Name: generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

De videnskabelige aktiviteter af Bioeconomy Science Center blev økonomisk støttet af Ministeriet for Innovation, videnskab og forskning som led i NRW-Strategieprojekt BioSC (nr. 313/323-400-002 13). Forfatterne takke Ministeriet for Innovation, videnskab, og forskning i Nordrhein-Westfalen og Heinrich Heine Universitet Düsseldorf for et stipendium til Lars Freier inden for CLIB-kandidat klynge industriel bioteknologi. Yderligere finansiering blev modtaget fra aktivering rum Program "Helmholtz Innovation Labs" af tyske Helmholtz Association til at støtte den "mikrobiel bioproces Lab – A Helmholtz Innovation Lab".

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Den generiske karakter af præsenteres protokollen tillader forskellige tilpasninger, f.eks.for at studere andre mikrobielle udtryk værter9,47,48,49,50, 51, eller at optimere andre egenskaber af target proteinet, ligesom glykosylering mønster eller disulphide obligationer. Protokollen skal muligvis også tilpasses til den tilgængelige lab udstyr. Integration af en MBR system giver mulighed for øget eksperimentelle overførselshastighed, som giver mulighed for store besparelser i tid. Dog, når du udskifter fuldt instrumenterede og kontrollerbar bioreaktorer af MBR systemer, skalerbarhed af resultater skal tages i betragtning8,37,52,53. Brugen af DOE metoder og matematisk modellering hjælper med at maksimere informationsindhold måleresultater, for så vidt angår de studerede objektive54 af effektiv eksperimentelle planlægning og model-baserede data fortolkning15.
Ændringer til metoden Ved siden af multi-purpose og udvidelige robot flydende håndteringssystemer som den, der anvendes i denne undersøgelse, bør det nævnes at der er flere mindre væske håndteringssystemer kommercielt tilgængelige som er i stand til at udføre denne opgave og kan placeres inde i af laminar flow arbejde bænke. Hvis ingen automatiserede pipettering system er tilgængelig, kan forskellige medier kompositioner planmæssigt DOE også realiseres ved manuel pipettering ved hjælp af enkelt og/eller multi-kanal pipetter. Da den manuelle forberedelse er mere fejlbehæftet og vil kræve meget fokuseret arbejde i ganske lang tid, anbefales det at forberede et lavere antal forskellige medier kompositioner.
Afhængigt af den erhvervsdrivende MBR system egenskaber vil tilsvarende dyrkning protokollen variere. For eksempel, hvis nogen online måling af biomasse dannelse er tilgængelig, kan det være tilstrækkeligt at måle biomasse koncentration efter afslutningen af vækst eksperiment. I kombination med online overvågning af pH og oploest ilt, som er gennemført i flere MBR systemer, vækst mætning kan bestemmes sikkert. I princippet kan vækst eksperimenter foretages i MTPs alene placeret inde ryster væksthuse, uden brug af en MBR system. I dette tilfælde korrekt dyrkning betingelser skal sikres: (1) ilt-limited udlæg til planteavl kan undgås ved hjælp af MTPs med passende geometrier, i kombination med ordentlig ryster frekvenser og ryster diametre, fx, pladsen 96 eller 24 dyb godt plader drives ved 1000 rpm på 3 mm kaste eller på 250 rpm på 25 mm kast, henholdsvis. Vigtigere, jo lavere overførselshastighed kan opnås maksimal ilt, jo lavere vigtigste CO2-kilde skal være koncentreret. Som nævnt ovenfor, for denne undersøgelse, var anvendelse af 10 g/L glucose egnet til at forhindre ilt begrænsning for de erhvervsdrivende dyrkning betingelser; (2) prøveudtagningen MTP kulturer for biomasse og produkt kvantificering bør reduceres til et minimum. Hver gang MTP er fjernet fra ryster rugemaskine ilt overførsel vil straks opdeling som kan resultere i ugunstige dyrkning betingelser; (3) i udtalelsen fra forfatterne, er brugen af MTP læsere som dyrkning enheder anbefales ikke som disse enheder ikke er udviklet til dette formål. For eksempel, ryster mekanik blev bygget for lejlighedsvise blanding af mikroplader efter reagens tilsætning og ofte mangler derfor, robusthed for langture af kontinuerlig ryster varig for dage. Derudover kan ikke tilstrækkelig power input, der kræves for mikrobiel udlæg til planteavl realiseres i disse læsere. Integrationen af absorbansaflæsningerne i korte tidsintervaller kræver standsning af de rystende bevægelse, resulterer i gentagne perioder af ilt begrænsning. Derudover vil fordampning i sådanne systemer over lange dyrkning perioder fordreje resultater. For flere detaljer om den overraskende kompleks emne på ved hjælp af MTPs for mikrobiel udlæg til planteavl, henvises læseren til at de citerede litteratur22,23,24,25,26 og referencer heri.
Yderligere overvejelser At speed-up iterativ optimering trin anbefales det at omhyggeligt vælge analysemetode for produkt kvantificering. Hurtige og enkle metoder bør foretrækkes på bekostning af præcision og nøjagtighed, da iterative eksperimentelle design strategi tolererer eksperimentelle unøjagtighed. Dog skal de endelige resultater kontrolleres mod tilstrækkeligt præcise og nøjagtige produkt kvantificering metoder, der kan være mere kompliceret. I almindelighed, omhyggelig vurdering og beslutningstagning om undersøgelse procedurer kræver indsats i begyndelsen af undersøgelsen, men betale i det lange løb efter rutinemetoder har opstillet.
Det anbefales stærkt at definere en reference eksperiment, der er i forhold til alle eksperimenter under optimeringen. Det vil sige, er den anvendte medium komponent koncentrationer samt målte output normaliseret via dividere med referenceværdier. På denne måde, hver gælder og målte værdi kan fortolkes som x-fold af referenceværdien. For at tage til variationer mellem pladerne, udføres fem reference forsøg på hver plade. Middelværdien af de målte udfald bruges til normalisering.
Det kan generelt ikke garanteres, at den udviklede medium er også optimal til andre stammer. Dog vil forbedret medium højst sandsynligt også være passende til at dyrke udtryk stammer med små genetiske forskelle, f.eks., når producerer enzym varianter med enkelt aminosyre udskiftninger opnået fra mutagenese undersøgelser ( Selvom endnu enkelt punkt mutationer har betegnet effekt cellulære metabolisme og Heterolog ekspression ydeevne55,56). I dette tilfælde kan den præsenteres protokol være et første skridt, efterfulgt af protokoller for høj overførselshastighed udtryk screeninger57. Hvis protokollen bruges til mellemstore udvikling med efterfølgende opskalering til fed-batch udlæg til planteavl, bør optimeret medium efterprøves i forhold til de tilsvarende bioproces, som klon screening kampagner på individuel identificeret forskellige top kunstnere til forskellige fodringsstrategier og dyrkning media52,58. Derudover kan de indførte KriKit36 generelt bidrage til forbedret holistisk bioproces optimering.For nylig blev værktøj evner udvides også understøtter multi objektive optimering40, hvilket kan være vigtigt for at optimere både opstrøms og nedstrøms processer59,60.

