Name: afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell
Uploaded: 2017-11-29T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

Vi tackar Amayra Hernández-Vega och Philippe-Alexandre Pouille för deltagande i ställa in grunden för dessa protokoll. Vi tackar också molekylär Imaging plattformen från IBMB-PCB, Xavier Esteban och medlemmar av laboratoriet för kontinuerligt stöd. Programmet konsoliderade grupper av Generalitat de Catalunya och DGI och Consolider bidrag från ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft i Spanien till EMB och DN stött detta arbete.

Alla protokoll steg beskrivs nedan följa riktlinjerna för djurens vård av våra institutioner.
1. zebrafiskar kultur
<ol><li>Ras och underhålla vuxna zebrafiskar under standart villkorar. Obs: AB och TL vildtyp embryon användes för denna studie.</li>
	<li>Samla in embryon och odla dem på 28,5 ° C i E3 embryo medium24. Arrangera dem enligt morfologi som tidigare beskrivits19.</li>
</ol>2. atomic Force Microscopy<...

<ol>
	<li>Hernandez-Vega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+cortical+tension+drives+zebrafish+epiboly+movements.">Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements.</a> EMBO J. 36, 25-41 (2017).</li><li>Brodland, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+force+microscopy+reveals+the+mechanics+of+ventral+furrow+invagination+in+Drosophila.">Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).</li><li>Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+up+is+stressful:+biophysical+laws+of+morphogenesis.">Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensile+forces+govern+germ-layer+organization+in+zebrafish.">Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish.</a> Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).</li><li>Koser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensing+is+critical+for+axon+growth+in+the+developing+brain.">Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain.</a> Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+of+living+cells:+principles+and+applications.">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>de Pablo, P. J., Carri&#243;n-V&#225;zquez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Biological+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy.">Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).</li><li>Roca-Cusachs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+passive+and+adhesion-activated+neutrophils+probed+by+atomic+force+microscopy.">Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).</li><li>Evans, E., Yeung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+viscosity+and+cortical+tension+of+blood+granulocytes+determined+by+micropipet+aspiration.">Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration.</a> Biophys J. 56, 151-160 (1989).</li><li>Fabry, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+scale+and+other+invariants+of+integrative+mechanical+behavior+in+living+cells.">Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).</li><li>Kashef, J., Franz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+methods+for+analyzing+cell-cell+adhesion+in+development.">Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development.</a> Dev Biol. 401, 165-174 (2015).</li><li>Chevalier, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+micromechanical+properties+of+embryonic+tissues.">Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues.</a> Methods. 94, 120-128 (2016).</li><li>Reichlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+native+coronary+artery+endothelium+in+situ+and+in+cell+culture+by+scanning+force+microscopy.">Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy.</a> J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).</li><li>Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+osteon+and+trabecular+bone+measured+by+nanoindentation.">Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation.</a> J Biomech. 31, 21 (1998).</li><li>Grant, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+characterisation+and+biomechanical+analysis+of+the+sclera+by+atomic+force+microscopy.">Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy.</a> J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).</li><li>Efremov, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+living+and+fixed+Xenopus+laevis+embryos.">Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos.</a> Micron. 42, 840-852 (2011).</li><li>Henkels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Mechanical+Variation+Reveals+Critical+Role+for+Rho+Kinase+During+Primitive+Streak+Morphogenesis.">Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis.</a> Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).</li><li>Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+in+zebrafish+--+all+just+about+adhesion?.">Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion?.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+gastrulation:+cell+movements,+signals,+and+mechanisms.">Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms.</a> Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).</li><li>Campinho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension-oriented+cell+divisions+limit+anisotropic+tissue+tension+in+epithelial+spreading+during+zebrafish+epiboly.">Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly.</a> Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).</li><li>Fischer-Friedrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+surface+tension+and+internal+pressure+generated+by+single+mitotic+cells.">Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells.</a> Sci Rep. 4, 6213 (2014).</li><li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics:+principles,+practices,+and+prospects.">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+of+human+lung+epithelial+cells+measured+by+atomic+force+microscopy.">Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).</li><li>Jorba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Micromechanical+Properties+of+the+Extracellular+Matrix+of+Soft+Tissues+by+Atomic+Force+Microscopy.">Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy.</a> J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).</li><li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+atomic-force+microscope+tips.">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).</li><li>Lomakina, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+and+measurement+of+neutrophil+indentation.">Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation.</a> Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).</li><li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+Microrheological+Measurements+of+Soft+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy+for+the+Hydrodynamic+Drag+on+the+Cantilever.">Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever.</a> Langmuir. 18, 716-721 (2002).</li><li>Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+single-cell+micromechanics+in+vivo:+the+microrheology+of+C.+elegans+developing+embryos.">Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos.</a> Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).</li><li>Kalwarczyk, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viscosity+of+complex+liquids+and+cytoplasm+of+mammalian+cells+at+the+nanoscale.">Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale.</a> Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).</li><li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+oscillations.+A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation.">Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, 222-225 (2014).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation.">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508, 392-396 (2014).</li><li>Johansen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+micromanipulation+of+nanoparticles+and+cells+inside+living+zebrafish.">Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish.</a> Nat Commun. 7, 10974 (2016).</li></ol>

