Name: measuring mrna levels over time during the yeast s. cerevisiae hypoxic response
Uploaded: 2017-08-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response at JoVE.com

Nous remercions l’Institut Lewis-Sigler Integrative Genomics séquençage Core Facility à l’Université de Princeton pour des conseils techniques et séquençage et préparation de bibliothèque d’ARN. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Université Rowan et NIH NIGM R15GM113187 à M.J.H.

1. induisant hypoxie
<ol><li>Un jour ou plus avant l’évolution temporelle de l’hypoxie : préparer l’incubateur, cellule de filtrage système, vide, réservoir d’essence, flacons, bouchons, verre étiré et tubes, comme dans la Table des matières.</li>
	<li>Char2 place N, incubateur, vide et système à proximité, pour permettre le traitement rapide des cellules de filtrage.</li>
	<li>Préparer milieu YPD liquide stérile (1 %, extrait de levure, peptone de 2 %, 2 % de glucose) e...

<ol>
	<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensing,+homeostasis,+and+disease.">Oxygen sensing, homeostasis, and disease.</a> New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).</li><li>Butler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+gene+expression+in+eukaryotic+microbes.">Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes.</a> Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).</li><li>Ratcliffe, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensing+and+hypoxia+signalling+pathways+in+animals:+the+implications+of+physiology+for+cancer.">Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer.</a> J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).</li><li>Rosenfeld, E., Beauvoit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+non-respiratory+pathways+in+the+utilization+of+molecular+oxygen+bySaccharomyces+cerevisiae.">Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).</li><li>Ter Linde, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transcriptional+analysis+of+aerobic+and+anaerobic+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).</li><li>Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microarray-assisted+screen+for+potential+Hap1+and+Rox1+target+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).</li><li>Kwast, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analyses+of+anaerobically+induced+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae:+functional+roles+of+Rox1+and+other+factors+in+mediating+the+anoxic+response.">Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response.</a> J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).</li><li>Becerra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+transcriptome+in+aerobic+and+hypoxic+conditions:+effects+of+hap1,+rox1,+rox3+and+srb10+deletions.">The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions.</a> Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).</li><li>Lai, L. -. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamical+remodeling+of+the+transcriptome+during+short-term+anaerobiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae:+differential+response+and+role+of+Msn2+and/or+Msn4+and+other+factors+in+galactose+and+glucose+media.">Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).</li><li>Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic-State-Dependent+Remodeling+of+the+Transcriptome+in+Response+to+Anoxia+and+Subsequent+Reoxygenation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).</li><li>Hickman, M. J., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+levels+switch+the+function+of+Hap1+of+Saccharomyces+cerevisiae+between+transcriptional+activator+and+transcriptional+repressor.">Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).</li><li>Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase+mediates+a+hypoxic+response+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).</li><li>Bendjilali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Course+Analysis+of+Gene+Expression+During+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hypoxic+Response.">Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response.</a> G3. 7 (1), 221-231 (2017).</li><li>Chellappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+proteins,+Spt23p+and+Mga2p,+play+distinct+roles+in+the+activation+of+Saccharomyces+cerevisiae+OLE1+gene+expression.+Fatty+acid-mediated+regulation+of+Mga2p+activity+is+independent+of+its+proteolytic+processing+into+a+soluble+transcription+activator.">The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator.</a> J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).</li><li>Abramova, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+controlling+expression+of+the+DAN/TIR+mannoprotein+genes+during+anaerobic+remodeling+of+the+cell+wall+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).</li><li>Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SREBP+Pathway+Responds+to+Sterols+and+Functions+as+an+Oxygen+Sensor+in+Fission+Yeast.">SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast.</a> Cell. 120 (6), 831-842 (2005).</li><li>Gaisne, M., B&#233;cam, A. M., Verdi&#232;re, J., Herbert, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;natural&amp;#34;+mutation+in+Saccharomyces+cerevisiae+strains+derived+from+S288c+affects+the+complex+regulatory+gene+HAP1+(CYP1).">A &amp;#34;natural&amp;#34; mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1).</a> Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data.">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--A+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>. R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: <a target="_blank" href="https://www.R-project.org">https://www.R-project.org</a> (2015)</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Brown, T., Mackey, K., Du, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+Northern+and+Slot+Blot+Hybridization.">Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).</li><li>Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).</li><li>Cherry, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+Genome+Database:+the+genomics+resource+of+budding+yeast.">Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast.</a> Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).</li><li>Hothorn, T., Everitt, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Handbook of Statistical Analyses using R. , (2014).</li><li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data.">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).</li><li>Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cluster+analysis+and+display+of+genome-wide+expression+patterns.">Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).</li><li>Davies, B. S. J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Role+for+Sterol+Levels+in+Oxygen+Sensing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).</li><li>Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+Recombination+is+Activated+at+Early+Time+Points+Following+Exposure+to+Cobalt+Chloride+Induced+Hypoxic+Conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).</li><li>Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Snf7p+and+Rim101p+in+the+transcriptional+regulation+of+TIR1+and+other+anaerobically+upregulated+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).</li><li>Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chromatin+and+Transcriptional+Landscape+of+Native+Saccharomyces+cerevisiae+Telomeres+and+Subtelomeric+Domains.">The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains.</a> Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).</li><li>Collart, M. A., Oliviero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+yeast+RNA.">Preparation of yeast RNA.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).</li><li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+FASTQ+data+with+Galaxy.">Manipulation of FASTQ data with Galaxy.</a> Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).</li><li>Martini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=timeClip:+pathway+analysis+for+time+course+data+without+replicates.">timeClip: pathway analysis for time course data without replicates.</a> BMC Bioinf. 15, (2014).</li><li>Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+series+expression+analyses+using+RNA-seq:+a+statistical+approach.">Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach.</a> BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).</li></ol>

