Name: snap chip for cross-reactivity-free and spotter-free multiplexed sandwich immunoassays
Uploaded: 2017-11-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays at JoVE.com

Agradecemos o Dr. Rob Sladek para o uso dos auxiliares do inkjet. Reconhecemos o apoio final dos institutos canadenses para pesquisa de saúde (CIHR), as ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC), Instituto de pesquisa canadense de sociedade cancros e a Fundação do Canadá para a inovação (CFI). Obrigado D.J. suporte de uma cadeira de pesquisa do Canadá.

1. fabricação e armazenamento de fichas de snap <ol><li>método de transferência única ( Figura 1a) <ol><li>ponto táxi soluções contendo 400 µ g/mL anticorpos e glicerol 20% em tampão fosfato salino (PBS) para uma nitrocelulose (ou um vidro funcionalizado) slide de ensaio com um jato de tinta microarray spotter 13 em uma umidade relativa de 60% (1.2 nL para cada spot) com espaçamento de centro--800 µm. Certifique-se de que o slide é fixado sobre o conv...

<ol>
	<li>Mor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+protein+markers+for+early+detection+of+ovarian+cancer.">Serum protein markers for early detection of ovarian cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).</li><li>Nicolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensive+post-operative+follow-up+of+breast+cancer+patients+with+tumour+markers:+CEA,+TPA+or+CA15.3+vs+MCA+and+MCA-CA15.3+vs+CEA-TPA-CA15.3+panel+in+the+early+detection+of+distant+metastases.">Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases.</a> BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).</li><li>Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. 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M., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+analysis+of+38+proteins+during+the+progression+of+human+breast+tumor+in+mice+using+an+antibody+colocalization+microarray.">Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray.</a> Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).</li><li>Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+mixtures+of+14+hygroscopic+additives+to+improve+antibody+microarray+performance.">Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Multiplexed+Analyte+Quantification+Using+Peptide+Immunoaffinity+Enrichment+Coupled+to+Mass+Spectrometry.">Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).</li><li>Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Partitioned+Droplet+Array+on+Laser-Patterned+Superhydrophilic+Glass+Surface+for+Wall-less+Cell+Arrays.">Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays.</a> Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).</li><li>Lee, M. -. Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolizing+enzyme+toxicology+assay+chip+(MetaChip)+for+high-throughput+microscale+toxicity+analyses.">Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).</li><li>Fernandes, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+microarray+for+high-throughput+studies+of+stem+cell+fate.">Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).</li><li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-Eluting+Microarrays+for+Cell-Based+Screening+of+Chemical-Induced+Apoptosis.">Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).</li><li>Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microarray+Based+on+Superhydrophobic-Superhydrophilic+Patterns+for+Single+Cell+Analysis.">Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis.</a> Microarrays. 5 (4), 28 (2016).</li><li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Monitoring+of+Gene+Expression+Patterns+with+a+Complementary+DNA+Microarray.">Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray.</a> Science. 270 (5235), 467-470 (1995).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sandwiched+microarray+platform+for+benchtop+cell-based+high+throughput+screening.">A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening.</a> Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).</li></ol>

Neste trabalho, apresentamos uma tecnologia de chip de pressão que faz com que o livre de cross-reactivity multiplex imunoensaios amplamente disponíveis para os pesquisadores com configuração básica experimental. Diferente da existente Microarrays do anticorpo, nenhum observador microarray é necessária para os usuários finais. Tanto single e double métodos de transferência são demonstrados e transferência dupla oferece precisão de alinhamento superior para ~ 40 μm para manchas de 98%, com o maior desalinham...

