaturing sayfa veri açıkça Q - ve L-modified PNA dsRNA bölge C-G çift (şekil 5B, alt paneli) ile tanıyabilir (topşekil 5B, C-G çift olmadan tek değil ama tavsiye ederim paneli). Bu özel ve gelişmiş tanıma T· olduğunu A-U, L· G-C ve Q· C-G PNA· RNA2 temel üçlü (şekil 1A, C, D) oluşumu. Tek veya birden fazla mutasyon ile çeşitli PNAs değiştirilmiş bir Filistin Gelişmiş bağlama özelliklerini göstermek için de kullanılabilir. Biz 2 mM Mg2 + kuluçka arabellekte ekleme bağlama etkilemez göstermiştir önemli ölçüde31.
Hedeflenen dsRNA bölgesi (şekil 6A, 6 C, 6 D) ama değil ssRNA (şekil 6B, 6E, 6F) Q ve L modifiye PNA bağlar 2-aminopurine floresan titrasyon tarafından göstermiştir. PNA P3 0,8 ± 0,1 µM Kd değeri 2 aminopurine etiketli dsRNA bağlar. 370 Floresans yoğunlukta nm 2 aminopurine etiketli ssRNA için PNA P3 bağlama ssRNA için eksikliği gösteren çeşitli P3 konsantrasyon ile nispeten sabit kalır.
PNAs Q artıkları (P2 ve P3) gösteri yok termal geçişler (Şekil 7), ssRNA için hiçbir bağlama düşündüren erime içeren. Bu Q-G çift gibi Watson-Crick mevcut steric çatışma kaynaklanmaktadır. Değiştirilmemiş PNA P1 için karşılaştırıldığında, PNAs P4 ve P5 içeren L artıkları ama hiçbir Q artıkları modifiye, gösteri için karşılık gelen RNA-PNA dubleks L-G çift gibi Watson-Crick mevcut steric çatışma nedeniyle erime sıcaklıkları azalmıştır. UV Absorbans algılanan termal erime veri de Q ve L kalıntılar içeren bir PNA ssRNA için kayda değer bağlanmaz göstermek 2-aminopurine floresan titrasyon veri ile tutarlı (şekil 6B, 6E, 6F). Watson-Crick-gibi L-G çift (şekil 1E göre bir Watson-Crick-gibi Q-G çift (şekil 1F) oluşumunda daha önemli bir steric çatışma bir Q Bankası olduğu gibi bir Q Bankası birleştiren bir L Bankası daha fazla destabilizing ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Resim 1 : Kimyasal yapıları istikrarlı temel üçlü ve kararsız baz çifti yapıların. (A-D) Binbaşı-oluk PNA· RNA2 temel üç katına, T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) ve Q· C-G (D). (E, F) Kararsız Watson-Crick PNA-RNA baz çifti L-G (E) ve Q-G (F) gibi. R harfi RNA şeker-fosfat omurgası temsil eder. Hidrojen bağları siyah Kesikli çizgilerle gösterilir. Rakam tekrar başvuru31oluşturulur. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Resim 2 : PNA monomerleri kimyasal yapılarının. Dört PNA monomer (T, C, L ve Q) gösterilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Şekil 3 : Kimyasal yapısı PNA oligomer ve RP-HPLC tarafından arıtma. (A)P3 PNA sırasının kimyasal yapısı. (B, C) RP-HPLC veri ham PNA P3, (B) ve yeniden saf PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Şekil 4 : Arıtılmış PNA P3 MALDI-TOF spektrum. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Şekil 5 : RNA saç tokası ve Filistin Ulusal Yönetimi dizileri ve bağlama karakterizasyonu tarafından sayfası olmayan denaturing. (A) RNA tokalar (rHP1 ve rHP2), PNA P3 ve bir PNA· RNA2 Tripleks PNA P3 ve rHP2 arasında kurdu. (B) sayfa (% 12) sigara denaturing rHP1 ve Filistin Ulusal Yönetimi P3 rHP2 bağlama için sonuçlar. Kuluçka arabellek 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5 olur. Yüklenen RNA tokalar (rHP1 ve rHP2) 20 µL 1 µM altındadır. PNA konsantrasyonları Lanes soldan sağa vardır 0, 0,2, 0,4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, ve 50 µM. PNA P3 değil bağlamak için rHP1 (üst panel) ama rHP2 için bağlar (alt paneli). (C) Kd belirlenmesi P3 bağlama için rHP2 için. Tripleks oluşumu (Y) kısmını PNA konsantrasyon karşı çizildi. Başvuru31adapte bir rakamdır. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Şekil 6 : Floresan titrasyon çalışma PNA P3 bağlamaRNA'ların 2 aminopurine etiketli için. 2-aminopurine kalıntı RNA dizisi '2' olarak belirlenmiştir. Kuluçka arabellek 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5 olur. (A) bir PNA· RNA2 Tripleks P3 ve 2 aminopurine etiketli dsRNA (dsRNA2-2AP) arasında kurdu. (B) A varsayımsal PNA-RNA dubleks P3 ve 2 aminopurine etiketli ssRNA (ssRNA2-2AP) arasında kurdu. (C, E) Floresans emisyon spectra RNA çift yönlü (1 µM) 2 aminopurine etiketli ve ssRNA (1 µM), sırasıyla, P3 konsantrasyon pH 7.5 ile çeşitli. Yaklaşık 475 zirvesinde nm olduğunu L Bankası PNA'zayıf Floresans emisyon nedeniyle. (D, F) K d belirlenmesi dayanarak 2-aminopurine floresan yoğunluğu araziler üzerinde (, 370 nm) RNA Dubleks ve ssRNA, sırasıyla, PNA P3 konsantrasyon karşı. Başvuru31adapte bir rakamdır. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Şekil 7 : RNA-PNA dubleks için sonuçlar erime termal. Kuluçka arabellek 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7.5 olur. Tüm örneklerini tek iplikçikli RNA (ssRNA1) ve Filistin Ulusal Yönetimi 130 µL.(a)tek iplikçikli RNA (ssRNA1) içinde PNAs (P1, P2, P3, P4 ve P5) ve Filistin Ulusal Yönetimi P3 ve ssRNA1 paralel yönde arasında oluşturulmuş bir varsayımsal PNA-RNA dubleks 5 mikron içerir. Steric çatışma Watson-Crick Q-G ve M-G çift gibi için endikedir. (B) erime Eğriler için farklı PNAs ssRNA1 için bağlama. Erime sıcaklıkları geçişler erime ile Eğriler için gösterilir. Başvuru31adapte bir rakamdır.