Dans cette étude, les taux d’ARNm pour tous les gènes a été mesurée au cours de l’hypoxie dans la levure S. cerevisiae. Le but était d’analyser les modifications de l’expression génique comment global en raison de la croissance dans un environnement contrôlé de près-anoxiques. Plusieurs mesures ont été prises pour s’assurer que la méthode décrite ici a été soigneusement contrôlées et reproductibles. Tout d’abord, les cellules sont exposées à un milieu hypoxique précisément défi...

Nombreux organismes réagissent à l’hypoxie ou faible O2, en modifiant l’expression de gène 1,2,3. Cette réponse aide les cellules à composer avec l’absence d’un substrat essentiel pour la respiration aérobie et plusieurs réactions de biosynthèse, mais aussi avec un changement redox état 4. Plusieurs études de microarray réalisées chez S. cerevisiae montrent que les taux d’ARNm de centaines de gènes changent en réponse à l’hypoxie 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. récemment, RNA-seq a été utilisée pour caractériser les modifications de l’expression génique au fil du temps au cours de l’hypoxie 13. Ici, les détails expérimentaux sont présentés et discutés.
L’hypoxie peut être atteint de diverses façons, chacune produisant un niveau différent d’O2. Ici, l’hypoxie a été créée par coulant continuellement ultra haute pureté N2 dans les fioles, qui abaisse [O2] dissous immédiatement avec des cinétiques reproductibles 10. Il est possible qu’il y a quelques O2 molécules qui contribuent au métabolisme et l’expression génique mais cet environnement est considéré comme très proche d’anaérobie. En l’absence d’O2, cellules de levure ne peuvent biosynthétiser hème, ergostérol et acides gras insaturés 4,12,14. Ainsi, des études antérieures ont inclus ces métabolites dans la culture de levure sans oxygène 5,10,15. Cependant, les nombreuses réponses hypoxiques sont médiés par l’épuisement de ces métabolites et ainsi reconstituer les renverse le gène hypoxique expression réponses 12,16. Afin d’imiter l’hypoxie naturel, ces métabolites n’ont pas été ajoutés à la presse. Le temps que les cellules ont été exposées à une hypoxie sans la présence de ces métabolites essentiels, il n’y avait aucune augmentation notable de la mort cellulaire (données non présentées), ni un stress prolongé réponse 13.
La réponse est également dépendante de la souche et son génotype. Les allèles des régulateurs connus des réponses hypoxiques 2sont particulièrement importants. L’arrière-plan de souche S288C est hautement souhaitée afin que les résultats peuvent être comparés aux autres études génomiques effectuées avec cette souche. Cependant, S288C contient un allèle de perte de fonction partiel des HAP1 gène 17, un régulateur transcriptionnel critique pour la réponse à l’hypoxie. Cet allèle a été réparé en S288C à l’aide d’un type sauvage la copie de la Σ1278b souche fond 11.
L’expression des gènes dépend fortement de l’environnement cellulaire. Ainsi, lorsque vous effectuez l’analyse d’ADN messagère de Génome-large, il est important de maintenir un environnement constant tout en variant d’un autre paramètre comme temps, relance ou génotype. Pour obtenir des résultats très reproductibles, considérer ces trois pratiques pour l’étude et tous ses réplicats biologiques ou techniques. Tout d’abord, la même experimenter(s) doit réaliser l’étude, étant donné que les pratiques techniques peuvent varient selon les expérimentateurs. En second lieu, le même lot d’ingrédients devrait servir dans les milieux de culture chaque lot a une composition légèrement différente qui peut affecter l’expression des gènes. Troisièmement, pour minimiser les effets du cycle cellulaire, chaque instant doit provenir des cellules asynchrones dans la phase logarithmique de croissance (1-2 x 107 cellules/mL).
Lorsque caractérisant une réponse complexe comme la réponse d’expression de gène à l’hypoxie, une évolution temporelle est avantageuse pour la détermination de la cinétique de divers événements. Des moments spécifiques doivent être choisis qui saisiront les changements majeurs de la réponse. Dans cette étude, les points dans le temps entre 0 et 4 h ont été observées, parce que les expériences passées ont révélé des changements très répandues dans l’expression des gènes au cours de cette période, 13.
Pour mesurer l’expression génétique global, RNA-seq a été utilisé 18,19. Cette méthode utilise le séquençage de prochaine génération pour déterminer l’abondance relative de transcription de chaque gène. Par rapport à l’analyse ADN microarray, RNA-seq présente une sensibilité plus élevée (pour détecter les transcriptions moins abondantes), une plus grande gamme dynamique (pour mesurer des changements plus importants le pli) et une reproductibilité supérieure (à fidèlement suivre l’expression des gènes au fil du temps). En règle générale, l’ARN cellulaire plus est ARN ribosomique tant de méthodes ont été développées afin d’enrichir pour spécifique RNA espèces 20. Ici, les perles de poly-T ont été utilisés pour purifier transcriptions d’ARNm contenant du poly-A, bien que les différents dans le commerce - kits de déplétion des ARNr disponibles pourraient également être efficaces pour l’enrichissement de l’ARNm.
Ici, la réponse d’expression de gène de S. cerevisiae à l’hypoxie a été caractérisée. Les cellules ont été exposés à une hypoxie et puis échantillonnés à huit points dans le temps (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 et 240 min). Pour confirmer la reproductibilité et de définir les transcriptions statistiquement modifiées, trois réplicats biologiques ont été effectuées. ARN a été extrait par rupture mécanique et de la purification de la colonne et ensuite traitée pour l’analyse de la RNA-seq. Le pipeline après séquençage est décrit et scripts de programmation sont fournies qui permettent la réplication exacte des analyses effectuées. Plus précisément, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, l’environnement statistique R 24et le DESeq2 le paquet de 25 ont été utilisés pour traiter les données de RNA-seq et d’identifier des 607 gènes qui changent de façon significative au cours de hypoxie. Analyse en composantes principales (ACP) et l’expression génique des répliques, a indiqué la reproductibilité de la technique. Clustering et heatmaps révèle cinétique d’expression de grande envergure, tandis que gene ontology (aller) analyse a montré que de nombreux processus cellulaires, comme la respiration aérobie, sont enrichis dans l’ensemble des gènes régulés par l’oxygène.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="973">
	<tbody>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:292px;">Enclosed dry incubator</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MaxQ 4000</td>
			<td style="width:380px;">Set at 30&#176;C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">Micro-analysis Filter Holder</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">XX1002530</td>
			<td style="width:380px;">25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125mL filtering flask</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">Strong vacuum</td>
			<td style="width:183px;">Edwards</td>
			<td style="width:119px;">E-LAB 2</td>
