Name: afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell
Uploaded: 2017-11-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

Vi takker Amayra Hernández-Vega og Philippe Alexandre Pouille for deltakelse i definere grunnlaget for disse protokollene. Vi takker også molekylær Imaging plattformen fra IBMB-PCB, Xavier Esteban og medlemmer av laboratoriet for kontinuerlig støtte. Programmet konsolidert grupper av Generalitat de Catalunya og DGI og consolidar tilskudd fra departementet for økonomi og Competitivity i Spania EMB og DN støttet dette arbeidet.

Alle protokollen trinnene beskrevet nedenfor følger retningslinjene for dyr omsorg i våre institusjoner.
1. sebrafisk kultur
<ol><li>Rase og vedlikeholde voksen sebrafisk under standard betingelser. Merk: AB og TL vill type embryo ble brukt for denne studien.</li>
	<li>Samle embryoer og dyrke dem på 28,5 ° C i E3 embryoet middels24. Scenen dem ifølge morfologi som beskrevet tidligere19.</li>
</ol>2. atomic Force mi...

<ol>
	<li>Hernandez-Vega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cortical+tension+drives+zebrafish+epiboly+movements.">Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements.</a> EMBO J. 36, 25-41 (2017).</li><li>Brodland, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+force+microscopy+reveals+the+mechanics+of+ventral+furrow+invagination+in+Drosophila.">Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).</li><li>Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+up+is+stressful:+biophysical+laws+of+morphogenesis.">Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+forces+govern+germ-layer+organization+in+zebrafish.">Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish.</a> Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).</li><li>Koser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+is+critical+for+axon+growth+in+the+developing+brain.">Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain.</a> Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+of+living+cells:+principles+and+applications.">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>de Pablo, P. J., Carri&#243;n-V&#225;zquez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Biological+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy.">Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).</li><li>Roca-Cusachs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+passive+and+adhesion-activated+neutrophils+probed+by+atomic+force+microscopy.">Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).</li><li>Evans, E., Yeung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+viscosity+and+cortical+tension+of+blood+granulocytes+determined+by+micropipet+aspiration.">Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration.</a> Biophys J. 56, 151-160 (1989).</li><li>Fabry, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+scale+and+other+invariants+of+integrative+mechanical+behavior+in+living+cells.">Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).</li><li>Kashef, J., Franz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+methods+for+analyzing+cell-cell+adhesion+in+development.">Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development.</a> Dev Biol. 401, 165-174 (2015).</li><li>Chevalier, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+micromechanical+properties+of+embryonic+tissues.">Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues.</a> Methods. 94, 120-128 (2016).</li><li>Reichlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+native+coronary+artery+endothelium+in+situ+and+in+cell+culture+by+scanning+force+microscopy.">Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy.</a> J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).</li><li>Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+osteon+and+trabecular+bone+measured+by+nanoindentation.">Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation.</a> J Biomech. 31, 21 (1998).</li><li>Grant, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+characterisation+and+biomechanical+analysis+of+the+sclera+by+atomic+force+microscopy.">Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy.</a> J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).</li><li>Efremov, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+living+and+fixed+Xenopus+laevis+embryos.">Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos.</a> Micron. 42, 840-852 (2011).</li><li>Henkels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Mechanical+Variation+Reveals+Critical+Role+for+Rho+Kinase+During+Primitive+Streak+Morphogenesis.">Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis.</a> Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).</li><li>Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+in+zebrafish+--+all+just+about+adhesion?.">Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion?.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+gastrulation:+cell+movements,+signals,+and+mechanisms.">Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms.</a> Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).</li><li>Campinho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension-oriented+cell+divisions+limit+anisotropic+tissue+tension+in+epithelial+spreading+during+zebrafish+epiboly.">Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly.</a> Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).</li><li>Fischer-Friedrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+surface+tension+and+internal+pressure+generated+by+single+mitotic+cells.">Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells.</a> Sci Rep. 4, 6213 (2014).</li><li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics:+principles,+practices,+and+prospects.">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+of+human+lung+epithelial+cells+measured+by+atomic+force+microscopy.">Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).</li><li>Jorba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Micromechanical+Properties+of+the+Extracellular+Matrix+of+Soft+Tissues+by+Atomic+Force+Microscopy.">Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy.</a> J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).</li><li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+atomic-force+microscope+tips.">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).</li><li>Lomakina, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+and+measurement+of+neutrophil+indentation.">Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation.</a> Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).</li><li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+Microrheological+Measurements+of+Soft+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy+for+the+Hydrodynamic+Drag+on+the+Cantilever.">Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever.</a> Langmuir. 18, 716-721 (2002).</li><li>Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+single-cell+micromechanics+in+vivo:+the+microrheology+of+C.+elegans+developing+embryos.">Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos.</a> Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).</li><li>Kalwarczyk, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viscosity+of+complex+liquids+and+cytoplasm+of+mammalian+cells+at+the+nanoscale.">Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale.</a> Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).</li><li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+oscillations.+A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation.">Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, 222-225 (2014).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation.">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508, 392-396 (2014).</li><li>Johansen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+micromanipulation+of+nanoparticles+and+cells+inside+living+zebrafish.">Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish.</a> Nat Commun. 7, 10974 (2016).</li></ol>

