Name: generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00
Duration: 6 min 24 s
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经济科学中心的科学活动在北威州-Strategieprojekt BioSC (No. 313/323-400-002 13) 框架内由创新、科学和研究部资助。作者感谢北莱茵-威斯特伐利亚和 Heine 大学的创新、科学和研究部, 在 CLIB 研究生集群工业生物技术领域获得了 Freier 的奖学金。从德国亥姆霍兹协会的 "亥姆霍兹创新实验室" 的 "授权空间计划" 中获得了进一步的资金支持 "微生物生物实验室--亥姆霍兹创新实验室"。

作者没有什么可透露的。

所提出的协议的一般性质允许各种适应,例如, 用于研究其他微生物表达式主机9,47,48,49,50,51, 或优化目标蛋白的其他属性, 如糖基化模式或二硫化物键。该议定书也可能需要适应现有的实验室设备。MBR 系统的集成允许增加实验吞吐量, 从而节省了大量时间。然而, 当用 MBR 系统替换完全检测和可控的生物反应器时, 结果的可伸缩性必须考虑8、37、52、53。使用 DOE 方法和数学建模有助于通过有效的实验规划和基于模型的数据解释15, 将测量数据的信息内容与所研究的目标54最大化。
对方法的修改 在这项研究中使用的多用途和可扩展的机器人液体处理系统旁边, 应该提到的是, 有几个较小的可供商业使用的液体处理系统, 它们能够执行这项任务, 并且可以放在层流工作台。如果没有自动移系统, 则根据 DOE 计划的不同媒体组合也可以通过使用单声道和/或多渠道管的手动移实现。由于手工准备更容易出错, 并且需要高度集中的工作很长一段时间, 建议准备较低数量的不同媒体组合。
根据被雇用的 MBR 系统的能力, 相应的耕种协议将变化。例如, 如果没有在线测量生物量的形成, 它可能就足以在生长试验完成后测量生物量的浓度。与 pH 值和溶解氧的在线监测相结合, 在几个 MBR 系统中实现, 可以安全地确定生长饱和度。原则上, 生长实验可以进行台胞单独放置在震动孵化器内, 而不使用一个 MBR 系统。在这种情况下, 必须确保适当的耕作条件: (1) 使用适当的几何台胞, 结合适当的震动频率和震动直径, 可以避免氧气有限的耕作,例如, 正方形96或24深井板操作在1000转每分钟在3毫米投掷或在250转每分钟在25毫米投掷, 分别。重要的是, 可实现的最大氧转移率越低, 主要碳源的浓度越低。如上所述, 在本研究中, 10 克/L 葡萄糖的使用适合于防止受雇的耕作条件的氧气限制;(2) 对生物量和产品定量的中期培养的抽样应减少到最低限度。每次将中期计划从摇箱中移除时, 氧气转移会立即分解, 从而导致不利的耕作条件;(3) 作者认为, 不建议使用中期计划读者作为培养设备, 因为这些设备不是为此目的开发的。例如, 振动力学是为偶尔混合板后的试剂添加, 因此, 往往缺乏鲁棒性长期连续晃动持续数天。此外, 这些读者无法实现微生物培育所需的足够功率输入。光密度读数在短时间间隔内的积分需要停止震动运动, 从而导致重复的氧限制周期。此外, 这种系统在长时间耕作期间的蒸发会扭曲结果。有关使用台胞进行微生物培育的令人惊讶的复杂主题的详细信息, 读者可以参考引用的文献22,23,24,25,26和其中的引用。
进一步考虑 为了加速迭代优化步骤, 建议仔细选择产品量化的分析方法。由于迭代实验设计策略容忍实验误差, 因此, 快速、简单的方法应以精度和精确度为代价。然而, 最终的结果必须得到验证, 以充分准确和准确的产品量化方法, 可能会更复杂。一般来说, 仔细的评估和决策的研究程序需要努力在开始的研究, 但长期支付, 在常规的方法已经建立。
强烈建议定义一个参照实验, 它与在优化过程中的所有实验进行比较。即, 所应用的介质成分浓度和测量输出均通过参考值进行归一化。这样, 每个应用和测量值都可以被解释为参考值的 x-fold。考虑到板块之间的变化, 每个板块都进行五参考实验。度量结果的平均值用于规范化。
一般不保证所开发的培养基对其他菌株也是最佳的。然而, 改良后的培养基也很可能适合培养具有小遗传差异的表达菌株,例如, 当产生由诱变研究获得的单一氨基酸替代品的酶变体时 (虽然单点突变已被描述为影响细胞代谢和外源表达性能55,56)。在这种情况下, 所提出的协议可以是第一步, 其次是高通量表达式筛选的协议57。如果协议被用于中等发展与随后扩大到哺养的分批耕种, 优选的媒介应该被核实为对应的生物条件, 当克隆筛选运动在微尺度辨认了不同的顶端执行者为不同的哺养的战略和耕种媒介52,58。此外, 引入的 KriKit36通常可以促进改进的整体生物优化。直到最近, 工具能力也被扩展到支持多目标优化40, 这对于优化上游和下游进程都很重要59,60。

现代重组基因技术能够广泛应用于制药工业、动物饲养、有机化学和食品加工等各种用途的技术酶1,2,3。大量生产技术酶是工业生物技术和优化重组蛋白生产的重要课题, 需要应变和生物工程。为产生高效的工程生产菌株, 可提供不同的遗传库,例如, 用于平衡基因表达式4或提高分泌效率5。
