Name: generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

De wetenschappelijke activiteiten van het centrum van de wetenschap van de bosbouwbiomassa waren het financieel ondersteund door het ministerie van innovatie, wetenschap en onderzoek in het kader van de NRW-Strategieprojekt-BioSC (nr. 313/323-400-002 13). De auteurs bedanken de ministerie van innovatie, wetenschap, en onderzoek van Noordrijn-Westfalen en de Heinrich Heine Universiteit Düsseldorf voor een beurs voor Lars Freier binnen de CLIB-afgestudeerde Cluster industriële biotechnologie. Verdere financiering van het programma spaties inschakelen "Helmholtz innovatie Labs" van Duitse Helmholtz vereniging ter ondersteuning van het "microbiële Bioprocess Lab – A Helmholtz Innovation Lab" ontvangen.

De auteurs hebben niets te onthullen.

De algemene aard van het gepresenteerde protocol kunt verschillende aanpassingen, bijvoorbeeldvoor het bestuderen van andere microbiële expressie hosts9,47,48,49,50, 51, of andere eigenschappen van de doel-eiwitten, zoals glycosylatie patroon of dissulfide bindingen te optimaliseren. Het protocol wellicht ook worden aangepast aan de beschikbare lab-apparatuur. De integratie van een MBR-systeem kunt verhogen van experimentele doorvoer, waarmee grote besparingen in tijd. Bij vervanging volledig geïnstrumenteerde en controleerbare bioreactoren door MBR systemen dient schaalbaarheid van resultaten evenwel worden overwogen8,37,52,53. Het gebruik van DOE methodologieën en wiskundige modellering helpt bij het maximaliseren van de informatie-inhoud van meetgegevens met betrekking tot de bestudeerde objectieve54 door efficiënte experimentele planning en model-gebaseerde data interpretatie15.
Wijzigingen in de methode Naast multifunctioneel en uitbreidbaar robotic liquid handling-systemen zoals gebruikt in deze studie, dient te worden vermeld zijn er verschillende kleinere liquid handling-systemen commercieel beschikbaar die geschikt zijn voor het uitvoeren van deze taak en afvaltonnen van laminaire flow werk bankjes. Als geen enkel geautomatiseerde pipetting systeem beschikbaar is, kunnen het zijn dat verschillende media composities volgens het plan DOE ook worden gerealiseerd door handmatige pipetteren met behulp van interne en/of meerkanaals pipetten. Aangezien de handmatige voorbereiding meer gevoelig voor fouten is en zeer gerichte werk voor heel lange tijd vergt, is het aanbevolen om een lager aantal composities van verschillende media voor te bereiden.
Afhankelijk van de mogelijkheden van de werknemer MBR-systeem, zal het bijbehorende protocol van de teelt variëren. Bijvoorbeeld, als er geen online meting van biomassa formatie beschikbaar is, wellicht volstaat het voor het meten van de concentratie van de biomassa na voltooiing van de groei-experiment. In combinatie met online monitoring van de pH en de opgeloste zuurstof, die wordt uitgevoerd in verschillende systemen van de MBR, de groei verzadiging kan veilig worden bepaald. In principe kunnen de groei experimenten worden uitgevoerd in MTPs alleen in schudden van starterscentra, zonder het gebruik van een MBR-systeem geplaatst. In dit geval goede teelt voorwaarden moeten worden gewaarborgd: (1) zuurstof-limited teelten kunnen worden vermeden door het gebruik van MTPs met geschikte geometrieën, in combinatie met de juiste frequenties schudden en schudden diameters, bijvoorbeeld, vierkant 96 of 24 diep goed platen bediend, 1000 rpm op 3 mm afstand of bij 250 omwentelingen per minuut op afstand 25 mm, respectievelijk. Nog belangrijker is, hoe lager de overdrachtssnelheden haalbaar maximale zuurstof, hoe lager de belangrijkste koolstofbron moet worden geconcentreerd. Zoals hierboven vermeld, voor deze studie, was het gebruik van 10 g/L glucose geschikt om te voorkomen dat zuurstof beperking voor de werknemer teelt voorwaarden; (2) bemonstering van de culturen van de MTP voor biomassa en product kwantificering moet tot een minimum worden beperkt. Telkens wanneer die de MTP is verwijderd uit de schudden incubator, zuurstof overdracht zal onmiddellijk uitsplitsing die leiden ongunstige teelt voorwaarden tot kan; (3) in het advies van de auteurs, wordt het gebruik van MTP lezers als teelt apparaten niet aanbevolen omdat deze apparaten zijn niet ontwikkeld voor dit doel. Bijvoorbeeld, schudden mechanica werden gebouwd voor de occasionele mengen van microplates na de toevoeging van het reagens en dus vaak gebrek aan robuustheid voor lange runs van voortdurend schudden blijvende dagenlang. Bovendien, kan niet voldoende ingangsvermogen nodig voor microbiële teelten in deze lezers worden gerealiseerd. De integratie van de gemeten optische dichtheid in korte tijdsintervallen vereist stoppen van het schudden beweging, wat resulteert in herhaalde perioden van zuurstof beperking. Bovendien zal verdamping in dergelijke systemen over perioden van de lange teelt resultaten verstoren. Voor meer details over het verrassend complexe onderwerp over het gebruik van MTPs voor microbiële teelten, wordt de lezer verwezen naar de geciteerde literatuur22,23,24,25,26 en verwijzingen daarin.
