Name: afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell
Uploaded: 2017-11-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

Ringraziamo Amayra Hernández-Vega e Philippe-Alexandre Pouille per partecipare alla configurazione di base per questi protocolli. Ringraziamo anche la piattaforma di Imaging molecolare dalla IBMB-PCB, Xavier Esteban e membri del laboratorio per il continuo supporto. Il programma di gruppi consolidati della Generalitat de Catalunya e DGI e Consolider sovvenzioni dal Ministero dell'economia e competitività della Spagna all'EMB e DN supportato questo lavoro.

Tutti i passaggi di protocollo descritti di seguito seguono le indicazioni di cura degli animali delle nostre istituzioni.
1. Zebrafish cultura
<ol><li>Allevare e mantenere zebrafish adulto in condizioni standard. Nota: AB e TL embrioni di tipo selvaggio sono stati utilizzati per questo studio.</li>
	<li>Raccogliere gli embrioni e farli crescere a 28,5 ° C in E3 embrione medio24. Loro fase secondo morfologia come descritto in precedenza19.<...

<ol>
	<li>Hernandez-Vega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cortical+tension+drives+zebrafish+epiboly+movements.">Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements.</a> EMBO J. 36, 25-41 (2017).</li><li>Brodland, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+force+microscopy+reveals+the+mechanics+of+ventral+furrow+invagination+in+Drosophila.">Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).</li><li>Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+up+is+stressful:+biophysical+laws+of+morphogenesis.">Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+forces+govern+germ-layer+organization+in+zebrafish.">Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish.</a> Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).</li><li>Koser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+is+critical+for+axon+growth+in+the+developing+brain.">Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain.</a> Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+of+living+cells:+principles+and+applications.">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>de Pablo, P. J., Carri&#243;n-V&#225;zquez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Biological+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy.">Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).</li><li>Roca-Cusachs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+passive+and+adhesion-activated+neutrophils+probed+by+atomic+force+microscopy.">Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).</li><li>Evans, E., Yeung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+viscosity+and+cortical+tension+of+blood+granulocytes+determined+by+micropipet+aspiration.">Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration.</a> Biophys J. 56, 151-160 (1989).</li><li>Fabry, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+scale+and+other+invariants+of+integrative+mechanical+behavior+in+living+cells.">Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).</li><li>Kashef, J., Franz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+methods+for+analyzing+cell-cell+adhesion+in+development.">Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development.</a> Dev Biol. 401, 165-174 (2015).</li><li>Chevalier, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+micromechanical+properties+of+embryonic+tissues.">Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues.</a> Methods. 94, 120-128 (2016).</li><li>Reichlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+native+coronary+artery+endothelium+in+situ+and+in+cell+culture+by+scanning+force+microscopy.">Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy.</a> J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).</li><li>Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+osteon+and+trabecular+bone+measured+by+nanoindentation.">Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation.</a> J Biomech. 31, 21 (1998).</li><li>Grant, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+characterisation+and+biomechanical+analysis+of+the+sclera+by+atomic+force+microscopy.">Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy.</a> J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).</li><li>Efremov, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+living+and+fixed+Xenopus+laevis+embryos.">Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos.</a> Micron. 42, 840-852 (2011).</li><li>Henkels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Mechanical+Variation+Reveals+Critical+Role+for+Rho+Kinase+During+Primitive+Streak+Morphogenesis.">Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis.</a> Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).</li><li>Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+in+zebrafish+--+all+just+about+adhesion?.">Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion?.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+gastrulation:+cell+movements,+signals,+and+mechanisms.">Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms.</a> Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).</li><li>Campinho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension-oriented+cell+divisions+limit+anisotropic+tissue+tension+in+epithelial+spreading+during+zebrafish+epiboly.">Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly.</a> Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).</li><li>Fischer-Friedrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+surface+tension+and+internal+pressure+generated+by+single+mitotic+cells.">Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells.</a> Sci Rep. 4, 6213 (2014).</li><li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics:+principles,+practices,+and+prospects.">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+of+human+lung+epithelial+cells+measured+by+atomic+force+microscopy.">Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).</li><li>Jorba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Micromechanical+Properties+of+the+Extracellular+Matrix+of+Soft+Tissues+by+Atomic+Force+Microscopy.">Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy.</a> J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).</li><li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+atomic-force+microscope+tips.">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).</li><li>Lomakina, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+and+measurement+of+neutrophil+indentation.">Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation.</a> Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).</li><li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+Microrheological+Measurements+of+Soft+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy+for+the+Hydrodynamic+Drag+on+the+Cantilever.">Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever.</a> Langmuir. 18, 716-721 (2002).</li><li>Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+single-cell+micromechanics+in+vivo:+the+microrheology+of+C.+elegans+developing+embryos.">Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos.</a> Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).</li><li>Kalwarczyk, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viscosity+of+complex+liquids+and+cytoplasm+of+mammalian+cells+at+the+nanoscale.">Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale.</a> Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).</li><li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+oscillations.+A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation.">Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, 222-225 (2014).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation.">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508, 392-396 (2014).</li><li>Johansen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+micromanipulation+of+nanoparticles+and+cells+inside+living+zebrafish.">Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish.</a> Nat Commun. 7, 10974 (2016).</li></ol>

