Name: afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell
Uploaded: 2017-11-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

Nous remercions Amayra Hernández-Vega et Philippe-Alexandre Pouille pour avoir participé à la mise en place de la base de ces protocoles. Nous remercions également la plate-forme d’imagerie moléculaire du IBMB-PCB, Xavier Esteban et de membres du laboratoire pour un soutien continu. Le programme de groupes consolidés de la Generalitat de Catalunya et la DGI et la Consolider subventions accordées par le ministère de l’économie et la compétitivité de l’Espagne à l’EMB et DN a soutenu ce travail.

Toutes les étapes du protocole décrits ci-dessous suivent les directives de protection des animaux de nos institutions.
1. Culture de poisson-zèbre
<ol><li>Reproduire et maintenir le poisson-zèbre adulte dans des conditions normales. Remarque : Les embryons de type sauvage AB et TL ont été utilisés pour cette étude.</li>
	<li>Collecte des embryons et cultivez-les à 28,5 ° C à l’E3 embryon moyenne24. Leur stade selon morphologie comme décrit précéde...

<ol>
	<li>Hernandez-Vega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cortical+tension+drives+zebrafish+epiboly+movements.">Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements.</a> EMBO J. 36, 25-41 (2017).</li><li>Brodland, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+force+microscopy+reveals+the+mechanics+of+ventral+furrow+invagination+in+Drosophila.">Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).</li><li>Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+up+is+stressful:+biophysical+laws+of+morphogenesis.">Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+forces+govern+germ-layer+organization+in+zebrafish.">Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish.</a> Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).</li><li>Koser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+is+critical+for+axon+growth+in+the+developing+brain.">Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain.</a> Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+of+living+cells:+principles+and+applications.">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>de Pablo, P. J., Carri&#243;n-V&#225;zquez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Biological+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy.">Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).</li><li>Roca-Cusachs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+passive+and+adhesion-activated+neutrophils+probed+by+atomic+force+microscopy.">Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).</li><li>Evans, E., Yeung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+viscosity+and+cortical+tension+of+blood+granulocytes+determined+by+micropipet+aspiration.">Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration.</a> Biophys J. 56, 151-160 (1989).</li><li>Fabry, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+scale+and+other+invariants+of+integrative+mechanical+behavior+in+living+cells.">Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).</li><li>Kashef, J., Franz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+methods+for+analyzing+cell-cell+adhesion+in+development.">Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development.</a> Dev Biol. 401, 165-174 (2015).</li><li>Chevalier, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+micromechanical+properties+of+embryonic+tissues.">Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues.</a> Methods. 94, 120-128 (2016).</li><li>Reichlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+native+coronary+artery+endothelium+in+situ+and+in+cell+culture+by+scanning+force+microscopy.">Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy.</a> J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).</li><li>Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+osteon+and+trabecular+bone+measured+by+nanoindentation.">Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation.</a> J Biomech. 31, 21 (1998).</li><li>Grant, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+characterisation+and+biomechanical+analysis+of+the+sclera+by+atomic+force+microscopy.">Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy.</a> J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).</li><li>Efremov, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+living+and+fixed+Xenopus+laevis+embryos.">Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos.</a> Micron. 42, 840-852 (2011).</li><li>Henkels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Mechanical+Variation+Reveals+Critical+Role+for+Rho+Kinase+During+Primitive+Streak+Morphogenesis.">Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis.</a> Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).</li><li>Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+in+zebrafish+--+all+just+about+adhesion?.">Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion?.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+gastrulation:+cell+movements,+signals,+and+mechanisms.">Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms.</a> Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).</li><li>Campinho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension-oriented+cell+divisions+limit+anisotropic+tissue+tension+in+epithelial+spreading+during+zebrafish+epiboly.">Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly.</a> Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).</li><li>Fischer-Friedrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+surface+tension+and+internal+pressure+generated+by+single+mitotic+cells.">Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells.</a> Sci Rep. 4, 6213 (2014).</li><li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics:+principles,+practices,+and+prospects.">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+of+human+lung+epithelial+cells+measured+by+atomic+force+microscopy.">Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).</li><li>Jorba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Micromechanical+Properties+of+the+Extracellular+Matrix+of+Soft+Tissues+by+Atomic+Force+Microscopy.">Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy.</a> J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).</li><li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+atomic-force+microscope+tips.">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).</li><li>Lomakina, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+and+measurement+of+neutrophil+indentation.">Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation.</a> Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).</li><li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+Microrheological+Measurements+of+Soft+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy+for+the+Hydrodynamic+Drag+on+the+Cantilever.">Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever.</a> Langmuir. 18, 716-721 (2002).</li><li>Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+single-cell+micromechanics+in+vivo:+the+microrheology+of+C.+elegans+developing+embryos.">Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos.</a> Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).</li><li>Kalwarczyk, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viscosity+of+complex+liquids+and+cytoplasm+of+mammalian+cells+at+the+nanoscale.">Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale.</a> Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).</li><li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+oscillations.+A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation.">Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, 222-225 (2014).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation.">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508, 392-396 (2014).</li><li>Johansen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+micromanipulation+of+nanoparticles+and+cells+inside+living+zebrafish.">Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish.</a> Nat Commun. 7, 10974 (2016).</li></ol>