Verdere overwegingen Speed-up iteratieve optimalisatie stappen, is het aangeraden om zorgvuldig selecteren de analytische methode voor de kwantificering van het product. Snelle en eenvoudige methoden de voorkeur verdient ten koste van de precisie en nauwkeurigheid, zoals de strategie van iteratieve proefopzet experimentele onnauwkeurigheid tolereert. De definitieve resultaten moeten echter worden gecontroleerd tegen voldoende precieze en accurate product kwantificering methodes die ingewikkelder wellicht. In het algemeen, zorgvuldige evaluatie en de besluitvorming over de studie procedures vereist inspanning in het begin van de studie, maar betalen op de lange termijn, nadat routinemethoden hebben vastgesteld.
Het is sterk aanbevolen om het definiëren van een referentie-experiment, dat ten opzichte van is alle experimenten tijdens de optimalisatie. Dat wil zeggen, worden de toegepaste middellange component concentraties evenals gemeten output via delen door referentiewaarden genormaliseerd. Op deze manier worden alle toegepast en gemeten waarde kan worden geïnterpreteerd als de x-vouw van de referentiewaarde. Om te houden rekening variaties tussen de platen, worden vijf referentie experimenten uitgevoerd op elke plaat. De gemiddelde waarde van de gemeten resultaten wordt gebruikt voor de normalisatie.
Het kan over het algemeen niet worden gegarandeerd dat het ontwikkelde medium ook optimaal voor andere stammen is. Het verbeterde medium zal waarschijnlijk ook wel geschikt voor het cultiveren van expressie stammen met kleine genetische verschillen, bijvoorbeeldwanneer mutagenese studies (produceren enzym varianten met één aminozuur vervangingen verkregen Hoewel zelfs één puntmutaties zijn beschreven effect cellulaire metabolisme en heterologe expressie prestaties55,56). In dit geval kan een eerste stap, gevolgd door protocollen voor high-throughput expressie screenings57dienen als de gepresenteerde protocol. Als het protocol wordt gebruikt voor middellange ontwikkeling met latere schaal-up van fed-batch teelten, het geoptimaliseerde medium dient te worden geverifieerd voor de bijbehorende Bioprocestechnologie-voorwaarden, zoals kloon screening van campagnes op de microscale verschillende top artiesten voor verschillende voeding strategieën en teelt media52,58. Bovendien kan de geïntroduceerde KriKit36 in het algemeen bijdragen tot verbeterde holistische Bioprocestechnologie optimalisatie.Pas onlangs, waren de tool capaciteiten uitgebreid ook steunen multi objectieve optimalisatie40, kunnen die van belang zijn voor het optimaliseren van beide bedrijven stroomopwaarts en stroomafwaarts processen59,60.

