Name: afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell
Uploaded: 2017-11-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

אנו מודים Amayra הרננדז-וגה, פיליפ-אלכסנדר Pouille על השתתפות בהקמת על בסיס פרוטוקולים אלה. אנו מודים גם פלטפורמת הדמיה מולקולרית IBMB-PCB, אסטבן אקסבייר, חברי המעבדה תמיכה שוטפת. התוכנית קבוצות מאוחדות של Generalitat דה קטלוניה, DGI, מענקים Consolider משרד הכלכלה ואת Competitivity של ספרד ועד EMB DN תמיכה עבודה זו.

כל השלבים פרוטוקול המתואר להלן בצע את ההנחיות טיפול בבעלי חיים המוסדות שלנו.
1. דג זברה תרבות
<ol><li>להתרבות ולשמור על דג זברה בוגרת בתנאים רגילים. הערה: עוברי פראי סוג AB ו TL שימשו למחקר זה.</li>
	<li>לאסוף את העוברים, לגדל אותם ב 28.5 ° C ב- E3 העובר בינונית24. שלב אותם על פי...

<ol>
	<li>Hernandez-Vega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cortical+tension+drives+zebrafish+epiboly+movements.">Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements.</a> EMBO J. 36, 25-41 (2017).</li><li>Brodland, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+force+microscopy+reveals+the+mechanics+of+ventral+furrow+invagination+in+Drosophila.">Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).</li><li>Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+up+is+stressful:+biophysical+laws+of+morphogenesis.">Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+forces+govern+germ-layer+organization+in+zebrafish.">Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish.</a> Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).</li><li>Koser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+is+critical+for+axon+growth+in+the+developing+brain.">Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain.</a> Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+of+living+cells:+principles+and+applications.">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>de Pablo, P. J., Carri&#243;n-V&#225;zquez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Biological+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy.">Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).</li><li>Roca-Cusachs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+passive+and+adhesion-activated+neutrophils+probed+by+atomic+force+microscopy.">Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).</li><li>Evans, E., Yeung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+viscosity+and+cortical+tension+of+blood+granulocytes+determined+by+micropipet+aspiration.">Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration.</a> Biophys J. 56, 151-160 (1989).</li><li>Fabry, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+scale+and+other+invariants+of+integrative+mechanical+behavior+in+living+cells.">Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).</li><li>Kashef, J., Franz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+methods+for+analyzing+cell-cell+adhesion+in+development.">Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development.</a> Dev Biol. 401, 165-174 (2015).</li><li>Chevalier, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+micromechanical+properties+of+embryonic+tissues.">Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues.</a> Methods. 94, 120-128 (2016).</li><li>Reichlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+native+coronary+artery+endothelium+in+situ+and+in+cell+culture+by+scanning+force+microscopy.">Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy.</a> J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).</li><li>Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+osteon+and+trabecular+bone+measured+by+nanoindentation.">Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation.</a> J Biomech. 31, 21 (1998).</li><li>Grant, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+characterisation+and+biomechanical+analysis+of+the+sclera+by+atomic+force+microscopy.">Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy.</a> J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).</li><li>Efremov, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+living+and+fixed+Xenopus+laevis+embryos.">Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos.</a> Micron. 42, 840-852 (2011).</li><li>Henkels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Mechanical+Variation+Reveals+Critical+Role+for+Rho+Kinase+During+Primitive+Streak+Morphogenesis.">Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis.</a> Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).</li><li>Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+in+zebrafish+--+all+just+about+adhesion?.">Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion?.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+gastrulation:+cell+movements,+signals,+and+mechanisms.">Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms.</a> Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).</li><li>Campinho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension-oriented+cell+divisions+limit+anisotropic+tissue+tension+in+epithelial+spreading+during+zebrafish+epiboly.">Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly.</a> Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).</li><li>Fischer-Friedrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+surface+tension+and+internal+pressure+generated+by+single+mitotic+cells.">Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells.</a> Sci Rep. 4, 6213 (2014).</li><li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics:+principles,+practices,+and+prospects.">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+of+human+lung+epithelial+cells+measured+by+atomic+force+microscopy.">Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).</li><li>Jorba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Micromechanical+Properties+of+the+Extracellular+Matrix+of+Soft+Tissues+by+Atomic+Force+Microscopy.">Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy.</a> J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).</li><li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+atomic-force+microscope+tips.">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).</li><li>Lomakina, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+and+measurement+of+neutrophil+indentation.">Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation.</a> Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).</li><li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+Microrheological+Measurements+of+Soft+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy+for+the+Hydrodynamic+Drag+on+the+Cantilever.">Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever.</a> Langmuir. 18, 716-721 (2002).</li><li>Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+single-cell+micromechanics+in+vivo:+the+microrheology+of+C.+elegans+developing+embryos.">Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos.</a> Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).</li><li>Kalwarczyk, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viscosity+of+complex+liquids+and+cytoplasm+of+mammalian+cells+at+the+nanoscale.">Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale.</a> Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).</li><li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+oscillations.+A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation.">Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, 222-225 (2014).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation.">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508, 392-396 (2014).</li><li>Johansen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+micromanipulation+of+nanoparticles+and+cells+inside+living+zebrafish.">Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish.</a> Nat Commun. 7, 10974 (2016).</li></ol>