Moderne rekombinant genteknologi giver den omfattende brug af tekniske enzymer til forskellige applikationer i den farmaceutiske industri, dyrefoder, organisk kemi, og fødevareforarbejdning1,2,3. Produktion af tekniske enzymer i bulk mængder er et vigtigt emne for industriel bioteknologi og optimeret rekombinante protein produktion, og begge stamme og bioproces engineering er nødvendig. I generation af effektivt manipuleret produktionsstammer, forskellige genetiske biblioteker er tilgængelige, f.eks., for afbalanceret gen expression4 eller øget sekretion effektivitet5.
Corynebacterium glutamicum er en stor producent af aminosyrer på industriel skala6,7 og repræsenterer en attraktiv ikke-konventionelle udtryk vært for sekretoriske produktionen af rekombinante proteiner8 ,9. Både generelle sekretoriske (Sec) og twin-argininog translokation (Tat) pathway er til stede i C. glutamicum og blev med succes anvendt for rekombinante protein sekretion10. Omfattende erfaring i bioproces engineering aminosyre produktion i industriel skala samt evnen til at udskille proteiner til g/L beløb11 og stor robusthed vedrørende bioproces inhomogeneities fundet i stor skala, som udlæg til planteavl12,13, gøre C. glutamicum en lovende platform organisme for sekretoriske produktionen af heterolog proteiner i industriel skala.
Ernæring medium optimering er kendt for at forbedre rekombinante protein produktion med mikrobielle systemer14,15,16,17 og derfor justering i medium sammensætning er en givende skridt i bioproces udvikling med hensyn til optimal produktivitet18,19,20,21. Intens forskning om anvendelsen af mikrotiter plader (MTPs) for mikrobielle dyrkning22,23,24 banede vejen for udvikling og design af MTPs for mikrobiel dyrkning25 ,26 og udviklingen af MTP-baseret microbioreactor (MBR) systemer med online overvågning og miljømæssige styre27,28. MBRs aktiverer en betydelig stigning i eksperimentel dyrkning overførselshastighed. Desuden er MBR systemer stammer fra andre typer af bioreaktorer, f.eks., bubble kolonner eller omrørt tank reaktorer, tilgængelige for mikrobiel bioproces optimering29,30,31, 32.
I almindelighed, optimering undersøgelser drage fordel af øget eksperimentelle overførselshastighed, som bliver endnu mere magtfulde i kombination med DOE metoder, såsom at vurdere samspillet mellem design variabler eller reducere high-dimensionelle Søg rum. Derfor, den kombinerede brug af MBR systemer, lab automatisering og DOE har vist sig for at være en kraftfuld metode i bioteknologi8,16,33,34,35.
En protokol til media optimering præsenteres kombinerer state-of-the-art laboratorium automation, MBR teknologi med online proces overvågning og Kriging-baserede data analyse/eksperimentelle design. Kriging metode er gennemført i en MATLAB værktøjskasse ("KriKit"), som kan downloades og bruges gratis af afgift36. Som ansøgning eksempel, er maksimering af sekretoriske grønne ﬂuorescent protein (NGL) produktion med C. glutamicum vist ved at optimere sammensætningen af CgXII minimal medium. Normal god landbrugspraksis titer blev valgt som optimering mål, som det kan kvantificeres nemt og det er almindeligt anvendt som model protein for studier på MBR systemer37,38,39.
De præsenterede rammer er opdelt i fire trin, som er illustreret i figur 1. Trinene er angivet med boks rammer og svarer til sektioner af protokollen. Det første skridt (figur 1A) er at definere projektets mål og fastlægge de nødvendige metoder. Kombinationen af DOE metoder, MBR teknologi og lab automation giver en øget eksperimentelle overførselshastighed, der kræver kraftig behandling af personoplysninger. Det andet trin (figur 1B) har til formål at afsløre følsomme design variabler (dvs., medium komponenter) med høj indflydelse på optimering mål. Dette fører til et begrænset antal design variabler. Det tredje trin (figur 1 c) består af en iterativ optimering for en mere detaljeret undersøgelse af den funktionelle relation mellem de resterende design variabler og mål af interesse. Hjælp af successivt udvidet data sæt, er Kriging tilgang anvendt til at forudsige det eksperimentelle resultat ikke målt steder. Iterativ cyklus stopper så snart Kriging model forudsiger en optimal eller plateau med tilstrækkelig nøjagtighed. Resultaterne verificeres i fjerde trin (fig. 1 d), begyndende med en yderligere følsomhedsanalyse omkring identificerede optimalt. Hvis i første omgang, ufølsom komponenter findes for at være ufølsom også i regionen optimalt, er det rimeligt at antage, at dette gælder under iterative optimering proceduren i det tredje trin. Bagefter, det anbefales at kontrollere optimering resultater ved anvendelse af ortogonale metoder, som en aktivitet assay eller SDS-Page.
Den generiske karakter af præsenteres protokollen giver mulighed for nem tilpasning til forskellige lab udstyr, andre udtryk værter og target proteiner af valg, samt yderligere bioproces variabler som pH værdi eller dyrkning temperatur.Derudover kan andre optimering mål som protein produktion sats, specifikke udbytte eller produktkvalitet vælges passer til anvendelsesområdet for andre optimering undersøgelser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
Figur 1 : Workflow af optimering undersøgelse. Fire ramme bokse svarer til sektioner af protokollen, "Opfatte den undersøgelse og Definition af metoder" (afsnit 1), "Følsomhedsanalyse" (afsnit 2), "Iterativ optimering" (afsnit 3) og "Validering" (afsnit 4). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioLector</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>G-BL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowerplate</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>MTP-48-BOH</td>
			<td>For cultivation in the BioLector device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing foil</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>F-GP-10</td>
			<td>Sterile sealing for Flowerplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>2016b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KriKit</td>
			<td>Forschungszentrum J&#252;lich</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Freely available, MATLAB installation required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus pipetting robot</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Includes &#34;WinPrep&#34; software installation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-column deep well microplate</td>
			<td>E&#38;K Scientific</td>
			<td>EK-2034</td>
			<td>Container for medium stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplates, transparent, F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td>For Bradford protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;clear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655087</td>
			<td>For flourescence measurement in cell-free supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Research&#160;plus multi-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Facilitates manual liquid handling with microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruPAG&#160;Precast Gels</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCG2002</td>
			<td>For SDS-Page analysis of cell-free supernantants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&#8211;42 (2007)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology

En kerneforretning inden for industriel bioteknologi ved hjælp af mikrobiel produktion cellefabrikker er den iterative proces af stamme engineering og optimering af bioproces betingelser. Et vigtigt aspekt er forbedringen af dyrkning medium at give et optimalt miljø for mikrobiel dannelsen af produktet af interesse. Det er godt accepteret, at medierne sammensætning dramatisk kan påvirke samlede bioproces ydeevne. Ernæring medium optimering er kendt for at forbedre rekombinante protein produktion med mikrobielle systemer og dermed, dette er en givende skridt i bioproces udvikling. Men meget ofte standard medier opskrifter er taget fra litteratur, da skræddersyet design af dyrkning medium er en kedelig opgave, der kræver microbioreactor teknologi for tilstrækkelig dyrkning overførselshastighed, hurtig produkt analytics og støtte af lab robotteknologi til aktiverer pålidelighed i flydende håndtering trin. Desuden er avancerede matematiske metoder nødvendige for rationel analysere måledata og effektivt designe parallelle eksperimenter såsom for at opnå optimal informationsindhold.
Den generiske karakter af præsenteres protokollen giver mulighed for nem tilpasning til forskellige lab udstyr, andre udtryk værter og target proteiner af interesse, samt yderligere bioproces parametre. Desuden kan andre optimering mål som protein produktion sats, specifikke udbytte eller produktkvalitet vælges passer til anvendelsesområdet for andre optimering undersøgelser. Den anvendte Kriging værktøjskasse (KriKit) er et generelt værktøj til Design af eksperimenter (DOE) det bidrager til forbedret holistisk bioproces optimering. Den støtter også multi objektive optimering, som kan være vigtige i at optimere både opstrøms og nedstrøms processer.

