Name: generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00
Duration: 6 min 24 s
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Die wissenschaftlichen Aktivitäten der Bioökonomie Science Center wurden durch das Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung im Rahmen des NRW-Strategieprojekt BioSC (Nr. 313/323-400-002 13) finanziell unterstützt. Die Autoren danken dem Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen und der Heinrich Heine Universität in Düsseldorf für ein Stipendium für Lars Freier innerhalb der CLIB-Graduate Cluster industrielle Biotechnologie. Weitere Fördermittel erhielt von der Enabling Spaces Programm "Helmholtz-Innovation Labs" der deutschen Helmholtz-Gemeinschaft, die "mikrobielle Bioprocess Lab – A Helmholtz Innovation Lab" zu unterstützen.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die allgemeine Natur des vorliegenden Protokolls ermöglicht verschiedene Anpassungen, z.B.für die Untersuchung andere mikrobielle Ausdruck Gastgeber9,47,48,49,50, 51, oder andere Eigenschaften des Zielproteins, wie Glykosylierung Muster oder umgeformt Anleihen zu optimieren. Das Protokoll müssen auch an die verfügbaren Laborausrüstung angepasst werden. Die Integration eines MBR-Systems ermöglicht es, Erhöhung des experimentellen Durchsatzes, ermöglicht große Einsparungen in der Zeit. Allerdings muss beim Austausch der voll instrumentierter und kontrollierbaren Bioreaktoren von MBR Systems Skalierbarkeit der Ergebnisse8,37,52,53berücksichtigt werden. Die Verwendung von DOE Methoden und mathematische Modellierung hilft, um den Informationsgehalt von Messdaten in Bezug auf die untersuchten Objektive54 durch effiziente experimentelle Planung und Modell-basierten Daten Auslegung15zu maximieren.
Änderungen an der Methode Neben Mehrzweck- und erweiterbare Roboter Liquid handling Systeme wie die in dieser Studie verwendet sollte erwähnt werden, dass gibt es mehrere kleinere Liquid handling Systeme im Handel erhältlich, sind in der Lage, diese Aufgabe zu erfüllen und im Inneren platziert werden können der Laminar-Flow Werkbänke. Wenn kein automatisiertes Pipettierens System verfügbar ist, können unterschiedliche Medien Kompositionen nach dem DOE-Plan auch durch manuelle Pipettieren mit Einzel- und/oder Mehrkanal Pipetten realisiert werden. Da die manuelle Vorbereitung fehleranfälliger ist und hoch konzentriertes Arbeiten für eine lange Zeit benötigen, empfiehlt es sich, eine geringere Anzahl von verschiedenen Medien Kompositionen vorzubereiten.
Abhängig von den Fähigkeiten des eingesetzten MBR Systems wird das entsprechende Protokoll Anbau variieren. Zum Beispiel wenn keine Online-Messung der Biomasse Formation verfügbar ist, kann es ausreichen, um Biomasse Konzentration nach Beendigung des Experiments Wachstum zu messen sein. In Kombination mit der Online-Überwachung der pH-Wert und gelöstem Sauerstoff, die in mehreren MBR-Systemen implementiert wird, die Wachstum Sättigung sicher bestimmt werden kann. Im Prinzip können die Wachstumsversuchen im MTP allein in Inkubatoren, ohne den Einsatz eines MBR Systems schütteln platziert durchgeführt werden. In diesem Fall haben die richtigen Anbaubedingungen sichergestellt werden: (1) Sauerstoff-limitierte Bebauungen mit MTP mit geeigneten Geometrien in Kombination mit richtigen Frequenzen schütteln und schütteln, Durchmesser, z.B., Quadrat 96 oder 24 Tiefe vermieden werden Well-Platten bei 1.000 u/min bei 3 mm werfen oder bei 250 u/min bei 25 mm zu werfen, bzw. betrieben. Wichtig ist, sollte je niedriger die erreichbare maximale Sauerstoff-Übertragungsraten, desto geringer die wichtigsten Kohlenstoffquelle konzentriert werden. Wie bereits erwähnt, für diese Studie war die Verwendung von 10 g/L Glukose geeignet, Sauerstoff-Einschränkung für die Beschäftigten