Um painel de biomarcadores, compreendendo várias proteínas pode fornecer maior sensibilidade e especificidade do que um único biomarcador no diagnóstico de doenças complexas como câncer1,2. O ensaio imunoenzimático (ELISA) tem sido a padrão-ouro tecnologia utilizada em laboratórios clínicos, alcançar um limite de detecção em baixa pg/mL no plasma, mas os limites para um destino por ensaio3,4,5. Os microarrays do anticorpo foram desenvolvidos para acomodar milhares de ensaios miniaturizados conduzidas em paralelo em um microscópio único slide6,7,8. No entanto, a capacidade de multiplexação desse método é limitada pela reactividade cruzada orientada no reagente, decorrentes da aplicação de uma mistura de dAbs, e torna-se mais problemático com um número crescente de destinos9,10 , 11. Pla et al. afirmaram que a vulnerabilidade resultante de um ensaio de sanduíche multiplex dimensiona como 4N(N-1) onde N é o número dos alvos12.
Para atenuar a reactividade cruzada em Microarrays do anticorpo, o anticorpo colocalization microarray (ACM) foi desenvolvido em nosso laboratório para ensaio de sanduíche multiplex12. Anticorpos de captura (táxis) estão manchados em uma carcaça com um localizador de microarray. Após bloqueio amostras são aplicadas na superfície, e então pinceladas individuais são avistadas nos mesmos pontos com o complexo antígeno-táxi. Todos os cenários de reactividade cruzada entre antígenos e anticorpos podem ser atenuados com ACM, e limites de detecção em pg/mL foram alcançados. No entanto, o protocolo de ensaio requer preparação e manchando os dAbs durante os experimentos usando um localizador de microarray no local com alta precisão para efeito de alinhamento, que é caro e demorado, limitando a ampla aplicação desta tecnologia na outros laboratórios. Um ACM portátil, chamado snap chip foi desenvolvido para cross-reactivity-free e livre de observador multiplex sanduíche imunoensaios13,14,15. Táxis e pinceladas são pre-manchadas em um slide de ensaio e um slide de transferência respectivamente em formato de microarray e armazenadas. Durante o ensaio, os slides são recuperados e um microarray de pinceladas são transferidos coletivamente para o slide de ensaio simplesmente estalar dois chips juntos. Um aparelho de pressão é usado para transferência fiável de reagente. Slides de nitrocelulose revestido com uma capacidade de ligação do anticorpo relativamente grande têm sido usados como os slides de ensaio para absorver as gotas de líquido e, assim, facilitar a transferência de reagente, no entanto, os slides são mais caros que microarray e corrediças de vidro normal os scanners compatíveis com lâminas transparentes são necessários para a aquisição do sinal.
Neste trabalho, vamos demonstrar o protocolo da realização de um imunoensaio sanduíche multiplex com um chip de snap. Um aparelho de pressão romance foi desenvolvido para transferência de reagente mais conveniente e confiável de microarray-para-microarray. Importante, aqui nós temos estabelecido o método de transferência de reagente para lâminas de vidro normal com o chip de snap. 1024 pontos com êxito foram transferidos e alinhados numa lâmina de vidro, ampliando significativamente o uso desta tecnologia na maioria dos laboratórios.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5246501EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-conjugated Cy5</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>s000-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>p1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer</td>
			<td>SurModics, Inc</td>
			<td>SG02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose coated slides</td>
			<td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td>
			<td>305116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosilane coated slides</td>
			<td>Schott North America</td>
			<td>1064875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap Device</td>
			<td>Parallex BioAssays Inc.</td>
			<td>PBA-SD01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkjet microarray spotter</td>
			<td>GeSiM</td>
			<td>Nanoplotter 2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide module gasket</td>
			<td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td>
			<td>204862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Stabilization Beads</td>
			<td>Parallex BioAssays Inc.</td>
			<td>PBA-HU60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Array-Pro Analyzer software</td>
			<td>Media Cybernetics</td>
			<td>Version 4.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microarray scanner</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>SureScan Microarray Scanner</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biostatistics software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>GraphPad Prism 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglin capture antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglin protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1097-EN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglin detection antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BAF1097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6a (see Table 1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6b (see Table 1)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

snap chip for cross-reactivity-free and spotter-free multiplexed sandwich immunoassays

Multiplexado proteína análise mostrou sensibilidade diagnóstica superior e precisão em comparação com proteínas única. Os microarrays do anticorpo permitem milhares de micro escala imunoensaios executados simultaneamente em um único chip. Formato de ensaio sanduíche melhora a especificidade do ensaio, detectando cada alvo com dois anticorpos, mas sofre de reactividade cruzada entre reagentes, limitando assim a sua capacidade de multiplexação. Anticorpo colocalization microarray (ACM) foi desenvolvido para a deteção de proteínas multiplexado cross-reactivity-livre, mas requer um caro observador no local para a fabricação de microarray durante os ensaios. Neste trabalho, vamos demonstrar uma tecnologia de chip de snap que transfere o reagente de microarray-para-microarray por simplesmente tirando dois chips juntos, que assim, nenhum observador é necessária durante a incubação da amostra e posterior aplicação de anticorpos de deteção (dAbs) em cima armazenamento de slides pre-manchados, dissociando a preparação de slide da execução do ensaio. Ambos os métodos de transferência de simples e duplas são apresentados para atingir o alinhamento exato entre os dois microarrays e a fabricação de slide para ambos os métodos são descritos. Os resultados mostram que &#60; 40 μm alinhamento foi conseguido com dupla transferência, atingindo uma densidade de matriz de 625 pontos/cm2. Um imunoensaio 50-plexed já foram realizado para demonstrar a facilidade de utilização do chip snap na análise de proteína multiplexado. Limites de detecção de 35 proteínas estão no intervalo de pg/mL.

O procedimento de ensaio para single e double métodos de transferência é mostrado na Figura 1. Na única transferência, os táxis são vistos diretamente no slide do ensaio e as pinceladas são transferidas para o slide de ensaio mediante a utilização de um padrão de espelho dos táxis (Figura 1a). Procedimento de transferência apenas uma é necessário, mas este método sofre de desalinhamento entre os dois microarrays, ...

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Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

Vamos demonstrar uma tecnologia de chip de snap para a realização de imunoensaios sanduíche multiplexado cross-reactivity-livre simplesmente estalar dois slides. Um aparelho de pressão é usado para transferência fiável de reagentes de microarray-para-microarray. O chip de pressão pode ser usado para qualquer reações bioquímicas que exigem colocalization de diferentes reagentes sem contaminação.

Snap o Chip para imunoensaios livre de Cross-reactivity e Spotter sanduíche multiplexado

Multiplexed protein analysis has shown superior diagnostic sensitivity and accuracy compared to single proteins. Antibody microarrays allow for thousands ...

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