Moderne recombinante gentechnologie maakt het breed gebruik van technische enzymen voor diverse toepassingen in de farmaceutische industrie, diervoeding, organische chemie, en voedselverwerking1,2,3. De productie van technische enzymen in grote hoeveelheden is een belangrijk onderwerp voor de industriële biotechnologieën en voor geoptimaliseerde recombinante eiwitproductie, en beide stam en bioprocess engineering is nodig. Voor de generatie van efficiënt gemanipuleerde productie stammen, verschillende genetische bibliotheken zijn beschikbaar, bijvoorbeeldvoor evenwichtige gen expressie4 of verhoogde secretie efficiëntie5.
Corynebacterium glutamicum is een belangrijke producent van aminozuren op de industriële schaal6,7 en vertegenwoordigt een aantrekkelijke niet-conventionele expressie gastheer voor de secretoire productie van recombinante eiwitten8 ,9. Zowel de algemene secretoire (Sec) en de tweeling-arginine translocatie (Tat) traject zijn aanwezig in C. glutamicum en werden met succes toegepast voor recombinante eiwitten secretie10. Uitgebreide ervaring in bioprocess engineering met betrekking tot aminozuur productie op de industriële schaal, evenals de mogelijkheid om eiwitten g/L bedragen11 te grote robuustheid betreffende Bioprocestechnologie inhomogeneities gevonden in grootschalige afscheiden teelten12,13, maken C. glutamicum een veelbelovende platform organisme voor de secretoire productie van heterologe eiwitten op de industriële schaal.
Voeding middellange optimalisatie is bekend om de productie van recombinante eiwitten met microbiële systemen14,15,16,17 , en bijgevolg, de aanpassing van medium samenstelling is een veelbelovende stap in Bioprocestechnologie ontwikkeling met betrekking tot optimale productiviteit18,19,20,21. Intens onderzoek betreffende de toepassing van de microtiterplaat platen (MTPs) voor microbiële teelt22,23,24 baande de weg voor de ontwikkeling en het ontwerp van MTPs voor microbiële teelt25 ,26 en de ontwikkeling van MTP gebaseerde microbioreactor (MBR) systemen met online monitoring en milieu controle27,28. MBRs kunnen een aanzienlijke toename van de experimentele teelt doorvoer. Bovendien, MBR systemen als gevolg van andere soorten bioreactoren, bijvoorbeeld, bubble kolommen of stirred tank reactoren, zijn beschikbaar voor microbiële Bioprocestechnologie optimalisatie29,30,31, 32.
In het algemeen, profiteren optimalisatie studies van verhoogde experimentele doorvoer, die wordt nog krachtiger in combinatie met DOE methodologieën, zodanig beoordelen van interacties tussen ontwerp-variabelen of verminderen van hoge-dimensionale Zoek ruimten. Bijgevolg, het gecombineerd gebruik van MBR systemen, lab automatisering en DOE is gebleken een krachtige methode in biotechnologie8,16,33,34,35.
Een protocol voor media optimalisatie wordt gepresenteerd voor het combineren van state-of-the-art lab automatisering, MBR technologie met online proces monitoring en analyse/experimentele design Kriging gebaseerde gegevens. De methodologie van de Kriging is geïmplementeerd in een MATLAB Toolbox ("KriKit") die kunnen worden gedownload en gebruikt gratis voor de gratis36. Als de toepassing bijvoorbeeld is de maximalisatie van secretoire groene ﬂuorescent proteïne (GFP) productie met C. glutamicum komt te staan door het optimaliseren van de samenstelling van de CgXII minimaal medium. GFP titer werd gekozen als de doelstelling optimalisatie als het gemakkelijk kan worden gekwantificeerd en algemeen als model eiwit voor studies over MBR systemen37,38,39 toegepast wordt.