杆菌谷氨酸是一个主要的氨基酸生产者在工业规模的6,7和代表一个有吸引力的非常规表达载体的分泌生产重组蛋白8 ,9。一般分泌 (Sec) 和双精氨酸易位 (达) 通路均存在于C. 谷氨酸中, 并成功应用于重组蛋白分泌物10。广泛的经验, 在生物工程的氨基酸生产在工业规模, 以及能力分泌蛋白质的 g/L 金额11和强大的鲁棒性有关生物均匀发现大规模培育12,13, 使C. 谷氨酸成为在工业规模上分泌生产异源蛋白质的有前途的平台有机体。
营养培养基优化是已知的以微生物系统改善重组蛋白的生产14,15,16,17 , 因此, 介质的调整组合是在生物开发方面的一个值得一步, 关于最佳生产率18,19,20,21。孔板 (台胞) 在微生物培养中的应用研究22,23,24为微生物培养台胞的开发和设计铺平了道路25 ,26和开发具有在线监视和环境控制的 MTP-based microbioreactor (MBR) 系统27,28。MBRs 能显著提高实验培养的产量。此外, MBR 系统从其他类型的生物反应器,例如, 气泡柱或搅拌槽反应器, 可用于微生物生物优化29,30,31, 32。
一般而言, 优化研究得益于增加的实验吞吐量, 这与 DOE 的方法结合起来更加强大, 例如评估设计变量之间的交互或减少高维搜索空间。因此, MBR 系统、实验室自动化和 DOE 的联合使用证明是生物技术中的一种强有力的方法8,16,33,34,35。
本文将先进的实验室自动化、MBR 技术与在线过程监控、Kriging-based 数据分析/实验设计相结合, 提出了一种媒体优化协议。克里格方法是在 MATLAB 工具箱 ("KriKit") 中实现的, 它可以下载并免费使用36。以应用实例为例, 通过优化 CgXII 最小介质的组成, 展示了利用C. 谷氨酸分泌的绿色ﬂuorescent 蛋白 (GFP) 的生产。选用 GFP 滴度作为最优化的目标, 可以方便地进行量化, 并广泛应用于 MBR 系统的模型蛋白质研究37,38,39。
所介绍的框架分为四步骤, 如图 1所示。这些步骤由方框框表示, 对应于协议的各个部分。第一步 (图 1A) 是定义项目目标并确定所需的方法。DOE 方法学、MBR 技术和实验室自动化的结合使得实验吞吐量增加, 需要强大的数据处理能力。第二步 (图 1B) 旨在检测对优化目标有很高影响的敏感设计变量 (即、中等组件)。这导致了设计变量的数量减少的利益。第三步 (图 1C) 包括一个迭代优化, 用于更详细地调查剩余的设计变量与感兴趣的目标之间的函数关系。利用逐次扩展的数据集, 应用克里格方法对未测地点的实验结果进行预测。当克里格模型预测到一个最优或高精度时, 迭代周期就会停止。在第四步 (图 1D) 中对结果进行了验证, 并开始对确定的最佳值进行进一步的灵敏度分析。如果最初, 不敏感的组件被发现在最佳区域也不敏感, 在第三步的迭代优化过程中假设这是正确的, 这是合理的。然后, 建议通过应用正交试验方法, 如活性分析或 SDS 页, 对优化结果进行验证。
所提出的协议的一般性质, 允许易于适应不同的实验室设备, 其他表达主机, 和目标蛋白的选择, 以及进一步的生物变量, 如 pH 值或培养温度。此外, 其他优化目标, 如蛋白质的生产率, 特定的产量, 或产品质量可以选择, 以适应范围的其他优化研究。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
图 1: 优化研究的工作流程.四帧框对应于协议的各节, "构思方法的研究和定义" (第1节), "灵敏度分析" (第2节), "迭代优化" (第3节) 和 "验证" (第4节)。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioLector</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>G-BL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowerplate</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>MTP-48-BOH</td>
			<td>For cultivation in the BioLector device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing foil</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>F-GP-10</td>
			<td>Sterile sealing for Flowerplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>2016b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KriKit</td>