Anbaubedingungen zu verhindern; (2) Sampling der MTP Kulturen für Biomasse und Produkt Quantifizierung sollte auf ein Minimum reduziert werden. Jedes Mal, wenn die MTP aus dem Schütteln Inkubator entfernt wird Sauerstoffzufuhr wird sofort Abbau die ungünstigen Anbaubedingungen führen können; (3) in der Stellungnahme der Autoren ist die Verwendung von MTP Leser als Anbau-Geräte nicht empfohlen, da diese Geräte nicht für diesen Zweck entwickelt wurden. Z. B. Schütteln Mechanik wurden für gelegentliche Vermischung von Mikrotiterplatten nach der Zugabe des Reagenz gebaut und so oft fehlt Robustheit für hohe Auflagen von kontinuierlichen schütteln anhaltende tagelang. Darüber hinaus kann nicht ausreichend Leistungsaufnahme für mikrobielle Kulturen benötigt diese Leser realisiert werden. Die Integration von optischen Dichte Lesungen kurz Zeitintervalle erfordert Beendigung zitternder Bewegung, was zu wiederholten Perioden Sauerstoff Verjährungsfrist. Darüber hinaus wird die Verdunstung in solchen Systemen über lange Anbau Zeiträume Ergebnisse verzerren. Für mehr Details über die überraschend komplexe Thema MTP für mikrobielle Kulturen verwendet wird der Leser auf die zitierte Literatur22,23,24,25,26 bezeichnet. und verweist darin auf.
Weitere Überlegungen Zur iterativen Optimierungsschritte beschleunigen ist es ratsam, die analytische Methode zur Quantifizierung der Produkt sorgfältig auszuwählen. Schnelle und einfache Methoden ist auf Kosten der Präzision und Genauigkeit, vorzuziehen, da die iterative experimentelle Design-Strategie experimentelle Ungenauigkeit toleriert. Jedoch müssen die endgültigen Ergebnisse gegen hinreichend präzise und genaue Produkt Quantifizierungsmethoden überprüft werden, die möglicherweise etwas komplizierter. In der Regel die sorgfältige Auswertung und Entscheidungsfindung über die Abläufe erfordern Aufwand am Anfang der Studie, aber auf lange Sicht auszahlen, nachdem Routineverfahren etabliert haben.
Es wird dringend empfohlen, eine Referenz-Experiment, die ist im Vergleich zu allen Experimenten bei der Optimierung zu definieren. Das heißt, sind angewandte mittlere Komponente Konzentrationen und die gemessene Leistung durch Division durch Referenzwerte normalisiert. Auf diese Weise jede angewendet und Messwert kann als X-Fach des Referenzwerts interpretiert werden. Um Konto Variationen zwischen den Platten zu berücksichtigen, werden fünf Referenz Versuche auf jeder Platte durchgeführt. Der Mittelwert der gemessenen Ergebnisse dient der Normalisierung.
Es kann in der Regel nicht garantiert werden, dass die entwickelten Medium auch optimal für andere Stämme. Aber werden das bessere Medium höchstwahrscheinlich auch geeignet für den Anbau von Ausdruck Stämme mit kleinen genetischen Unterschiede, z.B.bei der Herstellung Enzymvarianten mit Aminosäure Substitutionen Mutagenese Studien (entnommen Obwohl sogar einzelne Punktmutationen Effekt Zellstoffwechsel und heterologen Expression Leistung55,56beschrieben wurden). In diesem Fall kann die vorgestellte Protokoll ein erster Schritt, gefolgt von Protokollen für Hochdurchsatz Ausdruck Vorführungen57. Wenn das Protokoll für mittlere Entwicklung mit nachfolgenden Scale-Up auf fed Batch Kultivierungen verwendet wird, sollte das optimale Medium für die entsprechenden Bioprozess-Bedingungen geprüft werden, das screening-Kampagnen auf die Microscale Klon identifiziert verschiedene top Darsteller für unterschiedliche Fütterung Strategien und Anbau Medien52,58. Darüber hinaus können die eingeführten KriKit36 in der Regel zu verbesserte ganzheitliche Bioprozess-Optimierung beitragen.Erst kürzlich wurden die Werkzeug-Fähigkeiten erweitert, um auch Multi-objektiven Optimierung40, unterstützen was wichtig für die Optimierung der beiden vor- und nachgelagerten Prozesse59,60sein kann.