Den indførte protokol blev anvendt til at maksimere titer af udskilles normal god landbrugspraksis. Specifikt, normal god landbrugspraksis titer efter 17 h dyrkning blev valgt som optimering mål. Online fluorescens påvisning af normal god landbrugspraksis tilladt simpelt produkt kvantificering. Normalisering af normal god landbrugspraksis signal med data fra en reference dyrkning er imidlertid uomgængeligt at sikre reproducerbarhed og sammenlignelige resultater. En Forhåndsudvælgelse af medier komponenter blev udført på et rationelt grundlag, som beskrevet i afsnit 1. Eksperimenter blev udført ifølge vejledningen i afsnit 1: parametrene i de våde lab procedurer blev defineret for hele studiet at sikre konsistens og reproducerbarhed af resultaterne.
Som beskrevet i afsnit 2, blev en indledende screening udført for at identificere relevante komponenter viser en betydelig indvirkning på optimering mål for yderligere og mere detaljerede studier. MTP-baseret MBR system giver mulighed for 48 forsøg skal udføres parallelt. Under hensyntagen til den maksimal mulige antal parallelle forsøg på en MTP (48) og det samlede antal medier komponenter (11) gør de 2IVdesign11-6 fraktioneret et passende valg. Denne eksperimentelle design består af 32 eksperimenter og giver mulighed for vurdering af de vigtigste virkning for hver af de undersøgte medier komponenter. De resterende dyrkning brønde (16) blev brugt til flere replikater af eksperimenter med reference medium for at vurdere reproducerbarhed og positionelle effekter. Dvs hvert eksperiment udføres én gang (ingen gentagelser), med undtagelse af referencen eksperiment (fem replikater).
Tabel 1 sammenfatter resultaterne af screening analyse. I den pågældende koncentrationsområde udviste varierende størstedelen af media-komponenter ikke en mærkbar effekt på målet. Komponent NH4+ viser en stærk negativ virkning, mens Ca2 + og Mg2 + viser den stærkeste positive tendens. Effekten af Mg2 + er ikke signifikant for det aktuelle koncentrationsområde men kan være for et bredere koncentrationsområde. Derfor blev det besluttet at udelade NH4+ fra mediet og undersøge effekten af Ca2 + og Mg2 + i yderligere eksperimenter.
Afsnit 3 beskriver den iterative optimering procedure, der er brugt til at maksimere normal god landbrugspraksis fluorescens signal mens varierende koncentrationer af Ca2 + og Mg2 +. I iteration 1, blev den hypotese, at NH4+ kan udelades testet. Koncentrationsområde for Ca2 + og Mg2 + blev vedtaget fra screening analyse. Den mindste koncentration af NH4+ blev sat til nul og den maksimale koncentration blev vedtaget fra screening eksperiment. I de følgende eksperimenter, blev komponent koncentrationer distribueret over et 3 x 3 x 3 gitter inde den fastlagte koncentrationsområde, resulterer i 27 eksperimenter. Under alle udlæg til planteavl, fem replikater af reference medium var inkluderet, der serveres som intern standard og for at sikre, at ingen positionelle virkninger over MTP opstod. For de resterende 16 brønde, blev koncentrationer af NH4+, Ca2 +og Mg2 + tilfældigt fordelt indenfor de givne områder.
Figur 5 A visualiserer resultaterne af de første iterationer. Akseetiketter refererer til komponent bruges i den oprindelige reference medium, angivet ved x Ref. De blå overflader repræsenterer Kriging interpolation, der blev beregnet ved hjælp af KriKit software. Hver overflade er forbundet med en relativ koncentrationsniveau for NH4+ (mørk blå: 0 x Ref, ternet: 1 x Ref, lyseblå: 2 x Ref). Denne visuelle repræsentation afslører, at det er gunstigt at udelade NH4+. Interpolation overflader også vise de positive virkninger af både Mg2 + og Ca2 +, som alle fly stiger med stigende koncentrationer.
Baseret på resultaterne af iteration 1, blev det besluttet at udvide koncentration vifte af Ca2 + og Mg2 + ved at fordoble de maksimale koncentrationer og flytte designvinduet eksperimentelle til øverste højre hjørne, se figur 5 B. inde i dette interval, koncentrationerne var fordelt på en 6 x 6-gitter. Dette sikrer en jævn fordeling over rækken fuld koncentration, hvilket fører til optimale Kriging interpolation resultater. Figur 5 B viser Kriging interpolation plot baseret på den kombinerede data målt i begge gentagelser (røde prikker og gul pladser). For begge, Ca2 + og Mg2 +, fortsætter den positive effekt af stigende deres koncentrationer. Derfor proceduren blev gentaget ved at fordoble den maksimale koncentration og dermed, designvinduet eksperimentelle blev flyttet til at udforske grænser i øverste højre hjørne.