			<td>Forschungszentrum J&#252;lich</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Freely available, MATLAB installation required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus pipetting robot</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Includes &#34;WinPrep&#34; software installation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-column deep well microplate</td>
			<td>E&#38;K Scientific</td>
			<td>EK-2034</td>
			<td>Container for medium stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplates, transparent, F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td>For Bradford protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;clear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655087</td>
			<td>For flourescence measurement in cell-free supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Research&#160;plus multi-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Facilitates manual liquid handling with microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruPAG&#160;Precast Gels</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCG2002</td>
			<td>For SDS-Page analysis of cell-free supernantants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&#8211;42 (2007)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology

工业生物技术的核心业务是利用微生物生产细胞工厂, 是应变工程的迭代过程和生物条件的优化。一个重要的方面是改善培养培养基, 为微生物形成的利益的产品提供一个最佳的环境。这是公认的媒体组成可以戏剧性地影响整体生物性能。营养培养基优化是已知的, 以改善重组蛋白生产与微生物系统, 因此, 这是一个值得一步的生物发展。然而, 通常标准的媒体食谱是取自文学, 因为 tailor-made 设计的培养介质是一个繁琐的任务, 要求 microbioreactor 技术, 以充分的种植吞吐量, 快速产品分析, 以及支持通过实验室机器人, 使液体处理步骤的可靠性。此外, 还需要有先进的数学方法来合理地分析测量数据, 并有效地设计并行实验, 以达到最佳的信息内容。
所提出的协议的一般性质允许容易适应不同的实验室设备, 其他表达主机, 和目标蛋白的兴趣, 以及进一步的生物参数。此外, 其他优化目标, 如蛋白质的生产率, 特定的产量, 或产品质量可以选择, 以适应范围的其他优化研究。应用的克里格工具箱 (KriKit) 是一个通用的工具设计的实验 (DOE), 有助于改进整体生物优化。它还支持多目标优化, 这对于优化上游和下游进程都是非常重要的。

引入的协议, 以最大限度地提高分泌 GFP 的效价。具体而言, 选择 17 h 培养后的 GFP 效价作为优化目标。在线荧光检测 GFP 允许简单的产品量化。然而, 从参考培养数据中获得 GFP 信号的规范化是确保结果的重现性和可比的必要条件。如1节所述, 对媒体组成部分的预选是在合理基础上进行的。根据1节的说明进行了实验: 为整个研究确定了湿实验室程序的参数, 以确保结果的一致性和重现性。
如2节所述, 进行了初步筛选, 以确定有关的成分对进一步、更详细的研究的优化目标有重大影响。MTP-based MBR 系统允许48实验并行执行。考虑到在一个中期计划 (48) 上最大可能的并行实验次数和媒体组件 (11) 的总数, 使得 2IV11-6小数设计成为一个合适的选择。该实验设计包括32实验, 并允许对每一个被调查的媒体组件的主要效果的估计。其余的培养井 (16) 用于多次复制的实验与参考介质, 以评估再现性和位置效应。即, 每个实验进行一次 (没有复制), 除了参考实验 (五复制)。