Qui indichiamo che le proprietà del materiale e alcuni parametri biomeccanici della cella tuorlo zebrafish durante epiboly possono essere prontamente stimati mediante AFM e nanoparticelle microrheology.
Mentre AFM è stato impiegato per recuperare le caratteristiche reologiche di cellule e tessuti in condizioni fisiologiche4,5,25,28, qui abbiamo sviluppato un protoc...

I principi fisici alla base del controllo biomeccanico di processi morfogenetici sono in gran parte indefiniti. Mentre studi biomeccanici a livello molecolare e cellulare stanno raccogliendo un considerevole slancio, l'esplorazione dei parametri biomeccanici a livello del tessuto/organismo è a sua infanzia. Idrodinamica regressione1 o Video microscopia di forza2 permettono ai ricercatori di distinguere le forze attive e passive, mentre laser microchirurgia3o la microscopia a forza atomica (AFM) meno intrusiva di cellule dissociate4 o in vivo 5 o nanoparticelle microrheology6 consentire l'anticipazione di un tessuto proprietà meccaniche e le risposte.
AFM è una tecnica topografica tridimensionale con risoluzione atomica ad alta risoluzione di rugosità superficiale e rispetto dalla deflessione di suggerimenti a sbalzo a contatto con una superficie sondati7. Diverse metodologie che impiegano AFM sono stati sviluppati per studiare proprietà di superficie, compresa la misurazione di attrito, le forze di adesione e proprietà viscoelastiche dei materiali diversi. Recentemente, AFM è emerso come un potente strumento per recuperare le informazioni sulle proprietà meccaniche dei campioni biologici. In particolare, AFM non invadente può estrarre il modulo di taglio complesse da singole cellule applicando oscillatori rientranze con un micro suggerimento attaccato a uno sbalzo di noto curvatura costante8. Questo ci permette di dedurre le forze risultanti. Eppure, AFM non è univoco e diverse metodologie consentono di estrarre dati reologici e proprietà meccaniche da singole celle (ad esempio, micropipetta aspirazione9, magnetico torsione cytometry (MTC)10o uniassiale trazione test11).
Ancora, l'applicazione di queste nuove metodologie a complessi processi morfogenetici non è semplice. Le sfide principali affrontate nel determinare le proprietà meccaniche dei tessuti embrionali sono il piccolo (µm a mm), morbido (nel 102 - 104 Pa gamma) e natura visco-elastico (dando luogo a fenomeni dipendenti dal tempo) del materiale12. È pertanto importante adeguare i metodi impiegati per la determinazione delle proprietà meccaniche (rigidezza, viscosità, adesione) per il caso specifico di embrioni e di organismi in via di sviluppo. Due questioni importanti devono essere prese in considerazione quando si analizzano reologici approcci nello studio dello sviluppo: per evitare interferenze invadente e per fornire facile accessibilità. In questo scenario, l'aspirazione micropipetta, MTC e prove di trazione presentano limitazioni. Nel primo caso, all'elevata deformabilità che soffre di una cella potrebbe alterare le proprietà fisiologiche e meccaniche9. Nel secondo caso, la necessità di aderire saldamente al tessuto sperimentale di un substrato per garantire che le sollecitazioni impresse deformano il citoscheletro localmente potrebbe anche introdurre effetti sullo stato di attivazione delle cellule e, quindi, nelle loro caratteristiche meccaniche10 . Approcci di trazione monoassiali, ultimi sono limitati dalla geometria di sviluppare organismi e accessibilità11.
AFM sembra essere più adatto per lo studio dei processi di sviluppo in quanto permette lo studio di campioni biologici direttamente nel loro ambiente naturale senza alcuna preparazione del campione ingombrante. Inoltre, come dissociazione di tessuti embrionali è generalmente difficile, la ridotta dimensione delle sonde AFM fornisce un alto grado di versatilità con nessuna limitazione nella scelta del tipo di media (acquoso o non acquoso), la temperatura del campione o prodotto chimico composizione del campione. AFM è abbastanza versatile per essere applicato a domini di grandi dimensioni e scale del tempo ed è stato impiegato per recuperare le proprietà materiali dei tessuti in condizioni fisiologiche o distinte fasi di sviluppo. Tessuti intero nativi come arterie13 o ossa14 sono state studiate dal punto di vista topografico e in alcuni casi, come la sclera, proprietà meccaniche sono stati anche estratto15. Topografia è stato esplorato anche in streaming in embrioni permettendo la visualizzazione di, per esempio, la riorganizzazione a cellula durante la morfogenesi in Xenopus16. Protocolli della preparazione del campione globale, ultimo sono state sviluppate per determinare i parametri meccanici durante diversi processi di sviluppo. La nanoindentazione mappe sono state generate su sezioni di tessuto nativo non fissati per il pulcino embrionali digerente11; Proprietà adesive e meccaniche estratto per le singole celle di ectoderma, mesoderma ed endoderma progenitrici isolate da gastrulating zebrafish embrioni4; misurazioni di rigidità per l'epiblasto e linea primitiva su espianti da embrioni aviari17; e un modello distinto di gradienti di rigidità sono definiti direttamente nel cervello embrionale di Xenopus5.