			<td style="width:380px;">The &#8220;house&#8221; vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">1000-mL flask</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">To act as vacuum trap.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">~2-foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in</td>
			<td style="width:183px;">Tygon</td>
			<td style="width:119px;">38TT</td>
			<td style="width:380px;">Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">High-pressure N2 gas tank</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">99.999% purity, &#62;1000psi, with a regulator and gas flow controller</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Autoclaved 500mL flask</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Autoclaved 250mL flasks</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Flask stoppers (size 6, two holes with 5mm diameter)</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">~25-cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm</td>
			<td style="width:183px;">Tygon</td>
			<td style="width:119px;">E-3603</td>
			<td style="width:380px;">One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Sterile filter discs</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">HAWP02500</td>
			<td style="width:380px;">25mm diameter, 0.45 &#181;m pore size, one for each time point</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:292px;">Sterile dH2O (~100mL)</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">1-mL cuvettes</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">For measuring OD600 (i.e., cell concentration)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">50-mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">One for each time point</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Clean and sterile tweezers</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">liquid nitrogen</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">For freezing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">acid-washed beads</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8772</td>
			<td style="width:380px;">Keep at 4&#176;C for lysing cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Qiagen RNeasy Mini Kit</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:380px;">For RNA column purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Qiagen RLT buffer</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">Prepare by adding 10&#181;L of &#946;-Mercaptoethanol per 1mL of RLT buffer, keep at 4C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mL collection tubes</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Buffer RPE</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Buffer RW1</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:292px;">DNase I stock and working solutions</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">79254</td>
			<td style="width:380px;">The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550&#181;L of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20&#176;C) in single-use aliquots (80&#181;L each). The stock solution should not be thawed and refrozen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Buffer RDD</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">included in the Qiagen DNase Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Ice cold 2-mL screw-cap tubes</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">For lysing cells during RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">bead mill homogenizer</td>
			<td style="width:183px;">Biospec Mini-Beadbeater-24</td>
			<td align="right" style="width:119px;">112011</td>
			<td style="width:380px;">Keep in cold room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Bacto Peptone</td>
			<td style="width:183px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">DF0118</td>
			<td style="width:380px;">for liquid YPD media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Bacto Yeast Extract</td>
			<td style="width:183px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">DF0886</td>
			<td style="width:380px;">for liquid YPD media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">glucose</td>
			<td style="width:183px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">D16</td>
			<td style="width:380px;">for liquid YPD media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Qubit assay tubes</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">Q32856</td>
			<td style="width:380px;">for measuring nucleic acid concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">Q32853</td>
			<td style="width:380px;">for measuring nucleic acid concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Quant-iTTM RNA Assay Kit</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">Q32855</td>
			<td style="width:380px;">for measuring nucleic acid concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Qubit Fluorometer</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">Q33216</td>
			<td style="width:380px;">for measuring nucleic acid concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Commercial electrophoresis system</td>
			<td style="width:183px;">Agilent</td>
			<td>Bioanalyzer 2100</td>
			<td style="width:380px;">for measuring nucleic acid quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Next-generation sequencer</td>
			<td style="width:183px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">HiSeq 2500</td>
			<td style="width:380px;">for sequencing libraries</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">automated liquid handling system</td>
			<td style="width:183px;">Wafergen</td>
			<td style="width:119px;">Apollo 324</td>
			<td style="width:380px;">for creating sequencing libraries</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">PrepX PolyA mRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:183px;">Wafergen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">400047</td>
			<td style="width:380px;">for isolating mRNA from total RNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit</td>
			<td style="width:183px;">Wafergen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">400039</td>
			<td style="width:380px;">for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:292px;">Barcode Splitter</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&#38;changeset_revision=e7b7cdc1834d</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Samtools, which includes the gzip command</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">http://www.htslib.org/download/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">Trimmomatic</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:292px;">Bowtie2 (installed before TopHat)</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">TopHat</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">HTSeq</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">R (installed before R Studio)</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">https://cran.rstudio.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:292px;">R Studio (free version)</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:380px;">https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mrna levels over time during the yeast s. cerevisiae hypoxic response