Het voorgestelde kader is verdeeld in vier stappen, die zijn aangegeven in Figuur 1. De stappen worden aangegeven door vak frames en corresponderen met de secties van het protocol. De eerste stap (figuur 1A) is om de doelen van het project definiëren en bepalen welke vereiste methoden. De combinatie van DOE methodologieën, MBR technologie en lab automatisering een doorvoersnelheid kan verhoogd experimentele die vraagt om krachtige gegevensverwerking. De tweede stap (figuur 1B) is gericht op het detecteren van gevoelige ontwerp variabelen (d.w.z., middellange onderdelen) met hoge invloed op de doelstelling van de optimalisatie. Dit leidt tot een verminderd aantal ontwerp van belang zijnde variabelen. De derde stap (Figuur 1 c) bestaat uit een iteratief optimalisatie voor een meer gedetailleerd onderzoek van de functionele relatie tussen de overige ontwerp-variabelen en de doelstelling van belang. Met behulp van de achtereenvolgens uitgebreide gegevensset, wordt de Kriging benadering toegepast voor het voorspellen van de experimentele resultaten op zonder afmetingen locaties. De iteratieve cyclus stopt zodra het Kriging model een optimale of plateau met voldoende nauwkeurigheid voorspelt. De resultaten worden bevestigd in de vierde stap (Figuur 1 d), beginnend met een nadere gevoeligheidsanalyse rond de geïdentificeerde optimale. Als aanvankelijk ongevoelig onderdelen zijn ook ongevoelig worden de optimale regio, is het redelijk te veronderstellen dat dit tijdens de iteratieve optimalisatie-procedure in de derde stap geldt. Daarna wordt het geadviseerd om te controleren of optimalisatie resultaten door toepassing van orthogonale methoden, zoals een bepaling van de activiteit of de SDS-pagina.
De algemene aard van het gepresenteerde protocol voorziet in gemakkelijke aanpassing aan verschillende lab-apparatuur, andere expressie hosts en doel proteïnen van keuze, evenals verdere Bioprocestechnologie variabelen zoals pH waarde of teelt temperatuur.Bovendien kunnen andere optimalisatie doelstellingen zoals eiwit productieomvang, specifieke opbrengst of kwaliteit van de producten worden gekozen aan de werkingssfeer van andere studies voor optimalisatie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
Figuur 1 : Workflow optimalisatie studie. De vier frame vakken komen overeen met delen van het protocol, "Conceiving de studie en definitie van Methods" (deel 1), "Sensitivity Analysis" (sectie 2), "Iteratieve Optimization" (sectie 3) en "Validatie" (punt 4). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioLector</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>G-BL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowerplate</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>MTP-48-BOH</td>
			<td>For cultivation in the BioLector device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing foil</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>F-GP-10</td>
			<td>Sterile sealing for Flowerplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>2016b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KriKit</td>
			<td>Forschungszentrum J&#252;lich</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Freely available, MATLAB installation required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus pipetting robot</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Includes &#34;WinPrep&#34; software installation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-column deep well microplate</td>
			<td>E&#38;K Scientific</td>
			<td>EK-2034</td>
			<td>Container for medium stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplates, transparent, F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td>For Bradford protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;clear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655087</td>
			<td>For flourescence measurement in cell-free supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Research&#160;plus multi-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Facilitates manual liquid handling with microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruPAG&#160;Precast Gels</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCG2002</td>
			<td>For SDS-Page analysis of cell-free supernantants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&#8211;42 (2007)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology

Een corebusiness in industriële biotechnologie met behulp van microbiële productie cel fabrieken is het iteratieve proces van stam engineering en optimalisatie van Bioprocestechnologie voorwaarden. Een belangrijk aspect is de verbetering van de teelt medium om te zorgen voor een optimale omgeving voor microbiële vorming van het product van belang. Het is ook aanvaard dat de media samenstelling dramatisch algemene Bioprocestechnologie prestaties kan beïnvloeden. Voeding middellange optimalisatie is bekend om recombinant eiwit productie met microbiële systemen en dus dit is een veelbelovende stap in Bioprocestechnologie ontwikkeling. Echter zijn vaak standaard media recepten afkomstig uit de literatuur, aangezien op maat gemaakt ontwerp van het medium van de teelt is een vervelende taak die microbioreactor technologie voor voldoende teelt doorvoer, snelle product analytics, evenals ondersteuning vereist door lab robotica om betrouwbaarheid in vloeistof verwerken stappen. Bovendien, geavanceerde wiskundige methoden zijn vereist voor rationeel analyseren van meetgegevens en efficiënt ontwerpen van parallelle experimenten zoals te bereiken optimale informatie-inhoud.