Moderne rekombinante Gentechnologie ermöglicht die breite Verwendung von technischen Enzymen für verschiedene Anwendungen in der pharmazeutischen Industrie, Tierfütterung, organische Chemie und Lebensmittel-1,2,3. Die Produktion von technischen Enzymen in Großmengen ist ein wichtiges Thema für die industrielle Biotechnologie und für optimierte rekombinante Protein-Produktion, und beide belasten und Bioverfahrenstechnik ist erforderlich. Für die Erzeugung von effizient veränderter Produktionsstämme, verschiedene genetische Bibliotheken stehen zur Verfügung, z.B.für ausgewogene gen Expression4 oder vermehrte Ausschüttung Effizienz5.
Corynebacterium Glutamicum ist ein bedeutender Hersteller von Aminosäuren im industriellen Maßstab6,7 und stellt einen attraktive nichtkonventionellen Ausdruck Host für die sekretorischen Produktion rekombinanter Proteine8 ,9. Die allgemeine sekretorischen (Sec) und Twin-Arginin Translokation (Tat) Weg sind in C. Glutamicum und wurden erfolgreich für rekombinantes Protein Sekretion10angebracht. Umfangreiche Erfahrung in der Bioverfahrenstechnik über Aminosäure-Produktion im industriellen Maßstab sowie die Fähigkeit, Proteine zu g/L beträgt11 und große Robustheit bezüglich Bioprozess Inhomogenitäten in großem Maßstab gefunden absondern Bebauungen12,13, stellen C. Glutamicum einen vielversprechende Plattform Organismus für die sekretorischen Produktion von heterologen Proteinen im industriellen Maßstab.
Mittlere Optimierung Ernährung ist bekannt, rekombinanter Proteinproduktion mit mikrobieller Systeme14,15,16,17 und somit die Anpassung des Mediums zu verbessern Zusammensetzung ist ein lohnender Schritt in Bioprozess Entwicklung in Bezug auf optimale Produktivität18,19,20,21. Intensive Forschung auf der Anwendung von Mikrotiterplatten (MTP) für mikrobielle Kultivierung22,23,24 ebnete den Weg für die Entwicklung und Gestaltung von MTP für mikrobielle Kultivierung25 ,26 und die Entwicklung von MTP-basierte Microbioreactor (MBR) mit online-monitoring und ökologische Steuern27,28. MBRs ermöglichen eine deutliche Zunahme der experimentelle Anbau Durchsatz. Außerdem stehen MBR Systeme aufgrund von anderen Arten von Bioreaktoren, z.B., Blase Spalten oder Rührbehälters Reaktoren für mikrobielle Bioprozess Optimierung29,30,31, 32.
Optimierungsstudien profitieren in der Regel erhöhte experimentelle Durchsatz, der wird noch stärker in Kombination mit DOE-Methoden, beispielsweise zum bewerten Interaktionen zwischen Konstruktionsvariablen oder hochdimensionale Suche Räume reduzieren. Infolgedessen hat die kombinierte Verwendung von MBR-Systemen, Laborautomation und DOE erwies sich als eine leistungsfähige Methode in Biotechnologie8,16,33,34,35.
Ein Protokoll für Media-Optimierung ist Kombination von State-of-the-Art Laborautomation, MBR-Technologie mit Online-Prozessüberwachung und Kriging-basierte Daten-Analyse/experimentelles Design präsentiert. Die Kriging-Methode erfolgt in einer MATLAB Toolbox ("KriKit"), die heruntergeladen und verwendet werden können kostenlos kostenlos36. Maximierung der sekretorischen grüne ﬂuorescent Protein (GFP) Produktion mit C. Glutamicum zeigt als Anwendungsbeispiel Optimierung der Zusammensetzung des CgXII minimaler Medium. GFP-Titer war als Optimierung Ziel gewählt, da es leicht quantifiziert werden kann und es weithin als Modell Protein für Studien auf MBR Systeme37,38,39 gilt.