Watch this Scientific Journal Video about Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids at JoVE.com

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

Biz iletişim kuralları için bir sentez raporu ve peptit nükleik asit (PNA) reaksiyonlar birleşmeyle arıtma artıkları değiştirilebilir. RNA dubleks değiştirilmiş PNAs tarafından tanınması karakterizasyonu için Biyokimya ve biyofizik yöntemleri açıklanmıştır.

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Nükleotid Eksizyon Onarımında DNA Lezyon Tanınması için Atomik Kuvvet Mikroskopi Araştırmaları

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Metabolik etiketleme ve Transfer RNA Macroarrays kullanarak profil oluşturma

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Özellikle mRNA çeviri geliştirebilirsiniz RNA'ların kodlamayan SINEUP deneyleri bağlı hücre

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Ters transkripsiyon enfekte hücreleri içinde belirleyici 3'-Termini ve HIV-1 sırasında doğmakta olan tek iplikçikli Viral DNA moleküllerinin dizileri

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Gene aktive CRISPR kullanarak uzun kodlamayan RNA'ların overexpressing

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-Nüklik asit etkileşimlerini Incelemek için biotin etiketlerini kullanarak In vitro biyokimyasal asder

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Yüksek Yoğunluklu DNA ve RNA mikrodizileri - Fotolitografik Sentez, Hibridizasyon ve Büyük Nükleik Asit Kütüphanelerinin Hazırlanması

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...