Här visar vi att materialets egenskaper och vissa biomekaniska parametrar av zebrafisk äggula cellen under epiboly lätt kan uppskattas av AFM och nanopartiklar microrheology.
Medan AFM har varit anställd att hämta reologiska egenskaper av celler och vävnader i fysiologiska förhållanden4,5,25,28, utvecklat här vi ett protokoll för att tillämpa AFM i intakt ...

De fysikaliska principer biomekaniska kontroll av morphogenetic processer är i hög grad odefinierat. Medan biomekaniska studier på molekylär och cellulär nivå samlas betydande momentum, är utforskandet av biomekaniska parametrar på vävnad/organism nivå i sin linda. Hydrodynamiska Regression1 eller Video tvinga mikroskopi2 tillåter forskare att skilja mellan aktiva och passiva styrkor, medan laser microsurgery3eller mindre påträngande atomic force microscopyen (AFM) dissocierade celler4 eller i vivo 5 eller nanopartiklar microrheology6 tillåta föregripande av en vävnads mekaniska egenskaper och svaren.
AFM är en tredimensionell topografiska teknik med hög atomär upplösning att lösa ytjämnhet och efterlevnad från omläggning av fribärande tips vid kontakt med en sonderade yta7. Olika metoder anställa AFM har utvecklats för att undersöka ytegenskaper, inklusive mäta friktion, vidhäftning styrkor och viskoelastiska egenskaperna hos olika material. Nyligen, AFM har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för att hämta information på de mekaniska egenskaperna av biologiska prover. AFM kan i synnerhet icke-invasivt extrahera komplexa skjuvning modulus från enstaka celler genom att tillämpa oscillerande fördjupningar med micro spets bifogas en fribärande av kända böjande konstant8. Detta låter oss härleda resulterande styrkorna. Ännu, AFM är inte unika och olika metoder att utvinna reologiska data och mekaniska egenskaper från enskilda celler (t.ex. mikropipett aspiration9, magnetiska vrida flödescytometri (MTC)10, eller enaxlig brottgräns provning11).
Ändå, tillämpningen av dessa nya metoder för komplexa morphogenetic processer är inte okomplicerad. De huvudsakliga utmaningarna när bestämning av mekaniska egenskaper av embryonala vävnader är små (µm till mm), soft (i 102 - 104 Pa rad) och viskoelastiskt (ger upphov till tidsberoende fenomen) arten av de materiella12. Det är därför viktigt att anpassa de metoder som används för bestämning av mekaniska egenskaper (stelhet, viskositet, vidhäftning) det särskilda fallet av embryon och utveckla organismer. Två viktiga frågor behöver beaktas när man analyserar reologiska metoder att studera utveckling: att undvika påträngande störningar och ge lätt tillgänglighet. I det här fallet uppvisar mikropipett aspiration, MTC och tensile tester begränsningar. I det första fallet kan hög deformation som en cell lider påverka dess fysiologiska och mekaniska egenskaper9. I det andra fallet kan behöver ordentligt följa den experimentella vävnaden som ett substrat för att säkerställa att de påfrestningar tillämpas deformera cytoskelettet lokalt också införa effekter på cellernas aktiveringsläge och därmed i deras mekaniska funktioner10 . Sista, enaxlig brottgräns metoder begränsas av geometri utveckla organismer och tillgänglighet11.
AFM verkar vara bättre lämpad för studier av utvecklingsprocesser eftersom det tillåter studier av biologiska prover direkt i deras naturliga miljö utan någon besvärlig provberedning. Dessutom eftersom dissociation av embryonala vävnader är allmänt svårt, ger reducerade storleken på AFM sonder en hög grad av mångsidighet utan begränsning i valet av vilken typ av medium (vattenlösning eller icke vattenhaltigt), provtemperaturen eller kemiska provets sammansättning. AFM är mångsidig nog att tillämpas på stora domäner och tid skalor och har varit anställd att hämta materialegenskaperna hos vävnader i olika utvecklingsstadier eller fysiologiska förhållanden. Hela infödda vävnader såsom artärer13 eller ben14 har studerats ur ett topografiska synvinkel och i vissa fall, som sklera, mekaniska egenskaper har också läst15. Topografin har också undersökts i levande embryon möjliggör visualisering av, till exempel cell rearrangering under morfogenes i Xenopus16. Sista, omfattande prov förberedelse protokoll har utvecklats för att bestämma mekaniska parametrar under olika utvecklingsprocesser. Nanoindentation kartor har genererats på infödda ofixerad vävnad sektioner för chick embryonala mag-tarmkanalen11; självhäftande och mekaniska egenskaper hämtas för enskilda ektoderm, mesoderm och endoderm stamceller isoleras från gastrulating zebrafiskar embryon4; stelhet-mätningar som gjorts för epiblast och primitiva strimma på bladsticklingar från aviär embryon17; och ett distinkt mönster av stelhet övertoningar direkt definieras i Xenopus5embryonala hjärna.