Die vorgestellte Rahmen gliedert sich in vier Schritte, die in Abbildung 1dargestellt sind. Die Schritte sind gekennzeichnet durch Box-Rahmen und Teile des Protokolls entsprechen. Der erste Schritt (Abbildung 1A) ist um die Projektziele zu definieren und die erforderlichen Methoden zu bestimmen. Die Kombination von DOE Methoden, MBR-Technologie und Laborautomation ermöglicht einen experimentelle Durchsatz, der leistungsstarke Datenverarbeitung erfordert. Der zweite Schritt (Abbildung 1 b) zielt darauf ab, sensibles Design Variablen (d.h.Mittelkomponenten) mit hohen Einfluss auf das Ziel der Optimierung zu erkennen. Dies führt zu einer Reduzierung der Konstruktionsvariablen von Interesse. Der dritte Schritt (Abbildung 1) umfasst eine iterative Optimierung für eine genauere Untersuchung der die funktionale Beziehung zwischen den verbleibenden Entwurfsvariablen und dem Ziel von Interesse. Verwendung des sukzessive erweiterten Datensatzes, ist der Kriging-Ansatz zum Vorhersage der experimentellen Ergebnisse an ungemessenen Standorten eingesetzt. Die iterative Zyklus stoppt, sobald das Kriging-Modell eine optimale oder Plateau mit ausreichender Genauigkeit vorhersagt. Die Ergebnisse werden im vierten Schritt (Abbildung 1), beginnend mit einer weiteren Sensitivitätsanalyse rund um den ermittelten optimalen überprüft. Wenn anfangs unempfindliche Komponenten gefunden werden, auch in den optimalen Bereich unempfindlich sein, ist es vernünftig anzunehmen, dass dies bei der iterativen Optimierung im dritten Schritt gilt. Danach ist es ratsam, Optimierungsergebnisse zu überprüfen durch Anwendung von orthogonalen Methoden, wie eine Aktivität-Assay oder SDS-Page.
Die allgemeine Natur des vorliegenden Protokolls ermöglicht einfache Anpassung an verschiedene Laborgeräte, andere Ausdruck Hosts und Zielproteine Wahl sowie weitere Bioprozess Variablen wie pH-Wert oder Anbau-Temperatur.Darüber hinaus können andere Optimierungsziele wie Protein Produktionsrate, spezifische Ertrag und Qualität des Produkts gewählt werden, in den Rahmen der anderen Optimierungsstudien zu passen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
Abbildung 1 : Workflow der Optimierungsstudie. Die vier Frame-Boxen entsprechen Teile des Protokolls "Konzeption der Studie und Definition of Methods" (Abschnitt 1), "Sensitivitätsanalyse" (Abschnitt 2), "Iterative Optimierung" (Abschnitt 3) und "Validierung" (Abschnitt 4). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioLector</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>G-BL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowerplate</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>MTP-48-BOH</td>
			<td>For cultivation in the BioLector device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing foil</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>F-GP-10</td>
			<td>Sterile sealing for Flowerplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>2016b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KriKit</td>
			<td>Forschungszentrum J&#252;lich</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Freely available, MATLAB installation required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus pipetting robot</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Includes &#34;WinPrep&#34; software installation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-column deep well microplate</td>
			<td>E&#38;K Scientific</td>
			<td>EK-2034</td>
			<td>Container for medium stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplates, transparent, F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td>For Bradford protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;clear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655087</td>
			<td>For flourescence measurement in cell-free supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Research&#160;plus multi-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Facilitates manual liquid handling with microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruPAG&#160;Precast Gels</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCG2002</td>
			<td>For SDS-Page analysis of cell-free supernantants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&#8211;42 (2007)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology

Ein Kerngeschäft in der industriellen Biotechnologie mit mikrobiellen Produktion Zellfabriken ist der iterative Prozess des Stamm-Engineering und Optimierung der Bioprozess-Bedingungen. Ein wichtiger Aspekt ist die Verbesserung der Anbau Mittel um ein optimales Umfeld für mikrobielle Entstehung des Produkts von Interesse. Es wird gut angenommen, dass die Medienkomposition Bioprozess Gesamtleistung erheblich beeinflussen kann. Mittlere Optimierung Ernährung tritt bekanntermaßen rekombinanten Proteins zu verbessern Herstellung mikrobieller Systeme und damit, dies ist ein lohnende Schritt in Bioprozess-Entwicklung. Jedoch sehr oft Standardmedien Rezepte aus Literatur, genommen werden, da maßgeschneiderte Design des Mediums Anbau ist eine mühsame Aufgabe, die Microbioreactor-Technologie für ausreichend Anbau Durchsatz sowie schnelle Produkt-Analysen und Unterstützung verlangt von Labor-Robotik Zuverlässigkeit im Umgang mit Schritte Flüssigkeit zu ermöglichen. Darüber hinaus sind fortschrittliche mathematische Methoden für rational analysieren Messdaten und effiziente Versuchsplanung parallel wie optimale Informationsgehalt zu erreichen.