הנה אנחנו מראים כי את תכונות החומר מספר פרמטרים ביו-מכני של התא חלמון דג זברה במהלך epiboly יכול להיות בקלות מוערך על ידי AFM ו חלקיקים microrheology.
בעוד AFM ננקטה כדי לאחזר rheological תכונות של תאים ורקמות בתנאים פיזיולוגיים4,5,25,<sup cl...

העקרונות הפיזיים הפקד ביו-מכני של תהליכים morphogenetic אינם מוגדרים במידה רבה. בעוד מחקרים ביו-מכני ברמה המולקולרית, התאית הן צוברת תאוצה ניכר, חקר biomechanical פרמטרים ברמת רקמות/אורגניזם הוא למאכלים. רגרסיה hydrodynamic1 או מיקרוסקופ כוח וידאו2 מאפשרים להבחין בין כוחות פעיל וסביל, תוך תיאום לייזר3או מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) פחות פולשנית של תאים הפומבית4 או אין ויוו microrheology 5 או ננו-חלקיק6 לאפשר הציפייה של תכונות מכניות ותגובות של רקמה.
AFM היא טכניקה סימון שבילים תלת מימדי עם רזולוציה גבוהה אטומי לפתרון חספוס פני השטח ותאימות מ סטיה של זיז טיפים לאחר יצירת קשר עם משטח הנייר7. מתודולוגיות שונות העסקת AFM פותחו כדי לחקור את מאפייני משטח, כולל מדידת חיכוך, כוחות אדהזיה ומאפיינים viscoelastic של חומרים מגוונים. לאחרונה, AFM התפתחה כלי רב עוצמה כדי לאחזר מידע על תכונות מכניות של דגימות ביולוגיות. בפרט, AFM יכול לא פולשני לחלץ מודולוס גזירה מורכב של תאים בודדים על-ידי החלת הכניסות מתנדנדות עם טיפ מיקרו קשורה על זיז ידוע קבוע כיפוף8. פעולה זו מאפשרת לנו להסיק הכוחות שנוצר. ובכל זאת, AFM אינה ייחודית, מתודולוגיות שונות לאפשר חילוץ נתונים rheological ואת תכונות מכניות תאים בודדים (למשל, Micropipette השאיפה9, מגנטי פיתול cytometry (MTC)10, או uniaxial מתיחה בדיקה11).
ובכל זאת, היישום של מתודולוגיות הרומן אלה תהליכים מורכבים morphogenetic אינה פשוטה. אתגרי העיקריים בקביעת התכונות המכאניות של רקמות עובריים הם הקטנים (מיקרומטר מ"מ), רכה (ב 102 - 104 הרשות הפלסטינית טווח) והטבע ויסקו-אלסטית (והוליד תלויי-זמן התופעות) גשמי12. לכן חשוב להתאים את השיטות לקביעת תכונות מכניות (נוקשות, צמיגות, אדהזיה) למקרה הספציפי של עוברי ואורגניזמים המתפתח. שני נושאים חשובים שצריך לקחת בחשבון בעת ניתוח הגישות rheological ללמוד פיתוח: כדי למנוע הפרעה פולשניות וכדי לספק נגישות קלה. בתרחיש זה, השאיפה micropipette MTC, בדיקות התערוכה מגבלות. במקרה הראשון, להרכב גבוהה תא סובלת עלולה לשנות מאפיינים פיזיולוגיים ומכניים שלה9. במקרה השני, הצורך לדבוק בחוזקה רקמות ניסיוני מצע כדי להבטיח כי הלחצים חלה לעוות את שלד התא באופן מקומי יכול גם להציג אפקטים על מצב הפעלה התאים ומכאן שלהם תכונות מכניות10 . גישות מתיחה האחרון, uniaxial מוגבלים על ידי הצורה הגיאומטרית של פיתוח אורגניזמים נגישות11.
AFM נראה להיות מתאים יותר עבור חקר תהליכים פיתוחיים שכן היא מאפשרת המחקר של דגימות ביולוגיות ישירות בתוך הסביבה הטבעית שלהם ללא כל הכנה מדגם מסורבלת. יתר על כן, כפי דיסוציאציה של רקמות עובריים הוא בדרך כלל קשה, בגודל מופחת של AFM הגששים מספק רמה גבוהה של רב-תכליתיות ללא מגבלה בבחירת סוג בינוני (מימית או הלא-מימית), לדוגמה טמפרטורה או כימית ההרכב של המדגם. מיקרוסקופ כוח אטומי מספיק גמישים כדי להחיל על תחומים גדול וזמן קשקשים, ננקטה כדי לאחזר תכונות החומר של רקמות שלבים התפתחותיים או בתנאים פיזיולוגיים. כל ילידי רקמות כגון העורקים13 או עצמות14 נחקרו מנקודת מבט הטופוגרפי, במקרים מסוימים, כמו בסקלרה, תכונות מכניות היו גם שאוחזרו15. הטופוגרפיה יש נחקרו גם בחיים עוברי המאפשר את החזיית, למשל, תא שחלוף במהלך מורפוגנזה צפרדע רפואית16. הדוגמה האחרונה, מקיף הכנת פרוטוקולים פותחו כדי לקבוע פרמטרים מכני במהלך תהליכים התפתחותיים שונים. מפות Nanoindentation נוצרו על רקמות מבולבל יליד מקטעים עבור מערכת העיכול עובריים צ'יק11; דבק ועל מכניים מאפיינים המאוחזרים עבור הפרט האאקטודרם, והמזודרם והאנדודרם ובתאים מבודדים מן העוברים gastrulating דג זברה4; נוקשות מדידות שבוצעו על epiblast ועל רצף פרימיטיביים על explants של העוברים העופות17; . ואת דפוס ברור של נוקשות מעברי צבע מוגדרים ישירות המוח העוברי של צפרדע רפואית5