表 1总结了筛选分析的结果。在被考虑的集中范围, 变化多数媒介组分没有显示对目标的一个引人注目的作用。组件 NH4+显示了强烈的负面影响, 而 Ca2 +和 Mg2 +显示了最强的正向趋势。Mg2 +对当前浓度范围的影响并不显著, 但可能是因为浓度范围更广。因此, 决定从介质中省略 NH4+ , 并在进一步的实验中研究 Ca2 +和 Mg2 +的效果。
3节描述了用于最大化 GFP 荧光信号的迭代优化过程, 同时改变了 Ca2 +和 Mg2 +的浓度。在迭代1中, 测试了可以省略 NH4+的假设。筛选分析采用了 Ca2 +和 Mg2 +的浓度范围。将 NH4+的最小浓度设置为零, 并从筛选实验中采用最大浓度。在下面的实验中, 组分浓度分布在 3 x 3 x 3 格栅内的定义浓度范围, 导致27实验。在所有的耕种过程中, 都包括了五复制的参考培养基, 作为内部标准, 并确保没有在中期计划的位置影响发生。对于余下的16口井, NH4+、Ca2 +和 Mg2 +的浓度在给定范围内随机分布。
图 5A可视化第一次迭代的结果。轴标签指的是原始参考介质中使用的成分浓度, 由 x Ref. 表示蓝色曲面表示使用 KriKit 软件计算的克里格插。每个曲面与 NH4+ (深蓝色: 0 x ref, 方格: 1 x ref, 浅蓝色: 2 x ref) 的相对浓度水平相关联。这种可视化表示形式表明, 省略 NH4+是有利的。插值曲面还显示了 Mg2 +和 Ca2 +的正面效果, 因为所有的平面都随着浓度的增加而上升。
根据迭代1的结果, 决定将 Ca2 +和 Mg2 +的浓度范围扩大一倍, 并将实验设计窗口移到右上角, 请参阅图 5B. 在这个范围内, 浓度分布在 6 x 6 的网格上。这保证了均匀分布在充分的集中范围, 导致最佳的克里格插值结果。图 5B显示基于两次迭代 (红点和黄色正方形) 中的组合数据的克里格插值图。对于两者, Ca2 +和 Mg2 +, 增加其浓度的积极作用继续。因此, 该过程通过加倍的最大浓度重复, 从而, 实验设计窗口的移动, 以探索的边界右上角。
图 6A提供了剩余优化过程的概览。对迭代3所收集的数据的分析显示了 mg2 +的正效应的限制,即, 确定了 mg2 +的最佳浓度范围。因此, 决定只为 Ca2 + (迭代 4) 进一步扩展集中范围。此过程重复了两次 (迭代5和 6), 直到发现了 GFP 信号的饱和度。这种饱和度是由钙盐的沉淀所解释的, 适用浓度为 ca2 +, 这些单元格不可用。
由于实验结果总是被噪声干扰, 由此产生的克里格插值出现不规则和目视检查可能导致错误的结论。然而, 通过统计的z测试, 可以可靠地识别出饱和 GFP 信号的培养基组分的最佳浓度范围, 并在 KriKit 中实现。z测试直接使用克里格方法提供的内部统计信息,即即、预测值和预测不确定性。图 6B显示已标识的高原, 使用 KriKit 工具箱确定和可视化。KriKit 工具箱是免费提供的36 , 并附带了详细的教程, 说明如何使用其功能。
如果找到两个以上的相关组件, 3 d-可视化达到其极限。KriKit 提供了其他几种可能的可视化表示方法, 如电影或 "筛选情节"。如果潜在的优化位于定义的浓度范围内, 则将使用预期的改进4046自动设计新的实验。基于期望改进的实验设计集成在 KriKit 工具箱中。在软件文档中可以找到更详细的信息。
在迭代过程之后, 对结果进行了验证, 如第 D 部分所述。通过使用最佳介质组成进行附加灵敏度分析, 对初始假设的有效性进行了检验。即, 所有的初始媒体组件的兴趣是不同的, 但 Ca2 +和 Mg2 +被设置为其最佳浓度水平。在本研究中, 选择了最佳浓度 = 32 x ref 和 = 6.8 x ref. <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg">表 2显示验证筛选的结果。与初始灵敏度筛选类似 (cf 表 1), NH4+仍有显著的负面影响, 剩余的影响仍然可以忽略不计。
由于容易获得, 从培养悬浮液中的 gfp 荧光信号被用来量化的细胞外 gfp 的效价在所有的实验。为了验证的原因, GFP 荧光验证了其他测量。由于 gfp 是通过达通路分泌的, 荧光信号不能区分和胞外 gfp。因此, 利用参考介质和优化培养基对栽培进行了复制。除了荧光测量从无细胞培养清, 蛋白质含量是量化的布拉德福德检测和 (半) 定性 GFP 改善可视化 SDS 页15。与参考介质相比, 所得到的优化培养基的所有结果测量信号大约为两倍, 并验证了优化培养基分泌性能的大约100% 的改善。因此, gfp 特异荧光的培养悬浮可以被认为是一个合适的指标的优化目标,即, 胞外 gfp 滴度。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