Die allgemeine Natur des vorliegenden Protokolls ermöglicht einfache Anpassung an verschiedene Laborgeräte, andere Ausdruck Hosts und Zielproteine von Interesse, sowie weitere Bioprozess Parameter. Darüber hinaus können andere Optimierungsziele wie Protein Produktionsrate, spezifische Ertrag und Qualität des Produkts gewählt werden, in den Rahmen der anderen Optimierungsstudien zu passen. Die angewandte Kriging-Toolbox (KriKit) ist ein allgemeines Werkzeug für Design of Experiments (DOE), die zu verbesserten ganzheitliche Bioprozess Optimierung beiträgt. Es unterstützt auch Multi-objektiven Optimierung, die bei der Optimierung von vor- und nachgelagerten Prozesse wichtig sein kann.

Das eingeführte Protokoll wurde für die Maximierung der Titer von sekretierten GFP angewendet. Insbesondere die GFP Titer nach 17 h der Anbau als Optimierung Ziel gewählt wurde. Online-Fluoreszenz-Detektion von GFP erlaubt einfaches Produkt Quantifizierung. Die Normalisierung der GFP Signal mit Daten aus einem Referenz-Anbau ist jedoch unerlässlich, um die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Eine Vorauswahl von Medienkomponenten wurde auf eine rationale Grundlage durchgeführt, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Experimente wurden durchgeführt nach den Anweisungen von Abschnitt 1: die Parameter der nassen Lab Verfahren wurden für die gesamte Studie Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse definiert.
Wie in Abschnitt 2 beschrieben, wurde ein erstes Screening zur Identifizierung von relevanter Komponenten zeigen einen signifikanten Einfluss auf das Ziel der Optimierung für die weitere, detailliertere Studie durchgeführt. Das MTP-basierte MBR-System ermöglicht 48 Experimente parallel ausgeführt werden. Unter Berücksichtigung die maximal mögliche Anzahl von parallelen Experimente an einer MTP (48) und die Gesamtzahl der Medien-Komponenten (11) macht die 2IVentwerfen11-6 gebrochene eine geeignete Wahl. Dieses experimentelle Design umfasst 32 Experimente und erlaubt die Schätzung der Haupteffekt für jede der untersuchten Medienkomponenten. Die restlichen Anbau-Brunnen (16) dienten mehrere Wiederholungen der Experimente mit dem Referenzmedium, um Reproduzierbarkeit und positionelle Auswirkungen zu beurteilen. Das heißt, jedes Experiment wird einmal durchgeführt (keine Wiederholungen), mit Ausnahme des Referenz-Experiments (fünf Wiederholungen).
Tabelle 1 fasst die Ergebnisse des Screening-Analyse. Im betrachteten Konzentrationsbereich zeigen variieren die Mehrheit der Medienkomponenten nicht spürbar auf das Ziel. Komponente NH4+ zeigt eine starke negative Wirkung, während Ca2 + und Mg2 + die stärkste positive Tendenz zeigen. Die Wirkung von Mg2 + kann ist nicht für die aktuelle Konzentrationsbereich jedoch für einen breiteren Konzentrationsbereich. Infolgedessen entschied man, NH4+ vom Medium weglassen und die Wirkung von Ca2 + und Mg2 + in weiteren Experimenten zu untersuchen.