Figur 6 A en oversigt over de resterende optimering procedure. Analyse af indsamlede data op til iteration 3 afslørede en begrænsning af den positive effekt af Mg2 +, dvs, en optimal koncentration vifte af Mg2 + blev identificeret. Det blev derfor besluttet at udvide koncentrationsområde kun for Ca2 + (iteration 4). Denne procedure blev gentaget to gange (iteration 5 og 6) indtil en mætning af normal god landbrugspraksis signal blev fundet. Denne mætning kan forklares ved udfældning af Ca-salte de anvendte koncentrationer af Ca2 +, som ikke er tilgængelige til cellerne.
Som eksperimentelle resultater er altid rystet af støj, den resulterende Kriging interpolation vises uregelmæssige og besigtigelse kan føre til forkerte konklusioner. Dog kan rækken optimal koncentration af medier komponenter for mættede normal god landbrugspraksis signalet identificeres pålideligt med den statistiske z -test, der er også implementeret i KriKit. Z -testen bruger direkte de iboende statistiske oplysninger, som den Kriging metode, dvs., forudsigelse værdier og forudsigelse usikkerheder. Figur 6 B viser det identificerede plateau, som bestemmes og visualiseret ved hjælp af KriKit værktøjskasse.KriKit værktøjskasse er frit tilgængelige36 og kommer med en detaljeret tutorial, der forklarer hvordan man bruger sine funktioner.
Hvis mere end to relevante komponenter findes, når 3D-visualisering sin grænse. KriKit indeholder flere andre mulige visuel repræsentation metoder såsom film eller "screening plot". Hvis det optimale potentiale ligger inden for den fastlagte koncentrationsområde, designet nye eksperimenter automatisk ved hjælp af den forventede forbedring40,46. Den eksperimentelle design baseret på den forventede forbedring er integreret i KriKit værktøjskasse. Mere detaljerede oplysninger kan findes i softwaredokumentationen.
Efter den iterative procedure, blev en bekræftelse af resultaterne gennemført, som beskrevet i del D. Gyldigheden af oprindelige antagelser blev kontrolleret ved at udføre en ekstra følsomhedsanalyse ved hjælp af den optimale medium sammensætning. Det vil sige alle oprindelige medier komponenter af interesse var varierede, men Ca2 + og Mg2 + var placere hen til deres optimal koncentrationsniveauer. I denne undersøgelse, de optimale koncentrationer <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 x Ref og <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6,8 x Ref blev valgt. Tabel 2 viser resultaterne af valideringen screening. I lighed med den oprindelige følsomhed screening (jf. tabel 1), NH4+ stadig har en betydelig negativ indflydelse og resterende effekter er stadig ubetydelig.
På grund af nem adgang, blev normal god landbrugspraksis fluorescens signal fra dyrkning suspension brugt til at kvantificere de ekstracellulære normal god landbrugspraksis titer under alle eksperimenter. Verifikation grunde, blev normal god landbrugspraksis fluorescens valideret mod andre målinger. Fordi normal god landbrugspraksis er udskilles via Tat-vej, kan ikke fluorescens signal diskriminere mellem intra- og ekstracellulært normal god landbrugspraksis. Således blev udlæg til planteavl gengivet ved hjælp af reference medium og optimeret medium. Udover fluorescens målingen fra celle-fri dyrkning analysere proteinindhold var kvantificeres ved Bradford assay og (semi)-normal god landbrugspraksis kvalitativt visualiseret ved SDS-Page15. Alle deraf følgende måling signaler var cirka fordoblet for udlæg til planteavl med optimeret medium i forhold til reference medium og valideret de ca 100% forbedring af optimeret medium sekretion ydeevne. Normal god landbrugspraksis specifikke fluorescens af dyrkning suspension kan derfor betragtes som en egnet metrik for optimering mål, dvs., de ekstracellulære normal god landbrugspraksis titer.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
Figur 2 : Skærmbillede fra listen volumen pipettering for følsomhedsanalyse. Poster i den første kolonne tildele et entydigt id til alle diskenheder på en række; dette id er MTP godt antal mål dyrkning MTP på flydende handleren arbejdsbord, jf. figur 4C. Resterende kolonner indkode diskenheder for forskellige løsninger ("Sln-01" til "Sln-15") for at være pipetted. Den akkumulerede volumen af en række svarer til den endelige dyrkning volumen af den tilsvarende godt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