Ici, nous montrons que les propriétés du matériau et certains paramètres biomécaniques de la cellule de jaune de œuf de poisson-zèbre durant l’épibolie peuvent être facilement estimées par l’AFM et nanoparticules microrhéologie.
Alors que l’AFM a été employé pour récupérer des caractéristiques rhéologiques des cellules et des tissus dans des conditions physiologiques4,5,25...

Les principes physiques qui sous-tendent le contrôle biomécanique des processus morphogénétiques sont en grande partie non définies. Alors que des études biomécaniques au niveau moléculaire et cellulaire sont rassemblent élan considérable, l’exploration des paramètres biomécaniques au niveau tissulaire/organisme est à ses balbutiements. Hydrodynamiques régression1 ou vidéo microscopie de Force2 permettent aux chercheurs de distinguer les forces actives et passives, tandis que de microchirurgie laser3, ou la moins intrusive microscopie à force atomique (AFM) de cellules dissociées4 ou en vivo 5 ou nanoparticules microrhéologie6 permettre l’anticipation d’un tissu propriétés mécaniques et les réponses.
AFM est une technique topographique en trois dimensions avec une haute résolution atomique résoudre la rugosité et la conformité de la déviation de conseils en porte-à-faux lors du contact avec une surface sondé7. Différentes méthodes employant l’AFM ont été développés pour étudier les propriétés de surface, y compris mesure de frottement, adhérence des forces et des propriétés viscoélastiques des matériaux diversifiés. Récemment, l’AFM a émergé comme un outil puissant pour récupérer des informations sur les propriétés mécaniques des échantillons biologiques. En particulier, AFM peut extraire non invasive le module de cisaillement complexe de cellules individuelles en appliquant des indentations oscillatoires avec un embout micro attaché au bras de levier du connu flexion constante8. Cela nous permet de déduire les forces qui en résultent. Pourtant, l’AFM n’est pas unique et différentes méthodologies permettent d’extraire des données rhéologiques et mécaniques de cellules individuelles (p. ex., Micropipette aspiration9, magnétique torsion cytometry (MTC)10ou uniaxiales traction essai11).
Pourtant, l’application de ces nouvelles méthodes aux processus morphogénétiques complexes n’est pas simple. Les principaux défis rencontrés lors de la détermination des propriétés mécaniques des tissus embryonnaires sont les petits (µm à mm), doux (dans les 102 - 104 Pa rang) et la nature visco-élastique (donnant lieu à des phénomènes dépendant du temps) de la matière12. Il est donc important d’adapter les méthodes employées pour la détermination des propriétés mécaniques (rigidité, viscosité, adhérence) pour le cas spécifique des embryons et des organismes en développement. Deux questions importantes doivent être pris en considération lors de l’analyse rhéologiques approches pour étudier le développement : pour éviter toute interférence intrusive et de fournir un accès facile. Dans ce scénario, aspiration de micropipette, MTC et essai de traction présentent des limites. Dans le premier cas, la déformation importante qui souffre d’une cellule susceptible de modifier ses propriétés physiologiques et mécaniques9. Dans le second cas, la nécessité d’adhérer fermement le tissu expérimental à un substrat pour s’assurer que les contraintes appliquées déforment le cytosquelette localement pourrait également introduire des effets sur l’état d’activation des cellules et, par conséquent, dans leurs caractéristiques mécaniques10 . Dernières approches traction uniaxiales sont limitées par la géométrie de développer des organismes et accessibilité11.
AFM semble mieux convenir pour l’étude des processus de développement car elle permet l’étude d’échantillons biologiques directement dans leur milieu naturel sans aucune préparation de l’échantillon encombrant. En outre, dissociation des tissus embryonnaires est généralement difficile, la taille réduite des sondes AFM fournit un haut degré de polyvalence sans limitation dans le choix du type de milieu (aqueuse ou non aqueuses), température de l’échantillon ou chimique composition de l’échantillon. AFM est suffisamment polyvalent pour être appliquée à vastes domaines et d’échelles de temps et a été employé pour récupérer les propriétés des matériaux des tissus dans des conditions physiologiques ou stades distincts. Les tissus ensemble natifs comme artères13 ou OS14 ont été étudiées d’un point de vue topographique et dans certains cas, comme la sclère, propriétés mécaniques ont également été consulté le15. Topographie a également été explorée dans les embryons vivants permettant la visualisation, par exemple, cellule du réarrangement d’au cours de la morphogenèse in Xenopus16. Protocoles de préparation témoin dernier, Global ont été développés afin de déterminer les paramètres mécaniques au cours de différents processus de développement. Cartes de nanoindentation ont été générées sur des sections de tissu non fixées natif pour le poussin embryonnaire tube digestif11; propriétés adhésives et mécaniques Récupérée pour individuels ectoderme, mésoderme et endoderme progéniteurs isolés des embryons de poisson-zèbre gastrulating4; mesures de rigidité effectuées pour l’épiblaste et de la ligne primitive sur des explants d’embryons aviaires17; et une nette tendance de dégradés de rigidité définis directement dans le cerveau embryonnaire de Xenopus5.