图 2: 从卷移列表中进行敏感度分析的屏幕快照.第一列中的条目为一行的所有卷分配唯一标识符;此标识符是在液体处理程序工作台上的目标培养计划的中期计划井号,参见图 4C。剩余的列为不同的解决方案 ("Sln-01" 到 "Sln-15") 编码卷以 pipetted。一排的累计容积对应于相应井的最终栽培量。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
图 3: 从液体处理控制软件 "WinPREP" 中截屏.左: 行顺序命令, 包括每个股票解决方案的转移命令 pipetted。在接种添加的最后一个命令之前, 将插入一个用户提示, 以确保种子区域性刚好放在表中。右: 工作台的示意图, 包括变异种群的源实验室 (两个深孔板, 有12柱状井), 用于休息库存的试剂槽, 水和接种, 以及培养基制备靶向培养中期计划。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
图 4: 为库存解决方案的移设置详细截图的编译.(A) 移铁库存的非包装命令。在工作台上用相应的深井板的读框和红柱标记出源实验室和源井。目标实验室和目的井内的标志是蓝框周围和蓝水井的靶培养中期计划。(B) 有关此步骤 (Fe 库存解决方案) 的移卷分配的详细示例视图。从具有48行的移列表中读取目标的数量。移列表中的4栏中找到了所有用于 Fe 库存解决方案的目的井的免除量。请注意, 移列表中的第一列包含标识符, 而不是要传输的卷, 请参见图 2。(C) 有关目标井编号的详细信息。在相应的移列表的行 #1 中写入的卷将 pipetted 为 #1 等标记。井 #01, #08, #41 和 #48 对应于井 A01, A08, F01 并且 F08 为α数字编码, 也打印入耕种中期计划本身。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
图 5: 第一次迭代的详细结果.(A) 基于迭代1的实验数据的克里格插值。红色点表示数据集。为比较, 所有三插值表面是堆在一个情节 (深蓝: 0 x 参考, 格子: 1 x 参考, 浅蓝色: 2 x 参考)。可以在其他15中找到结果的替代表示形式。(B) 克里格插值基于在迭代 1 (红点) 和迭代 2 (黄色正方形) 中执行的实验。此图中显示的部分数据以前已发布15。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
图 6: 迭代收集的优化结果的描述.(A) 最后的克里格模型预测。(B) 基于统计的z测试的最佳区域 (red) 的统计标识 (由 KriKit 提供)。方框表示迭代设计和实验执行的连续步骤。此图中显示的部分数据以前已发布15。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组件</td>
			<td>归一化系数均值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>锰2 +</td>
			<td>-0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>0.06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1: 灵敏度分析的结果.系数值表示平均效果时, 增加各自的媒体组件集中从它的中心值, 以其最大值。对于最优化的实验设计, 如标准文献中所示, 标准偏差直接表现为参考实验的复制所引起的实验变化。系数值由最大值 (0.0422 用于组件 Ca2 +) 进行规范化。归一化和绝对系数标准差分别为0.54 和0.0226。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组件</td>
			<td>归一化系数均值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>锰2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>0.69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2: 最终灵敏度分析的结果.系数值表示平均效果时, 增加各自的媒体组件集中从它的中心值, 以其最大值。由于采用了最佳的实验设计, 标准差只取决于实验的变化, 采用优化的介质组成。实验变异比使用参考介质的变异略有增加。系数值由最大值 (0.0106 用于组件锰2 +) 进行规范化。归一化和绝对系数标准差分别为3.63 和0.0385。

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Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

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