Ett betydande kvalitativt språng för att tillämpa AFM för att utforska fosterutvecklingen kan komma från närmar sig enkla tillgängliga morphogenetic processer. Zebrafiskar epiboly är en väsentlig och bevarade händelse, där olika vävnader samordna i ett begränsat sfäriska utrymme att styra utbyggnaden av blastoderm i några timmar. På uppkomsten av zebrafisk epiboly (sfäriska arrangerar) täcker ett ytligt lager av celler, omslutande lagret (EVL), en semi sfäriska mössa av blastomerer centrerad på djur stolpe av embryot sitter på en massiv äggula syncytial cell. Epiboly består av kortikala vegetal ward expansion av EVL, djupa celler (DCs) blastoderm och det yttre lagret av cellen syncytial äggula (E-YSL) runt äggulan. Epiboly avslutas med nedläggningen av EVL och DCs vid vegetal pole18,19,20. Hur och var krafterna alstras under epiboly och hur de är globalt sammankopplade är ännu inte klart1,21.
Här beskriver vi i detalj hur man ansöker AFM för att härleda passiva mekaniska vävnad boenden under epiboly i zebrafiskar äggulan cell i vivo. Det gör anställt vi små mikrosfärer bifogas AFM utliggare som sonder. Detta tillåter hämtning av exakt lokal information inom icke-enhetlig äggula cellytan och studera spännan övertoningar och deras dynamik över tid. Alternativa AFM närmar sig till exempel med kil utliggare22, kommer inte göra lokala data som är tillräckligt exakt. Kil tekniken, som kräver mycket noggrann manipulation färdigheter att limma en kil som är större än urvalsstorleken i slutet av uthänget, är inte väl lämpad för avsökning av embryo (~ 2 gånger större än längden av uthänget) mekanik.
Modellering och karaktärisera de viskoelastiska egenskaperna av celler i kvalitativa och kvantitativa sätt möjliggör en bättre förståelse för deras biomekanik. Från en biomekanisk synvinkel är det viktigt att förstå epiboly, och inte bara efterfrågan kunskaper på kortikal spänning mätningar och dynamik, som kan extraheras av AFM; Således finns det behov av information om biofysiska egenskaper av vävnad. Extrahera informationen genom en mängd olika cell reologi tekniker har utvecklats under åren för att karakterisera olika celltyper enligt olika fysiologiska villkor23. De inkluderar AFM, MTC och optisk pincett (OT). Dessa metoder, men har visat otillräcklig för Mesoskopisk analyser på omfattningen av embryon eller organ. Som ett alternativ, har vi framgångsrikt anpassat nanopartikel-tracking microrheology6 för i vivo reologiska mätningar. Denna teknik analyserar de Brownian förskjutningarna av enskilda partiklar och härleder lokala mikromekaniska boenden.
Grupp AFM och nanopartiklar microrheology att definitionen av kortikala spännan dynamics och inre mekaniska egenskaper av äggulan under epiboly. Denna information stöder fullt ut en modell där Anisotrop stress framkallar till följd av skillnader i EVL deformation svar och den äggula cytoplasmiska lager (YCL) isotropiskt actomyosin sammandragning av E-YSL cortex är viktigt för directional netto rörelsen av EVL och epiboly progression1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000</td>
			<td>Visualization of the sample and AFM cantilever</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atomic force microscope (AFM)</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>-</td>
			<td>Any commercialized AFM could be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM780</td>
			<td>Nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose D1 Low EEO</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8016.00</td>
			<td>Casting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure LMP Agarose (low melting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>Securing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Z-MOLDS</td>
			<td>Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont 5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>1.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si3N4 cantilever</td>
			<td>Novascan</td>
			<td>PT.GS</td>
			<td>Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 &#181;m diameter and k=0.01 N/m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent nanoparticles</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>FluoSpheres F8811,</td>
			<td>For tracking nanorheology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate capillary glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>G100TF-4</td>
			<td>Fabricating tailored microneedles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN-153</td>
			<td>Manipulating the micropipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FemtoJet Express</td>
			<td>Controlling injection time and pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC365FX</td>
			<td>Visualization of the embryos during injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis Software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>Analyzing AFM and particle tracking data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish</td>
			<td>AB and TL wild type</td>
			<td>-</td>
			<td>Strains employed for embryo collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Plates</td>
			<td>Mat Tek</td>
			<td>P35G-0.170-14-C</td>
			<td>Mounting embryos for nanorheology data collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>FST</td>
			<td>29025-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm and microrheology in the zebrafish embryo yolk cell