Un saut qualitatif important d’application AFM pour explorer le développement embryonnaire peut-être provenir de l’approche simples processus morphogénétiques accessibles. Poisson zèbre épibolie est un événement essentiel et conservé, dans lequel les différents tissus coordonnent dans un espace restreint et sphérique de diriger l’expansion de la blastoderme en quelques heures. Dès l’apparition du poisson-zèbre épibolie (stade sphérique), une couche superficielle de cellules, la couche enveloppante (EVL), couvre un plafond semi-sphérique de blastomères centrée sur le pôle animal de l’embryon, assis sur une cellule syncytial massif jaune d’oeuf. Épibolie consiste en l’expansion corticale ward végétal de l’EVL, les cellules profondes (DCs) du blastoderme et la couche externe de la cellule de jaune de œuf syncytial (E-YSL) autour du jaune. Épibolie se termine par la fermeture de l’EVL et les contrôleurs de domaine à la pole vegetal18,19,20. Comment et où les forces sont générés durant l’épibolie et comment ils sont couplés à l’échelle mondiale ne sont pas encore clair1,21.
Ici, nous décrivons en détail comment appliquer AFM pour inférer les propriétés tissu mécanique passive au cours de la progression dans le poisson-zèbre jaune épibolie cellulaire in vivo. Pour ce faire, nous avons utilisé des microsphères petits attachés à encorbellements AFM comme sondes. Ceci permet la récupération d’informations locales précises au sein de la surface des cellules non uniforme jaune de œuf et d’étudier les gradients de tension et leur dynamique au fil du temps. AFM alternative approches telles que celles à l’aide de cale encorbellements22, sera rendu pas aux données locales qui sont assez précises. La technique du coin, qui exige des compétences de manipulation très prudent pour coller une cale plus grande que la taille de l’échantillon à l’extrémité du levier, n’est pas bien adaptée pour sonder l’embryon (~ 2 fois plus grande que la longueur du levier) mécanique.
Modélisation et à caractériser les propriétés viscoélastiques des cellules de façon qualitative et quantitative permet une meilleure compréhension de leur biomécanique. D’un point de vue biomécanique, il est essentiel de comprendre l’épibolie et pas seulement demande connaissance des mesures de tension corticale et dynamiques, qui peuvent être extraites par l’AFM ; ainsi, il y a besoin d’informations sur les propriétés biophysiques du tissu. Pour extraire ces informations, une variété de cellule rhéologie techniques ont été développés au cours des années afin de caractériser les différents types de cellules sous différentes conditions physiologiques23. Citons, entre autres, AFM, MTC et pinces optiques (OT). Ces méthodes, cependant, ont fait leurs preuves insuffisantes pour mésoscopique des analyses à l’échelle d’embryons ou d’organes. Comme alternative, nous avons adapté avec succès les suivi des nanoparticules microrhéologie6 pour in vivo des mesures rhéologiques. Cette technique analyse les déplacements browniens des particules individuelles et déduit les propriétés locales micromécaniques.
Ensemble microrhéologie AFM et nanoparticules permettent la définition de dynamique corticale des ligatures et des propriétés mécaniques internes du jaune durant l’épibolie. Cette information souscrit pleinement à un modèle dans lequel les contraintes anisotropes se développe en raison des différences dans la réponse de déformation de l’EVL et la couche cytoplasmique de jaune d’oeuf (YCL) à la contraction de l’actomyosine isotrope du cortex E-YSL est essentielle pour le mouvement directionnel net de l’EVL et épibolie progression1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td>Visualization of the sample and AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope (AFM)</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>-</td>
			<td>Any commercialized AFM could be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM780</td>
			<td>Nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8016.00</td>
			<td>Casting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure LMP Agarose (low melting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>Securing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Z-MOLDS</td>
			<td>Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si3N4 cantilever</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PT.GS</td>
			<td>Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 &#181;m diameter and k=0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>FluoSpheres F8811,</td>
			<td>For tracking nanorheology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate capillary glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G100TF-4</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td>Manipulating the micropipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FemtoJet Express</td>
			<td>Controlling injection time and pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the embryos during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>Analyzing AFM and particle tracking data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>AB and TL wild type</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting embryos for nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>FST</td>
			<td>29025-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell

Élucider les facteurs qui orientent l’organisation spatio-temporelle de l’évolution des tissus est l’un des buts principaux de l’étude du développement. Diverses propositions prétendent avoir été importantes contributions à la compréhension des propriétés mécaniques des cellules et des tissus dans leur organisation spatio-temporelle dans différents processus morphogénétiques et de développement. Toutefois, en raison du manque d’outils fiables et accessibles pour mesurer les propriétés des matériaux et des paramètres ligatures en vivo, valider ces hypothèses a été difficile. Nous présentons ici des méthodes utilisant la microscopie à force atomique (AFM) et suivi dans le but de quantifier les propriétés mécaniques de la cellule de jaune de œuf embryon intact zebrafish durant l’épibolie de particules. Épibolie est un processus de développement précoce conservé dont l’étude est facilitée par la transparence de l’embryon. Ces méthodes sont simples à mettre en œuvre, fiable et largement applicable puisqu’ils surmontent des interventions intrusives qui pourraient influer sur la mécanique des tissus. Une stratégie simple a été appliquée pour le montage d’échantillons, l’enregistrement de l’AFM et des injections de nanoparticules et de suivi. Cette approche rend ces méthodes facilement adaptable à d’autres fois du développement ou les organismes.

Mesures de tension corticale Pour chaque point de mesure, cinq courbes de force-déplacement (F-z) ont été acquises par l’AFM par la montée en puissance du cantilever à 1 Hz avec une amplitude crête-à-crête de 5 µm (vitesse = 10 µm/s) jusqu'à une échancrure maximale d’environ 2 µm. Cette procédure prend moins de 20 min et n’était pas affectée par la progression de l’épibolie. Chaque condition expérimentale a été testée au moins 5 embryons.</...

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AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM et microrhéologie dans la cellule de jaune de œuf embryon de poisson zèbre

Le manque d’outils pour mesurer les propriétés des matériaux et des paramètres ligatures en vivo empêche de valider leurs rôles au cours du développement. Nous avons utilisé la microscopie à force atomique (AFM) et suivi des nanoparticules pour quantifier les caractéristiques mécaniques sur la cellule de jaune de œuf embryon intact zebrafish durant l’épibolie. Ces méthodes sont fiables et largement applicable en évitant des interventions intrusives.

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead implantation dans l&#39;embryon de poisson zèbre

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Recherche

Biologie du développement

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Suivi des cellules dans le poisson zèbre transgénique de la GFP-Utilisation du système photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Primaire endodermique des cellules épithéliales de la Culture Yolk Sac Membrane de japonais Quail Embryons

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Observer Division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identification des progéniteurs érythromyélidiens et de leur descendance dans l&#39;embryon de souris par cytométrie de flux

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Utilisation d’immunomarquage pour analyser des Microtubules stables et dynamiques naissants dans l’embryon de poisson zèbre

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Mouvements de tissu endocardique suivant via Photoconversion de cellules dans l’embryon de poisson zèbre

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Transfert d’embryon et vitrification d’embryons au stade optimal de l’embryon dans le modèle Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...