Un salto di qualità notevole per l'applicazione di AFM per esplorare lo sviluppo embrionale può venire da avvicinando semplici accessibili processi morfogenetici. Epiboly di zebrafish è un evento essenziale e conservato, in cui diversi tessuti coordinano in uno spazio ristretto sferico per dirigere l'espansione del blastoderm in poche ore. Al momento della comparsa di zebrafish epiboly (fase sferica), uno strato superficiale di cellule, lo strato avvolgente (EVL), copre una calotta semi-sferica di blastomeri centrata sul polo animale dell'embrione che si siede su una cellula sinciziale tuorlo massiccia. Epiboly consiste dell'espansione corticale ward vegetale dell'EVL, cellule profonde (DCs) il blastoderm, e lo strato esterno della cellula sinciziale tuorlo (E-YSL) intorno al tuorlo. Epiboly si conclude con la chiusura dell'EVL e i controller di dominio al palo vegetal18,19,20. Come e dove le forze sono generate durante epiboly e come sono accoppiate a livello globale non è ancora chiaro1,21.
Qui descriviamo in dettaglio come applicare AFM per dedurre proprietà meccanica passiva del tessuto durante la progressione di epiboly in zebrafish tuorlo delle cellule in vivo. A tale scopo, abbiamo impiegato le piccole microsfere attaccate al cantilever AFM come sonde. Questo consente il recupero di informazioni locale precise all'interno della superficie delle cellule di tuorlo non uniforme e di studiare tensionale gradienti e le loro dinamiche nel tempo. Si avvicina a AFM alternativi come quelli che usano Cuneo cantilever22, saranno dati locali non rendering che sono sufficientemente precisi. La tecnica di Cuneo, che richiede le abilità di manipolazione molto attenta ad incollare una fetta più grande della dimensione del campione all'estremità del cantilever, non è adatta per il sondaggio dell'embrione (~ 2 volte più grande rispetto alla lunghezza dello sbalzo) meccanica.
Modellazione e caratterizzare le proprietà viscoelastiche delle cellule in modo qualitativo e quantitativo consente una migliore comprensione dei loro biomeccanica. Da un punto di vista biomeccanico, è essenziale comprendere epiboly e non solo richiesta conoscenza sulle misurazioni di tensione corticale e dinamiche, che possono essere estratti da AFM; così c'è bisogno di informazioni sulle proprietà biofisiche del tessuto. Per estrarre queste informazioni, una varietà di cellula reologia tecniche sono state sviluppate nel corso degli anni al fine di caratterizzare i diversi tipi di cellule sotto diverse condizioni fisiologiche23. Essi includono AFM, MTC e pinzette ottiche (OT). Questi metodi, tuttavia, sono stati dimostrati inadeguati per mesoscopiche analisi a scala di embrioni o di organi. In alternativa, abbiamo adattato con successo nanoparticle tracking microrheology6 per in vivo misure reologiche. Questa tecnica analizza gli spostamenti browniani delle singole particelle e vengono dedotte le proprietà locali micromeccanici.
Insieme microrheology AFM e nanoparticelle consentono la definizione delle dinamiche tensionale corticale e proprietà meccaniche interne del tuorlo durante epiboly. Queste informazioni approva pienamente un modello in cui anisotropo stress si sviluppa in conseguenza delle differenze nella risposta deformazione dell'EVL e strato citoplasmico tuorlo (YCL) alla contrazione di actomiosina isotropo della corteccia E-YSL è essenziale per il movimento netto direzionale della progressione EVL ed epiboly1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td>Visualization of the sample and AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope (AFM)</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>-</td>
			<td>Any commercialized AFM could be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM780</td>
			<td>Nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8016.00</td>
			<td>Casting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure LMP Agarose (low melting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>Securing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Z-MOLDS</td>
			<td>Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si3N4 cantilever</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PT.GS</td>
			<td>Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 &#181;m diameter and k=0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>FluoSpheres F8811,</td>
			<td>For tracking nanorheology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate capillary glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G100TF-4</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td>Manipulating the micropipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FemtoJet Express</td>
			<td>Controlling injection time and pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the embryos during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>Analyzing AFM and particle tracking data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>AB and TL wild type</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting embryos for nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>FST</td>
			<td>29025-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell

Chiarire i fattori che dirigono l'organizzazione spazio-temporale dell'evoluzione tessuti è uno degli scopi principali nello studio dello sviluppo. Varie proposte sostengono di essere stati importanti contributi alla comprensione delle proprietà meccaniche delle cellule e dei tessuti nella loro organizzazione spazio-temporale in diversi processi morfogenetici e di sviluppo. Tuttavia, a causa della mancanza di strumenti affidabili e accessibili per misurare le proprietà dei materiali e parametri tensionale in vivo, convalida di queste ipotesi è stata difficile. Qui presentiamo metodi che impiegano la microscopia a forza atomica (AFM) e particle tracking con l'obiettivo di quantificare le proprietà meccaniche della cella tuorlo intatto zebrafish embrione durante epiboly. Epiboly è un processo inerente allo sviluppo conservato precoce cui studio è facilitata dalla trasparenza dell'embrione. Questi metodi sono ampiamente applicabili, affidabile e semplice da implementare poiché essi superare gli interventi intrusivi che potrebbero influire sulla meccanica del tessuto. È stata applicata una strategia semplice per il montaggio di campioni, registrazione di AFM e iniezioni di nanoparticelle e il rilevamento. Questo approccio rende questi metodi facilmente adattabile ad altre volte inerente allo sviluppo o organismi.

Misure di tensione corticale Per ogni punto di misura, cinque curve di forza-spostamento (F-z) sono state acquisite da AFM di dilagare il cantilever a 1 Hz con un'ampiezza di picco-picco di 5 µm (velocità = 10 µm/s) fino a un rientro massimo di ~ 2 µm. Questa procedura stava prendendo meno di 20 minuti e non è stata colpita dalla progressione di epiboly. Ogni condizione sperimentale è stato testato in almeno 5 embrioni.
<p class="jove_content" fo:keep-togethe...

Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM e Microrheology nella cella tuorlo embrione di pesce zebra

La mancanza di strumenti per misurare le proprietà dei materiali e parametri tensionale in vivo impedisce la convalida loro ruoli durante lo sviluppo. Abbiamo impiegato la microscopia a forza atomica (AFM) e rilevamento delle nanoparticelle di quantificare caratteristiche meccaniche sulla cella tuorlo intatto zebrafish embrione durante epiboly. Questi metodi sono affidabili e ampiamente applicabile evitando interventi intrusivi.

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microperla impianto nel zebrafish

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Monitoraggio celle in Zebrafish GFP-transgenico Utilizzo del sistema fotoconvertibile PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Primaria endodermico cellule epiteliali Cultura dal tuorlo Sac membrana di giapponesi Quail embrioni

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identificazione di progenitori eritromieloidi e loro progenie nell&#39;embrione del mouse dalla citometria del flusso

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Uso di Immunolabeling per analizzare i microtubuli stabili, dinamici e nascenti nell'embrione di pesce zebra

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Seguendo i movimenti del tessuto Endocardial tramite cella fotoconversione nell'embrione di pesce zebra

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Trasferimento embrionale minimamente invasivo e vetrificazione embrionale nella fase embrionale ottimale nel modello Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...