Figur 3 : Skærmbillede fra væsken håndtering kontrol software "WinPREP". Venstre: Række-bestilt kommandoer, herunder en overførsel kommando for hver stamopløsning at være pipetted. Før den sidste kommando for inokulum tilsætning indsættes en bruger prompt for at sikre frø kulturen placeres på bordet lige i tide. Højre: Skematisk af arbejdsbord, herunder kilde labware for Variation aktier (to dyb brønd plader med 12 kolonne-lignende wells), reagens lavpunktet for resten Stock, vand og inokulum og medier forberedelse target dyrkning MTP. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
Figur 4 : Udarbejdelse af detaljerede screenshots for opsætning af pipettering af en stamopløsning. (A) uindpakkede kommando for Pipettering af Fe lager. Kilde labware og kilde godt er inden for markeret på arbejdsbord med Læs ramme og røde kolonne med den tilsvarende dyb brønd plade. Rejsemål labware og bestemmelsessted brønde i er markeret med blå ramme rundt og blå wells af target dyrkning MTP. (B) detaljeret eksempel syn på tildeling af pipettering diskenheder til dette trin (Fe stamopløsning). Antallet af destinationer er læst fra listen pipettering, der har 48 rækker. Dispensere-diskenheder for alle destination brønde for Fe stamopløsning findes i kolonne 4 i listen pipettering. Bemærk at den første kolonne i listen pipettering indeholder id'er og ikke mængder overføres, se figur 2. (C) nærmere oplysninger om destination godt nummerering. Bind skrevet i #1 række og den tilsvarende pipettering liste vil blive pipetted ind i godt markeret som #1 og så videre. Brønde #01, #08, #41 og #48 svarer til brønde A01, A08, F01 og F08 til alpha-numerisk kodning, som er også trykt i dyrkning MTP selv. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
Figur 5 : Detaljerede resultater fra den første iteration. (A) Kriging interpolation baseret på forsøgsdata for iteration 1. Røde prikker angiver datasættet. Til sammenligning, alle tre interpolation overflader er overlagt i et plot (mørkeblå: 0 x Ref, ternet: 1 x Ref, lyseblå: 2 x Ref). En alternativ repræsentation af resultaterne kan findes andetsteds15. (B) Kriging interpolation baseret på eksperimenterne udført i iteration 1 (røde prikker) og iteration 2 (gul pladser).Dele af de data, der præsenteres i denne figur har været tidligere udgivet15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
Figur 6 : Skildring af iterativt indsamlede optimering resultater. (A) Endelig Kriging model forudsigelse. (B) statistiske identifikation af optimal område (rød) baseret på den statistiske z-test, som er fastsat af KriKit. Kasser angive successive trin af iterative design og udførelse af eksperimenter. Dele af de data, der præsenteres i denne figur har været tidligere udgivet15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Normaliserede koefficient middelværdien</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>-0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0,03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>0,06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2 +</td>
			<td>1,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: resultaterne af følsomhedsanalysen. Koefficient værdier repræsenterer den gennemsnitlige effekt, når de respektive medier komponent koncentration fra dens center værdi til sin maksimale værdi. For optimal eksperimentelle design, som standard litteraturen og bruges her, standardafvigelse repræsenterer direkte eksperimentel variation på grund af replikering af reference eksperiment. Koefficient værdier var normaliseret efter maksimal værdi (0.0422 for komponenten Ca2 +). Normaliserede og absolut koefficient standardafvigelse er 0,54 og 0.0226, henholdsvis.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Normaliserede koefficient middelværdien</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>1,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>0,69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 2: resultatet af den sidste følsomhedsanalyse. Koefficient værdier repræsenterer den gennemsnitlige effekt, når de respektive medier komponent koncentration fra dens center værdi til sin maksimale værdi. Som en optimal eksperimentelle design blev brugt, afhænger standardafvigelsen kun eksperimentel variation ved hjælp af optimeret medium sammensætning. Eksperimentel variation steg svagt i forhold til variationen ved hjælp af reference medium. Koefficient værdier var normaliseret efter maksimal værdi (0.0106 for komponent Mn2 +). Normaliserede og absolut koefficient standardafvigelse er 3.63 og 0.0385, henholdsvis.

Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generisk protokol for optimering af heterolog Protein produktion ved hjælp af automatiserede Microbioreactor teknologi

Dette manuskript beskriver en generisk tilgang til skræddersyede design af mikrobielle dyrkning medier. Denne aktiveres af en iterativ arbejdsproces kombinere Kriging funderede eksperimenterende design og microbioreactor teknologi for tilstrækkelig dyrkning overførselshastighed, som støttes af lab robotteknologi til at øge pålidelighed og hastighed i flydende håndtering af medier forberedelse.

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: En automatiseret platform for biomasse Enzyme Discovery og Cocktail optimering

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

High-throughput, Automated Udvinding af DNA og RNA fra kliniske prøver ved hjælp TruTip Technology om fælles Væskehåndtering Robotter

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelige bruskvæv Fabrication Brug Tre-dimensionel Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Brug Tomoauto: En protokol til High-throughput Automatiseret Cryo-elektron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Fuldt automatiseret Centrifugal mikrofluidanordning for Ultrasensitive Protein Detection fra fuldblod

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Produktion af kemikalier af<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Brug af bambushydrolysat som fødevare

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Brug af høj overførselshastighed automatiseret Microbioreactor System for produktion af Model IgG1 i CHO celler

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rensning og analyse af et monoklonalt antistof fra ovarieceller fra kinesiske hamster ved hjælp af et automatiseret Mikrobioreaktor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Procesoptimering ved hjælp af høj gennemløb automatiseret mikro-bioreaktorer i kinesisk Hamster Ovary Cell Dyrkning

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...