Abschnitt 3 beschreibt die iterative Optimierung Prozedur, die für die Maximierung der GFP-Fluoreszenz-Signal während der unterschiedlichen Konzentrationen von Ca2 + und Mg2 +verwendet wird. In Iteration 1 wurde die Hypothese, dass NH4+ kann weggelassen werden getestet. Der Konzentrationsbereich für Ca2 + und Mg2 + wurde von der Screening-Analyse angenommen. Die Mindestkonzentration von NH4+ wurde auf Null gesetzt und die maximale Konzentration des Screening-Tests angenommen wurde. In den folgenden Experimenten wurden die Komponente-Konzentrationen auf ein 3 x 3 x 3 Raster innerhalb der definierten Konzentrationsbereich, wodurch 27 Experimente verteilt. In allen Kulturen waren fünf Wiederholungen von Referenzmedium enthalten, dienten als interner Standard und sicherzustellen, dass keine positionale Effekte über die MTP aufgetreten. Für die verbleibenden 16 Brunnen wurden die Konzentrationen von NH4+, Ca2 +und Mg2 + nach dem Zufallsprinzip in den angegebenen Bereichen verteilt.
Abbildung 5 A visualisiert die Ergebnisse der ersten Iterationen. Achsenbezeichnungen beziehen sich auf die Komponente-Konzentrationen in der ursprünglichen Referenzmedium verwendet wird durch x Ref. Die blauen Flächen repräsentieren die Kriging-Interpolationen, die mithilfe der KriKit-Software berechnet wurden. Jede Oberfläche ist verbunden mit einer relativen Konzentration für NH4+ (dunkelblau: 0 x Ref, kariert: 1 x Ref, hellblau: 2 x Ref). Diese visuelle Darstellung zeigt, dass es günstig für NH4+weglassen. Interpolation Oberflächen zeigen auch die positiven Effekte der Mg2 + und Ca2 +, da alle Flugzeuge steigen mit zunehmender Konzentration.
Basierend auf den Ergebnissen der Iteration 1, wurde beschlossen, erweitern die Konzentration Palette von Ca2 + und Mg2 + durch eine Verdoppelung der maximalen Konzentrationen und verlagert das experimentelle Design-Fenster in der oberen rechten Ecke, siehe Abbildung 5 B. innerhalb dieses Bereichs wurden die Konzentrationen auf ein 6 x 6-Raster verteilt. Dies sorgt für eine gleichmäßige Verteilung über die volle Konzentrationsbereich, führt zu optimalen Ergebnissen der Kriging-Interpolation. Abbildung 5 B zeigt die Kriging Interpolation Handlung der kombinierten Daten anhand gemessen in beiden Iterationen (rote Punkte und gelbe Quadrate). Für Ca2 + und Mg2 +, setzt die positive Wirkung ihrer Konzentration zu erhöhen. Infolgedessen das Verfahren wurde durch die Verdoppelung der maximalen Konzentration wiederholt und so zog das experimentelle Design-Fenster, die Grenzen von der oberen rechten Ecke zu erkunden.
Abbildung 6 A enthält eine Übersicht über den restlichen Optimierungsverfahren. Die Analyse der gesammelten Daten bis zu Iteration 3 ergab, dass eine Einschränkung der positiven Wirkung von Mg2 +, d.h., eine optimale Konzentration Palette von Mg2 + identifiziert wurde. Es wurde daher beschlossen, den Konzentrationsbereich nur für Ca2 + (Iteration 4) weiter ausbauen. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt (Iteration 5 und 6) bis eine Sättigung der GFP-Signal gefunden wurde. Diese Sättigung wird durch Ausfällung von Ca-Salze für die angewandte Konzentrationen von Ca2 +, erklärt, die nicht zu den Zellen zur Verfügung stehen.