Her viser vi at materielle egenskapene og noen biomekaniske parametere sebrafisk eggeplomme cellen under epiboly kan lett estimeres ved AFM og nanopartikler microrheology.
Mens AFM har vært ansatt hente reologiske funksjoner i celler og vev i fysiologiske forhold4,5,25,28, utviklet her vi en protokoll for bruk AFM på intakt utvikling embryo som vi ansatt for å tes...

De fysiske prinsippene biomekaniske kontroll av Morfogenetiske prosesser er hovedsakelig udefinert. Mens biomekaniske studier på molekylære og mobilnettet nivå samler betydelig fart, er utforskningen av biomekaniske parametere på vev/organisme nivå på sin barndom. Etter regresjon1 eller Video tvinge mikroskopi2 tillate forskere å skille mellom aktive og passive styrker, mens laser mikrokirurgi3eller mindre påtrengende atomic force mikroskopi (AFM) avstand celler4 eller i vivo 5 eller hydrogenion microrheology6 tillate påvente av en vev mekaniske egenskaper og svar.
AFM er en tredimensjonal topografiske teknikk med høy atomic oppløsning løse overflateruhet og overholdelse fra nedbøyning cantilever tips ved kontakt med probed overflaten7. Ulike metoder ansette AFM er utviklet for å undersøke overflate egenskaper, inkludert måle friksjon, vedheft styrker og viskoelastiske egenskaper av ulike materialer. AFM har nylig dukket opp som et kraftig verktøy for å hente informasjon i biologiske prøver mekaniske egenskaper. Spesielt kan AFM ikke-invasively trekke komplekse skjær modulus fra enkeltceller ved å bruke oscillasjon innrykk med mikro tips knyttet til en cantilever kjent bøying konstant8. Dermed kan vi antyde resulterende styrker. Likevel, AFM er ikke unikt og ulike metoder kan trekke reologiske data og mekaniske egenskaper fra individuelle celler (f.eks brønnene aspirasjon9, magnetiske kronglete cytometri (MTC)10eller uniaxial strekk testing11).
Likevel, bruk av disse ny metoder til komplekse Morfogenetiske prosesser er ikke enkel. De viktigste utfordringene når de mekaniske egenskapene av embryonale vev er små (µm mm), myk (i 102 - 104 Pa-serien) og visco-elastisk (gi opphav til tidsavhengige fenomener) natur av materielle12. Det er derfor viktig å tilpasse metoder brukt for fastsettelse av mekaniske egenskaper (stivhet, viskositet, vedheft) til det konkrete tilfellet av embryo og utvikle organismer. To viktige spørsmål må tas i betraktning når du analyserer reologiske tilnærminger å studere utviklingen: unngå påtrengende forstyrrelser og gi lett tilgjengelighet. I dette scenariet utstilling brønnene aspirasjon, MTC og strekk testing begrensninger. I det første tilfellet, kan høy deformasjon som en celle lider endre sine fysiologiske og mekaniske egenskaper9. I det andre tilfellet kan måtte fast følge eksperimentelle vevet til et substrat for å sikre at stress brukt deformere cytoskeleton lokalt også introdusere effekter på cellene aktiveringsstatus og derfor i sine mekaniske funksjoner10 . Siste, uniaxial strekk tilnærminger er begrenset av geometrien i utvikle organismer og tilgjengelighet11.
AFM synes å være bedre egnet for studiet av utviklingsprosesser som det tillater studiet av biologiske prøver direkte i sitt naturlige miljø uten noen tungvint eksempel forberedelser. Videre som av embryonale vev er generelt vanskelig, gir den reduserte størrelsen på AFM sonder en høy grad av allsidighet med ingen begrensning i valg av typen medium (vandig eller ikke-vandig), eksempel temperatur eller kjemisk sammensetning av prøven. AFM er allsidig nok til å brukes på store domener og tid skalaer og har vært ansatt hente materialegenskaper vev i forskjellige utviklingsstadier eller fysiologiske forhold. Hele opprinnelige vev som arteriene13 eller bein14 har studert fra en topografiske synspunkt og i noen tilfeller, som sclera, mekaniske egenskaper har også vært hentet15. Topografi har blitt utforsket i live embryoer tillater visualisering av, for eksempel celle omorganisering under morphogenesis i Xenopus16. Siste, omfattende utvalg forberedelse protokollene er utviklet for å fastslå mekanisk parametere under forskjellige utviklingsprosesser. Nanoindentation kart generert på innfødt unfixed vev seksjoner for chick embryonale fordøyelseskanalen11; klebende og mekaniske egenskaper hentet for enkelte ektoderm, mesoderm og endoderm stamfar celler isolert fra gastrulating sebrafisk embryo4; stivhet målinger utført for epiblast og primitive stripe på explants avian embryo17; og et distinkt mønster av stivhet forløpninger direkte definert i embryonale hjernen Xenopus5.