Des changements complexes dans l’expression des gènes véhiculent généralement une grande partie d’une réponse cellulaire. Chaque gène peut changer l’expression avec une cinétique unique comme le gène est régulé par l’horloge particulière de l’un des nombreux stimuli, signalisation des voies ou des effets secondaires. Afin de capturer le gène tout réponse d’expression à l’hypoxie chez la levure S. cerevisiae, RNA-seq analyse a été utilisé pour surveiller les niveaux de mRNA des gènes à des moments précis après l’exposition à l’hypoxie. L’hypoxie a été créée par la croissance de cellules de ~ 100 % N2 gaz. Ce qui est important, contrairement aux autres études hypoxiques, ergostérol et acides gras insaturés ne s’ajoutèrent aux médias parce que ces métabolites affectent l’expression des gènes. Points dans le temps ont été choisis dans la gamme 0 - 4 heures après l’hypoxie, car cette période capte les changements majeurs dans l’expression des gènes. À chaque point dans le temps logarithmique cellules hypoxiques ont rapidement filtré et congelés, limiter l’exposition au O2 et concomitant des changements dans l’expression des gènes. L’ARN total a été extrait des cellules et utilisé pour l’enrichissement d’ARNm, qui était ensuite convertie en ADNc. De cet ADNc, multiplexes bibliothèques ont été créés et huit ou plusieurs échantillons ont été séquencés dans une seule voie d’un séquenceur de prochaine génération. Un pipeline après séquençage est décrite, qui comprend le découpage de base qualité, lire la cartographie et de déterminer le nombre de lectures par gène. DESeq2 dans l’environnement de statistique R servait à identifier les gènes qui changent de façon significative à n’importe lequel des points temps hypoxique. Analyse de trois réplicats biologiques a révélé une reproductibilité élevée, gènes des cinétiques différentes et un grand nombre d’attendre O2-gènes régulés. Ces méthodes peuvent être utilisées pour étudier comment les cellules des divers organismes répondent à une hypoxie au fil du temps et adaptés pour étudier l’expression des gènes au cours d’autres réponses cellulaires.