Versuchsergebnisse immer durch Lärm gestört sind, die sich daraus ergebenden Kriging-Interpolation erscheint unregelmäßig und Sichtprüfung kann zu falschen Schlussfolgerungen führen. Jedoch kann die optimale Konzentrationsbereich von Media-Komponenten für die gesättigten GFP Signal zuverlässig mit dem statistischen Z -Test, identifiziert werden, die auch in KriKit umgesetzt wird. Der Z -Test verwendet direkt die intrinsische statistische Angaben der Kriging-Methode, d. h., Vorhersagewerte und Prognose Unsicherheiten. Abbildung 6 B zeigt die identifizierten Plateau als entschlossene und visualisiert die KriKit Toolbox verwenden.Die KriKit Toolbox ist frei verfügbar36 und verfügt über eine ausführliche Anleitung, die erklärt, wie Sie ihre Funktionen nutzen.
Wenn mehr als zwei relevante Komponenten gefunden werden, erreicht 3D-Visualisierung seine Grenze. KriKit bietet mehrere andere mögliche visuelle Darstellung Methoden wie Filme oder "screening-Plot". Wenn das optimale Potential innerhalb der definierten Konzentrationsbereich liegt, sollen neue Experimente automatisch mit der erwarteten Verbesserung40,46. Das experimentelle Design auf der Grundlage der erwarteten Verbesserung ist in der Toolbox KriKit integriert. Detailliertere Informationen finden Sie in der Softwaredokumentation.
Nach dem iterativen Verfahren wurde eine Überprüfung der Ergebnisse durchgeführt, wie beschrieben in Teil D., Die Gültigkeit der ursprünglichen Annahmen wurde durch Ausführen einer zusätzlichen Sensitivitätsanalyse optimale mittlere Zusammensetzung überprüft. Das heißt, alle ursprünglichen Medienkomponenten von Interesse waren vielfältig, aber Ca2 + und Mg2 + wurden eingerichtet, um ihre optimale Konzentrationen. In dieser Studie, die optimalen Konzentrationen <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 x Ref und <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6,8 X Ref wurden ausgewählt. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Validierung Überprüfung. Ähnlich wie die anfängliche Empfindlichkeit screening (vgl. Tabelle 1), NH4+ hat immer noch einen erheblichen negativen Einfluss und übrigen Effekte sind immer noch vernachlässigbar.
Durch einfachen Zugang wurde die GFP Fluoreszenzsignal aus der Anbau-Suspension zur extrazellulären GFP-Titer bei allen Experimenten zu quantifizieren. Aus Gründen der Überprüfung wurde GFP Fluoreszenz gegen andere Messungen validiert. Da GFP über die Tat-Signalweg abgesondert wird, kann nicht das Fluoreszenzsignal zwischen Intra- und extrazellulären GFP unterscheiden. So wurden Kultivierungen wiedergegeben mit der Referenz und der optimierten Medium. Neben der Fluoreszenzmessung von zellfreien Anbau Überstände, Proteingehalt wurde quantifiziert durch die Bradford-Test und (Semi)-qualitative Verbesserung der GFP visualisiert durch SDS-Page15. Alle daraus resultierenden Messung signalisiert wurden etwa verdoppelt für Bebauungen mit optimierten Medium im Vergleich zu Referenzmedium und validiert die ca. 100 % Verbesserung der Leistung der Sekretion von optimierten Medium. Infolgedessen kann GFP spezifische Fluoreszenz der Anbau Aussetzung eine geeignete Metrik für Optimierung Ziel, d. h., die extrazelluläre GFP-Titer betrachtet werden.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Screenshot aus der Lautstärke Pipettieren Liste für Sensitivitätsanalyse. Einträge in der ersten Spalte weisen einen eindeutigen Bezeichner für alle Volumes einer Zeile; Dieser Bezeichner ist das MTP auch Nummer der Ziel-Anbau MTP auf dem liquid Handler Arbeitstisch, vgl. Abbildung 4C. Verbleibende Spalten kodieren Bände für verschiedene Lösungen ("Sln-01" bis "Sln-15") um pipettiert werden. Das Gesamtvolumen einer Zeile entspricht dem endgültigen Anbau Volumen des jeweiligen gut. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Screenshot aus der Flüssigkeit Umgang mit Steuer-Software "WinPREP". Links: Reihe angeordnete Befehle, einschließlich einen Transfer-Befehl für jede Vorratslösung zu pipettiert werden. Vor dem letzten Befehl für Inokulum Zusatz wird eine Benutzereingabeaufforderung eingefügt, um sicherzustellen, dass die Impfkultur just-in-Time am Tisch platziert wird. Rechts: Schematische Darstellung des Arbeitstisches, einschließlich der Quelle Labware für Variation Aktien (zwei Tiefbrunnen Platten mit 12 Spalte wie Brunnen), Reagenz Trog für Rest-Lager, Wasser und Inokulum und den Medien Vorbereitung Ziel Anbau MTP. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