Betydelig kvalitative spranget for å søke AFM utforske embryonale utviklingen kommer nærmer enkelt tilgjengelig Morfogenetiske prosesser. Sebrafisk epiboly er en viktig og konservert hendelse, der ulike vev koordinere med begrenset sfærisk plass til direkte utvidelse av blastoderm i noen timer. Ved utbruddet av sebrafisk epiboly (sfærisk scenen) dekker en overfladisk lag av celler, omsluttende laget (EVL), en semi sfærisk cap blastomeres sentrert på dyr stangen av embryoet sitter på en massiv eggeplomme syncytial celle. Epiboly består av kortikale grønne ward utvidelse av EVL, dype cellene (DCene) i blastoderm, og den ytre lag av syncytial eggeplomme cellen (E-YSL) rundt eggeplomme. Epiboly slutter med nedleggelsen av EVL og DCs vegetal pole18,19,20. Hvordan og hvor styrker genereres under epiboly og hvordan de er globalt kombinert er ennå ikke klart1,21.
Her beskrive vi i detalj hvordan søke AFM å antyde passiv mekanisk vev egenskaper under epiboly progresjon i sebrafisk eggeplomme celle i vivo. Gjør ansatt vi liten mikrosfærer knyttet til AFM utkragning som sonder. Dette gjør at henting av presise lokal informasjon i ikke-uniform eggeplomme celleoverflaten og å studere tensional graderinger og deres dynamics over tid. Alternative AFM tilnærminger som de bruker kile utkragning22, vil ikke gjengi lokale data som er nøyaktig nok. Kile teknikken, som krever svært forsiktig manipulasjon ferdigheter å lime en kile større enn størrelsen på utvalget på slutten av hengende, er ikke godt egnet for undersøkelser embryo (~ 2-fold større enn lengden på hengende) mekanikk.
Modellering og karakterisere viskoelastiske egenskapene til celler på kvalitativ og kvantitativ måter gir en bedre forståelse av deres biomekanikk. Fra en biomekaniske synspunkt er det viktig å forstå epiboly, og ikke bare krever kunnskap om kortikale spenning målinger og dynamikk, som kan trekkes ut ved AFM; Dermed er det behov for informasjon om egenskapene Biofysiske av vev. Hvis du vil trekke ut denne informasjonen, en rekke celle Reologi teknikker er utviklet gjennom årene for å karakterisere ulike celletyper under ulike fysiologiske forhold23. De inkluderer AFM, MTC og optisk pinsett (OT). Disse metodene, men har vist seg utilstrekkelig for Mesoskopisk analyser på omfanget av embryo eller organer. Som et alternativ, har vi lykkes tilpasset hydrogenion sporing microrheology6 for i vivo reologiske målinger. Denne teknikken analyserer Brownian forskyvningene personlige partikler og utleder lokale micromechanical egenskaper.
Sammen AFM og hydrogenion microrheology at definisjonen av kortikale tensional dynamics og interne mekaniske egenskaper av plommen under epiboly. Denne informasjonen støtter fullt en modell der Anisotrop stress utvikler av forskjellene i deformasjon svar på EVL og den eggeplomme cytoplasmatiske lag (YCL) til isotropic actomyosin sammentrekning av E-YSL cortex er avgjørende for retningsbestemt netto bevegelsen av EVL og epiboly progresjon1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td>Visualization of the sample and AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope (AFM)</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>-</td>
			<td>Any commercialized AFM could be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM780</td>
			<td>Nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8016.00</td>
			<td>Casting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure LMP Agarose (low melting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>Securing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Z-MOLDS</td>
			<td>Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si3N4 cantilever</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PT.GS</td>
			<td>Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 &#181;m diameter and k=0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>FluoSpheres F8811,</td>
			<td>For tracking nanorheology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate capillary glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G100TF-4</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td>Manipulating the micropipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FemtoJet Express</td>
			<td>Controlling injection time and pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the embryos during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>Analyzing AFM and particle tracking data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>AB and TL wild type</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting embryos for nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>FST</td>
			<td>29025-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell

Klargjørende faktorer som direkte spatio-temporale organisasjonen utvikling vev er en av de viktigste formålene i studiet av utvikling. Ulike påstander hevder å ha vært viktige bidrag til forståelsen av mekanisk egenskapene til celler og vev i organisasjonen spatiotemporal i ulike utviklingsmessige og Morfogenetiske prosesser. Men på grunn av mangel på pålitelig og tilgjengelig verktøy til å måle materialegenskaper og tensional parametere i vivo, har validere disse hypotesene vært vanskelig. Her presenterer vi metoder ansette atomic force mikroskopi (AFM) og partikkel sporing med sikte på å kvantifisere mekaniske egenskaper for intakt sebrafisk embryoet eggeplomme cellen under epiboly. Epiboly er en tidlig bevarte utviklingsprosess som studien er tilrettelagt av gjennomsiktigheten til fosteret. Disse metodene er enkle å implementere, pålitelig og allment gjeldende siden de overvinne påtrengende tiltak som kan påvirke vev mekanikk. En enkel strategi ble brukt for montering av prøver, AFM opptak og hydrogenion injeksjoner og sporing. Denne tilnærmingen gjør disse metodene lett tilpasses andre utviklingsmessige ganger eller organismer.

Kortikale spenning målinger For hver måling poeng, fem kurver i force-forskyvning (F-z) ble kjøpt av AFM av gradvis hengende ved 1 Hz med en topp-til-peak amplitude på 5 µm (hastighet = 10 µm/s) opp til en maksimal innrykk på ~ 2 µm. Denne fremgangsmåten tok mindre enn 20 min og var ikke påvirket av epiboly progresjon. Hver eksperimentelle tilstand ble testet i minst 5 embryoer.
Force-forskyvning ku...

Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM og Microrheology i sebrafisk Embryo eggeplomme cellen

Mangel på verktøy for å måle materialegenskaper og tensional parametere i vivo forhindrer validering sine roller under utvikling. Vi ansatt atomic force mikroskopi (AFM) og hydrogenion sporing å kvantifisere mekaniske funksjoner intakt sebrafisk embryoet eggeplomme cellen under epiboly. Disse metodene er pålitelig og allment gjeldende unngå påtrengende intervensjoner.

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Mikro Implantasjon i sebrafisk Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulære strukturer i Living Sebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Sporing celler i GFP-transgene Sebrafisk Bruke Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Primær endodermal epithelial Cell Culture fra plommesekken membran av japanske Quail embryoer

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Observerer Mitotisk divisjon og Dynamics i en Live Sebrafisk Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikasjon av erytromyeloidprogenitorer og deres avkom i musembryoen ved flowcytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Bruk av Immunolabeling å analysere stabil, dynamisk og gryende piskehale som henger i sebrafisk Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Følgende Endocardial vev bevegelser via celle Photoconversion i sebrafisk Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalt invasiv embryo Transfer og embryo vitrifikasjon på optimal embryo Stage i Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...