De algemene aard van het gepresenteerde protocol voorziet in gemakkelijke aanpassing aan verschillende lab-apparatuur, andere expressie hosts en doel proteïnen van belang, evenals verdere Bioprocestechnologie parameters. Bovendien kunnen andere optimalisatie doelstellingen zoals eiwit productieomvang, specifieke opbrengst of kwaliteit van de producten worden gekozen aan de werkingssfeer van andere studies voor optimalisatie. De toegepaste Kriging Toolbox (KriKit) is een algemene tool voor ontwerp van experimenten (DOE) die aan betere holistische Bioprocestechnologie optimalisatie bijdraagt. Het ondersteunt ook multi objectieve optimalisering die kan van belang in het optimaliseren van processen van zowel upstream- en downstream.

Het geïntroduceerde protocol werd toegepast voor het maximaliseren van de titer van secreted GFP. In het bijzonder de GFP titer na 17u voor teelt werd gekozen als de doelstelling van de optimalisatie. Online fluorescentie detectie van GFP toegestaan eenvoudig product kwantificering. De normalisatie van GFP signaal met gegevens uit de teelt van een verwijzing is echter onontbeerlijk om de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van de resultaten. Een voorselectie van de mediacomponenten werd uitgevoerd op basis van rationele, zoals beschreven in sectie 1. Experimenten werden uitgevoerd volgens de instructies van deel 1: de parameters van de natte lab procedures waren gedefinieerd voor de hele studie samenhang en de reproduceerbaarheid van de resultaten.
Zoals beschreven in sectie 2, werd een eerste screening voor het identificeren van relevante bestanddelen waaruit een significant effect op de optimalisatie doelstelling voor de verdere, meer gedetailleerde studie uitgevoerd. De MTP-gebaseerde MBR-systeem maakt het mogelijk 48 experimenten worden uitgevoerd in parallel. Rekening houdend met het maximaal mogelijke aantal parallelle experimenten op één MTP (48) en het totale aantal media onderdelen (11) maakt de 2IVontwerpen11-6 fractionele een goede keuze. Deze proefopzet bestaat uit 32 experimenten en maakt de schatting van het belangrijkste effect voor elk van de onderzochte media-onderdelen. De resterende teelt putten (16) werden gebruikt voor meerdere replicatieonderzoeken van experimenten met de referentie-medium reproduceerbaarheid en positionele effecten te beoordelen. Dat wil zeggen, elk experiment eenmaal is uitgevoerd (geen replicaten), met uitzondering van de verwijzing experiment (vijf wordt gerepliceerd).
Tabel 1 geeft een overzicht van de resultaten van de analyse van de screening. In het weloverwogen concentratiebereik bleek variërend van de meerderheid van de mediacomponenten niet een merkbaar effect op het doel. Component NH4+ toont een sterk negatief effect, terwijl Ca2 + en Mg2 + Toon de sterkste positieve tendens. Het effect van Mg2 + is niet significant voor het stroombereik van concentratie, maar misschien wel voor een breder scala van de concentratie. Bijgevolg werd besloten te weglaten NH4+ van het medium en te onderzoeken van het effect van Ca2 + en Mg2 + in verdere experimenten.
Sectie 3 beschrijft de iteratieve optimalisatie-procedure die wordt gebruikt voor het maximaliseren van het GFP fluorescentie signaal terwijl het variëren van de concentraties van Ca2 + en Mg2 +. In herhaling 1, werd de hypothese dat NH4+ kan worden weggelaten getest. Het concentratiebereik voor Ca2 + en Mg2 + goedgekeurd uit de analyse van de screening. De minimumconcentratie van NH4+ is ingesteld op nul en de maximale concentratie was overgenomen uit de screening-experiment. In de volgende experimenten, waren de component-concentraties verdeeld over een 3 x 3 x 3 grid binnen het gedefinieerde concentratiebereik, resulterend in 27 experimenten. Tijdens alle teelten, vijf replicatieonderzoeken van referentie medium werden opgenomen, die diende als interne standaard en om ervoor te zorgen dat geen positionele effecten over de MTP is opgetreden. Voor de resterende 16 putten, werden de concentraties van NH4+, Ca2 +en Mg2 + willekeurig verspreid binnen het opgegeven bereik.