L’évolution temporelle de l’hypoxie et l’analyse de la RNA-seq effectuées indépendamment de trois fois. Afin d’étudier la reproductibilité des trois répliques, données d’expression pour tous les gènes a été analysées à l’aide de l’analyse en composantes principales (ACP). La figure 2 montre comment les échantillons changent pendant les deux premières composantes principales, qui représentent 58,9 % de la variabilité. Cette analys...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response at JoVE.com

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Nous présentons ici un protocole utilisant RNA-seq pour surveiller les niveaux d’ARNm au fil du temps au cours de la réponse à l’hypoxie des cellules de S. cerevisiae . Cette méthode peut être adaptée pour analyser l’expression des gènes au cours de toute réaction cellulaire.

Mesurer les niveaux d’ARNm au fil du temps au cours de la levure s. cerevisiae réponse à l’hypoxie

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Cartographie génomique des interactions protéine-ADN avec ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Recherche

Génétique

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Détermination de l’emplacement chromosomique optimale pour un élément d’ADN chez Escherichia coli en utilisant une nouvelle approche induite par le Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification des informations codées par Gene Expression niveaux pendant la durée de vie Modulation sous large gamme diététique Restriction chez c. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Mesure de l’Expression des gènes dans les couches d’Aleurone orge bombardé avec un débit plus élevé

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Analyse en temps réel du facteur de Transcription Binding, Transcription, traduction et chiffre d’affaires pour afficher des événements mondiaux au cours de l’Activation cellulaire

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Mesurer les niveaux de l’exercice chez Drosophila melanogaster en utilisant le système tournant de Quantification à l’exercice (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Criblage de surexpression axée sur l’accouplement chez la levure

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Saccharomyces cerevisiae Métabolique marquage avec 4-thio-uracile et la Quantification des nouvellement synthétisé ARNm comme un Proxy pour l’activité de l’ARN polymérase II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

En utilisant en forme in Vitro et dans les cellules d’enquêter sur petites molécules a induit des changements structurels de l’ARN pré-messager

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Caractériser l’Histone modifications post-traductionnelles levure neurodégénératives Proteinopathy modèles

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...