Klarlägga de faktorer som direkt plats och tid organisation utvecklas vävnader är en av de primära uppgifterna i studien av utveckling. Olika propositioner påstår sig ha varit viktiga bidrag till förståelsen av de mekaniska egenskaperna av celler och vävnader i deras spatiotemporal organisation i olika utvecklings- och morphogenetic processer. På grund av bristen på tillförlitlig och lättillgänglig verktyg att mäta materialegenskaper och spännan parametrar i vivo, har validera dessa hypoteser dock varit svårt. Här presenterar vi metoder som anställer atomic force microscopy (AFM) och partikel spårning i syfte att kvantifiera de mekaniska egenskaperna hos cellen intakt zebrafiskar embryo äggula under epiboly. Epiboly är en tidig bevarade developmental process vars studie underlättas av insyn i embryot. Dessa metoder är enkla att genomföra, tillförlitliga och allmänt tillämpliga eftersom de övervinna påträngande interventioner som skulle kunna påverka vävnad mekanik. En enkel strategi tillämpades för montering av provexemplar, AFM inspelning och nanopartiklar injektioner och spårning. Detta synsätt gör dessa metoder lätt att anpassa till andra utvecklingsmässiga gånger eller organismer.

Kortikala spänning mätningar För varje mätpunkt, fem kraft-deplacement (F-z) kurvor förvärvades av AFM genom rampning av uthänget på 1 Hz med en topp-till-topp amplituden av 5 µm (hastighet = 10 µm/s) upp till en maximal indrag av ~ 2 µm. Proceduren tog mindre än 20 min och påverkades inte av epiboly progression. Varje experimentella villkor testades i minst 5 embryon.
Kraft-deplacement kurvorna ...

Watch this Scientific Journal Video about AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell at JoVE.com

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM och Microrheology i cellen zebrafiskar Embryo äggula

Bristen på verktyg för att mäta materialegenskaper och spännan parametrar i vivo förhindrar validera sina roller under utveckling. Vi anställd atomic force microscopy (AFM) och nanopartiklar-tracking att kvantifiera mekaniska funktioner på cellen intakt zebrafiskar embryo äggula under epiboly. Dessa metoder är pålitliga och allmänt tillämpliga undvika påträngande interventioner.

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Implantation i zebrafisk embryot

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulära strukturer i vardagsZebraFish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Spåra celler i GFP-transgen zebrafisk Använda Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Primär endodermalt epitelceller Culture från gulesäcken membran av japansk vaktel embryon

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Observation Mitotisk Division och dynamik i en Live Zebrafisk Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikation av erytromyeloidprogenitorer och deras avkomma i musembryo med flödescytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Användning av Immunolabeling att analysera stabil, dynamisk och begynnande mikrotubuli i zebrafiskar embryot

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Följande endokardiella vävnad rörelser via Cell Photoconversion i zebrafiskar embryot

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalinvasiv embryoöverföring och embryo-förglasning vid det optimala embryonala steget i Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...