Figuur 5 A de resultaten van de eerste iteraties visualiseert. Aslabels verwijzen naar de concentraties van de component gebruikt in de oorspronkelijke verwijzing medium, aangegeven door x Ref. De blauwe oppervlakken vertegenwoordigen de Kriging interpolaties die werden berekend aan de hand van de KriKit software. Elk oppervlak is gekoppeld aan een relatieve concentratie voor NH4+ (donkerblauw: 0 x Ref, geruit: 1 x Ref, lichtblauw: 2 x Ref). Deze visuele representatie blijkt dat het is gunstig voor het weglaten van NH4+. Interpolatie oppervlakken tonen ook de positieve effecten van zowel Mg2 + en Ca2 +, als alle vliegtuigen stijgen met toenemende concentraties.
Op basis van de resultaten van iteratie 1, werd besloten uit te breiden van de concentratie bereik van Ca2 + en Mg2 + door een verdubbeling van de maximale concentraties en verschuift de proefopzet venster naar de rechterbovenhoek, Zie Figuur 5 B. binnen dit bereik, de concentraties werden verspreid op een 6 x 6 raster. Dit zorgt voor een gelijkmatige verdeling over het volledige concentratiebereik, wat leidt tot optimale Kriging interpolatie resultaten. Figuur 5 B toont het Kriging interpolatie perceel op basis van de gecombineerde gegevens gemeten in beide iteraties (rode stippen en gele pleinen). Voor beide, Ca2 + en Mg2 +, blijft het positieve effect van de toenemende hun concentraties. Daarom de procedure werd herhaald door een verdubbeling van de maximale concentratie en dus de proefopzet venster werd verplaatst naar het verkennen van de grenzen van de hogere juiste hoek.
Figuur 6 A geeft een overzicht van de resterende optimalisatie-procedure. Het onderzoek van de verzamelde data set tot iteratie 3 bleek dat een beperking van het positieve effect van Mg2 +, dat wil zeggen, een optimale concentratie bereik van Mg2 + werd geïdentificeerd. Daarom werd besloten verder uit te breiden het concentratiebereik alleen voor Ca2 + (iteratie 4). Deze procedure werd tweemaal herhaald (iteratie 5 en 6) totdat een verzadiging van het GFP-signaal is gevonden. Deze verzadiging is te verklaren door de neerslag van Ca-zouten voor de toegepaste concentraties van Ca2 +, die niet beschikbaar voor de cellen zijn.
Als experimentele resultaten zijn altijd verstoord door het lawaai, de resulterende Kriging interpolatie verschijnt onregelmatig en visuele inspectie kan leiden tot valse conclusies. Echter kan het bereik van de optimale concentratie van media-onderdelen voor de verzadigde GFP-signaal op betrouwbare wijze worden geïdentificeerd met de statistische z -test, die ook ten uitvoer wordt gelegd in KriKit. De z -toets gebruikt direct de intrinsieke statistische informatie van de Kriging methode, d.w.z., voorspelling waarden en voorspelling onzekerheden. Figuur 6 B toont het geïdentificeerde plateau, als het vastberaden en gevisualiseerde met de werkset KriKit.Werkset KriKit is vrij beschikbaar36 en komt met een gedetailleerd leerprogramma dat verklaart hoe de functies te gebruiken.
Als er meer dan twee relevante bestanddelen worden gevonden, bereikt 3D-visualisatie zijn limiet. KriKit biedt meerdere andere mogelijke visuele representatie methoden zoals films of "screening plot". Als de optimale potentieel binnen het gedefinieerde concentratiebereik ligt, zijn nieuwe experimenten automatisch ontworpen met behulp van de verwachte verbetering40,46. Het experimentele ontwerp op basis van de verwachte verbetering is geïntegreerd in de werkset KriKit. Meer gedetailleerde informatie kan worden gevonden in de softwaredocumentatie.
Nadat de iteratieve procedure, werd een verificatie van de resultaten uitgevoerd, zoals beschreven in deel D. De geldigheid van de oorspronkelijke aannames werd gecontroleerd door het uitvoeren van een gevoeligheidsanalyse van de extra met behulp van de optimale gemiddelde samenstelling. Dat wil zeggen, alle onderdelen van de oorspronkelijke media van belang waren gevarieerd, maar Ca2 + en Mg2 + waren ingesteld op hun optimale concentratieniveaus. In deze studie, de optimale concentraties <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 x Ref en <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6.8 x Ref werden gekozen. Tabel 2 toont de resultaten van de validatie-screening. Net als bij de eerste gevoeligheid screening (Zie tabel 1), NH4+ heeft nog steeds een aanzienlijke negatieve invloed en resterende effecten zijn nog steeds te verwaarlozen.