קפיצה איכותית משמעותית להחלת AFM לחקר התפתחות שעשוי להגיע מתקרב פשוט תהליכים morphogenetic נגיש. Epiboly דג זברה היא אירוע שנשמרת וחיוני, שבו ברקמות שונות לתאם בחלל כדורית מוגבלת כדי לכוון את התרחבות blastoderm בעוד כמה שעות. מיד עם תחילת epiboly דג זברה (שלב כדורית), שכבה שטחית של תאים, השכבה עוטף (EVL), מכסה חצי כיפה של blastomeres שבמרכזה הקוטב חיה של העובר יושב על תא syncytial חלמון מסיבית. Epiboly מורכב הרחבת קורטיקלית וורד פוליאותן EVL, התאים עמוק (Dc) את blastoderm, ואת השכבה החיצונית של התא syncytial חלמון (E-ליפשיץ) סביב החלמון. Epiboly מסתיים עם סגירת EVL את ו- Dc-19,18,20vegetal הקוטב. כיצד והיכן כוחות נוצרות במהלך epiboly, איך הם מצמידים באופן גלובלי אינו עדיין ברור1,21.
כאן נתאר בפירוט כיצד להחיל AFM להסיק רקמות מכני פסיבי מאפיינים במהלך התקדמות epiboly החלמון דג זברה תא ויוו. כדי לעשות זאת, אנחנו מועסקים microspheres קטן המוצמד cantilevers AFM כפי רגשים. דבר זה מאפשר דליית מידע מקומי מדויקת בתוך השטח תא החלמון לא אחידה, ללמוד מעברי צבע tensional ואת הדינמיקה שלהם לאורך זמן. AFM חלופי גישות כגון אלה באמצעות טריז cantilevers22, יהיה לא רינדור מקומית נתונים מדויק מספיק. הטכניקה טריז, הדורש מיומנויות מניפולציה מאוד זהירים כדי להדביק טריז גדול יותר מאשר גודל המדגם בסוף שלוחה, אינה מתאימה עבור בודק את העובר (~ קיפול כפול גדול יותר מהאורך הזיז) מכניקה.
מידול ואפיון המאפיינים viscoelastic של תאים בדרכים כמותיים מאפשר הבנה משופרת הביומכניקה שלהם. מנקודת מבט ביו-מכני, זה חיוני כדי להבין epiboly, לא רק דרישה ידע על מדידות מתח קורטיקלית, דינמיקה, אשר ניתן לחילוץ על AFM; לכן יש צורך מידע על מאפיינים ביופיזיקלי של הרקמה. כדי לחלץ את המידע הזה, במגוון טכניקות rheology תא פותחו עם השנים על מנת לאפיין את סוגי תאים שונים תחת מצבים פיזיולוגיים שונים23. הם כוללים AFM MTC, פינצטה אופטית (OT). שיטות אלו, עם זאת, הוכחו לא מתאימות עבור ניתוחים mesoscopic את המשקל של העוברים או איברים. כחלופה, אנו הסתגלו בהצלחה ננו-חלקיק-מעקב microrheology6 ויוו rheological מעבדתיים. טכניקה זו מנתח את displacements בראונית של חלקיקים בודדים או יסיק מאפיינים מקומיים micromechanical.
Microrheology AFM ו ננו-חלקיק יחד מאפשרים את ההגדרה של דינמיקה tensional קורטיקלית פנימי תכונות מכניות של החלמון במהלך epiboly. מידע זה באופן מלא מאשרת מודל שבו הלחץ אניסוטרופי מפתחת בשל הבדלי התגובה דפורמציה של EVL, החלמון Cytoplasmic שכבה (YCL) כדי התכווצות איזוטרופיות actomyosin של קליפת E-ליפשיץ, זה חיוני התנועה נטו כיוונית EVL ו epiboly התקדמות1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td>Visualization of the sample and AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope (AFM)</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>-</td>
			<td>Any commercialized AFM could be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM780</td>
			<td>Nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8016.00</td>
			<td>Casting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure LMP Agarose (low melting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>Securing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Z-MOLDS</td>
			<td>Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si3N4 cantilever</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PT.GS</td>
			<td>Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 &#181;m diameter and k=0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>FluoSpheres F8811,</td>
			<td>For tracking nanorheology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate capillary glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G100TF-4</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td>Manipulating the micropipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FemtoJet Express</td>
			<td>Controlling injection time and pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the embryos during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>Analyzing AFM and particle tracking data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>AB and TL wild type</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting embryos for nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>FST</td>
			<td>29025-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell

אחת מהמטרות העיקריות במחקר של פיתוח שחקרתי את הגורמים ישיר הארגון-עתיים המתפתחים ברקמות. הטענות שונים טוענים היו תרומות חשובות להבנה של התכונות המכאניות של תאים ורקמות בארגון שלהם ייתכן בתהליכים התפתחותיים, morphogenetic שונים. עם זאת, בשל היעדר כלים נגיש ואמין למדידת תכונות החומר, הפרמטרים tensional ויוו, אימות היפותזות אלה היה קשה. כאן אנו מציגים שיטות העסקת מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), חלקיקים מעקב במטרה לכמת תכונות מכאניות של התא חלמון דג זברה שלם העובר במהלך epiboly. Epiboly הוא תהליך התפתחותי מוקדם שנשמרת שמחקרו בהנחייתם של השקיפות של העובר. שיטות אלה הם פשוט ליישם, אמינים ובעלי החלים נרחב מאז הם מתגברים על התערבויות פולשניות העלולה להשפיע על רקמות מכניקה. אסטרטגיה פשוטה הוחל על הרכבה של דגימות, הקלטה AFM ו ננו-חלקיק זריקות ומעקב. גישה זו הופכת השיטות להתאמה בקלות פעמים התפתחותית או אורגניזמים אחרים.

מדידות מתח בקליפת המוח עבור כל נקודה מדידה, חמש עקומות כוח-הזחה (F-z) נרכשו על ידי AFM באמצעות הגדלת שלוחה 1 הרץ עם משרעת השיא אל שיא של 5 מיקרומטר (מהירות = 10 מיקרומטר/s) עד הכניסה המרבי של ~ 2 מיקרומטר. הליך זה לוקח פחות מ 20 דקות, לא הושפע epiboly התקדמות. כל תנאי הניסוי נבדק...

Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM ו Microrheology בתא חלמון עובר דג זברה

העדר כלים למדידת תכונות החומר, הפרמטרים tensional ויוו מונע אימות התפקידים שלהם במהלך הפיתוח. אנחנו מועסקים מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ומעקב nanoparticle לכמת תכונות מכניות על התא חלמון העובר תקין דג זברה במהלך epiboly. שיטות אלה הינם אמינים החלים נרחב הימנעות התערבויות פולשניות.

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

השימוש Immunolabeling כדי לנתח Microtubules יציב, דינמי, המתהווה של העובר דג זברה

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

הפרקים הבאים רקמה Endocardial ויה Photoconversion תאים של העובר דג זברה

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

העברת העובר פולשני המינימלי העובר ויטריפיקציה בשלב העובר אופטימלית במודל ארנב

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...