Als gevolg van de gemakkelijke toegang, werd het GFP fluorescentie signaal uit de teelt suspensie gebruikt voor het kwantificeren van de extracellulaire GFP-titer tijdens alle experimenten. Omwille van de controle, werd GFP fluorescentie gevalideerd tegen andere metingen. Omdat GFP wordt uitgescheiden via de Tat-traject, kan niet de fluorescentie-signaal discrimineren tussen intra- en extracellulaire GFP. Dus, teelten werden gereproduceerd met behulp van het referentie-medium en het geoptimaliseerde medium. Naast de fluorescentie-meting van cel-vrije teelt supernatant, gehalte aan andere melkeiwitten werd gekwantificeerd door de analyse van Bradford en (semi)-kwaliteitsverbetering GFP gevisualiseerd door SDS-pagina15. Alle resulterende meting signalen werden ongeveer verdubbeld voor teelten met geoptimaliseerde medium in vergelijking met referentie medium en gevalideerd de ongeveer 100% verbetering van de prestaties van de secretie van geoptimaliseerde medium. Bijgevolg kan GFP specifieke fluorescentie van schorsing van de teelt worden beschouwd als een geschikte metric voor optimalisatie doel, dat wil zeggen, de extracellulaire GFP-titer.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
Figuur 2 : Screenshot uit de lijst volume pipetting voor gevoeligheidsanalyse. Vermeldingen in de eerste kolom toewijzen een unieke id aan alle volumes van een rij; Deze identificatie is het MTP goed nummer van de doel-teelt MTP op de vloeibare handler werktafel, Zie Figuur 4C. Overige kolommen coderen volumes voor verschillende oplossingen ("Sln-01" tot "Sln-15") om te worden afgepipetteerde. De cumulatieve omvang van één rij komt overeen met het volume van de definitieve teelt van de desbetreffende goed. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
Figuur 3 : Screenshot van de vloeistof behandeling controlesoftware "WinPREP". Links: Rij-besteld opdrachten, met inbegrip van een opdracht voor bestandsoverdracht voor elke stamoplossing te worden afgepipetteerde. Voordat de definitieve opdracht voor toevoeging van het entmateriaal, wordt een gebruiker prompt ingevoegd om ervoor te zorgen dat de cultuur van het zaad wordt geplaatst aan de tafel net op tijd. Rechts: Schema van de werktafel, met inbegrip van de bron labware voor variatie voorraden (twee diep goed platen met 12 kolom-achtige wells), de trog reagens voor Rest voorraad, water en entmateriaal en de media voorbereiding doel teelt MTP. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
Figuur 4 : Compilatie van gedetailleerde screenshots voor installatie van pipetteren van een stamoplossing. (A) pakte opdracht voor pipetteren van Fe voorraad. Bron labware en bron goed worden binnen gemarkeerd op de werktafel door het Lees frame en de rode kolom van de overeenkomstige diep goed plaat. Bestemming labware en bestemming wells binnen zijn gekenmerkt door het blauwe kader rond en blauwe putjes van de target teelt MTP. (B) gedetailleerd voorbeeld zicht op toewijzing van pipetting volumes voor deze stap (Fe stockoplossing). Aantal bestemmingen wordt afgelezen uit de pipetting lijst, die bestaat uit 48 rijen. Het Doseer volumes voor alle putjes van de bestemming voor Fe stockoplossing wordt gevonden in kolom 4 in de pipetting lijst. Merk op dat de eerste kolom in de pipetting lijst bevat id's en niet de volumes kunnen worden overgedragen, Zie Figuur 2. (C) gegevens over de bestemming goed nummering. Volumes die zijn geschreven in de rij #1 van de bijbehorende pipetting lijst zal worden pipetted in goed gemarkeerd als #1, enzovoort. Wells #01, 08 #, #41 en #48 overeen met putjes A01, A08, F01 en F08 voor de alpha-numerieke codering, die ook in de teelt MTP zelf is afgedrukt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
Figuur 5 : Gedetailleerde resultaten vanaf de eerste iteratie. (A) Kriging interpolatie gebaseerd op experimentele gegevens van iteratie 1. Rode stippen geven de gegevensset. Ter vergelijking, alle drie interpolatie oppervlakken zijn overlay in één perceel (donkerblauw: 0 x Ref, geruit: 1 x Ref, lichtblauw: 2 x Ref). Een alternatieve weergave van de resultaten kan worden gevonden elders15. (B) Kriging interpolatie op basis van de experimenten uitgevoerd in herhaling 1 (rode stippen) en iteratie 2 (gele pleinen).Delen van de gegevens in dit cijfer zijn eerder gepubliceerde15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
Figuur 6 : Afbeelding van iteratief verzamelde optimalisatie resultaten. (A) definitieve Kriging model voorspelling. (B) statistische identificatie van optimale ruimte (rood) op basis van de statistische z-test, die wordt verstrekt door KriKit. Vakken geven aan opeenvolgende stappen van iteratieve ontwerp en uitvoering van experimenten. Delen van de gegevens in dit cijfer zijn eerder gepubliceerde15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Component</td>
			<td>Gemiddelde waarde van de genormaliseerde coëfficiënt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>-0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>0,06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA2 +</td>
			<td>1,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: resultaten van de gevoeligheidsanalyse. Coëfficiënt waarden dat het gemiddelde effect aangeeft wanneer verhoogt de concentratie van de respectieve media-component van de waarde van het centrum op de maximale waarde. Voor optimale experimentele designs, zoals gevonden in de standaard literatuur en gebruikt hier de standaarddeviatie geeft direct de experimentele variatie toe te schrijven aan de replicatie van het referentie-experiment. Coëfficiënt waarden zijn genormaliseerd door de maximale waarde (0.0422 voor component Ca2 +). De standaarddeviatie van de genormaliseerde en absolute coëfficiënt is 0.54 en 0.0226, respectievelijk.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Component</td>
			<td>Gemiddelde waarde van de genormaliseerde coëfficiënt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>1,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>0.69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 2: resultaten van de definitieve gevoeligheidsanalyse. Coëfficiënt waarden dat het gemiddelde effect aangeeft wanneer verhoogt de concentratie van de respectieve media-component van de waarde van het centrum op de maximale waarde. Zoals een optimale proefopzet werd gebruikt, hangt de standaarddeviatie alleen de experimentele variatie met behulp van de geoptimaliseerde middellange samenstelling. Experimentele variatie licht gestegen in vergelijking met de variatie met behulp van het referentie-medium. Coëfficiënt waarden zijn genormaliseerd door de maximale waarde (0.0106 voor component Mn2 +). De standaarddeviatie van de genormaliseerde en absolute coëfficiënt is 3,63 en 0.0385, respectievelijk.

Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generic-Protocol voor optimalisatie van heterologe eiwitproductie met behulp van geautomatiseerde Microbioreactor technologie

Dit manuscript beschrijft een algemene aanpak voor op maat gemaakte ontwerp van microbiële teelt media. Deze optie is ingeschakeld door een iteratieve werkstroom combineren Kriging gebaseerde experimentele design en microbioreactor technologie voor voldoende teelt doorvoer, die wordt ondersteund door lab robotica om betrouwbaarheid en snelheid in vloeistof behandeling van media voorbereiding.

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Het ontwikkelen van aangepaste Chinese hamster ovarium-host Cell Protein Testen met behulp van akoestisch vlies micropartikel Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: een geautomatiseerd platform voor biomassa Enzym Discovery en Cocktail Optimalisatie

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

High-throughput, geautomatiseerde extractie van DNA en RNA uit klinische monsters met behulp TruTip Technology op Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human kraakbeenweefsel Fabrication behulp van drie-dimensionale Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Met behulp van Tomoauto: Een protocol voor High-throughput Automated Cryo-electron tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Volautomatische centrifugale microfluïdische apparaat voor Ultragevoelige Protein Detection uit volbloed

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Productie van Chemicaliën door<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Bamboohydrolysaat gebruiken als voedingsstof

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Gebruik van High-Throughput geautomatiseerd Microbioreactor-systeem voor de productie van Model IgG1 in CHO cellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Proces optimalisatie met behulp van high throughput geautomatiseerde micro-bioreactoren in de Chinese Hamster Eierstok celteelt

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...