Abbildung 4 : Zusammenstellung von ausführlichen Screenshots zum Einrichten von einer Stammlösung pipettieren. (A) Befehl zum Pipettieren von Fe Lager ausgepackt. Quelle Labware und Quelle gut sind innen auf dem Arbeitstisch lesen Sie Rahmen und rote Säule der entsprechenden Tiefbrunnen Platte geprägt. Reiseziel Labware und Zielort Brunnen innerhalb sind geprägt von den blauen Rahmen um und blauen Brunnen des Ziel-Anbaus MTP. (B) detaillierte Beispielansicht im Auftrag des Pipettierens Bände für diesen Schritt (Fe-Stammlösung). Anzahl der Destinationen wird aus der Pipettier Liste gelesen hat 48 Zeilen. Die Dispensierung Bände für alle Ziel-Brunnen für Fe-Stammlösung in Spalte 4 der Pipettier Liste gefunden wird. Beachten Sie, dass die erste Spalte in der Pipettier Liste enthält Bezeichner und Volumina nicht übertragen werden, siehe Abbildung 2. (C) Informationen über Reiseziel gut Nummerierung. Bände in der Reihe #1 der entsprechenden Pipettieren Liste geschrieben werden in Brunnen als #1 und So weiter gekennzeichnet pipettiert werden. Wells #01, #08, #41 und #48 entsprechen Brunnen A01, A08, F01 und F08 für die Alpha-numerische Codierung, die auch in den Anbau MTP selbst aufgedruckt ist. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
Abbildung 5 : Detaillierte Ergebnisse aus der ersten Iteration. (A) Kriging Interpolation anhand experimenteller Daten Iteration 1. Rote Punkte zeigen den Datensatz. Zum Vergleich: alle drei Interpolation Oberflächen sind in einem Diagramm überlagert (dunkelblau: 0 x Ref, kariert: 1 x Ref, hellblau: 2 x Ref). Eine alternative Darstellung der Ergebnisse finden Sie ebenfalls15. (B) Kriging Interpolation anhand der Experimente in Iteration 1 (rote Punkte) und Iteration 2 (gelbe Quadrate) durchgeführt.Teile der Daten in dieser Abbildung wurden zuvor veröffentlichten15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
Abbildung 6 : Darstellung der iterativ gesammelten Optimierungsergebnisse. (A) endgültige Kriging Modell Vorhersage. (B) statistische Identifikation des optimalen Bereichs (rot) basierend auf den statistischen Z-test, die KriKit bietet. Kästchen zeigen an aufeinander folgenden Schritten des iterativen Design und Durchführung von Experimenten. Teile der Daten in dieser Abbildung wurden zuvor veröffentlichten15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Normalisierter Koeffizient Mittelwert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0,08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>-0,05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI2 +</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0,10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0,03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO-33-</td>
			<td>0,06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Ergebnisse der Sensitivitätsanalyse. Die Werte der Koeffizienten, die durchschnittliche Wirkung darstellt, bei der Erhöhung der jeweiligen Komponente Medienkonzentration aus seiner Mitte Wert auf den maximalen Wert. Für optimalen experimentellen Designs, wie in der Standardliteratur gefunden und verwendet hier die Standardabweichung stellt direkt die experimentelle Variation durch die Replikation des Referenz-Experiments. Koeffizient Werte wurden durch den maximal-Wert (0.0422 für die Komponente Ca2 +) normalisiert. Normalisierte und absolute Koeffizient Standardabweichung beträgt 0,54 bzw. 0.0226.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Normalisierter Koeffizient Mittelwert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI2 +</td>
			<td>0.69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO-33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Ergebnisse der letzten Sensitivitätsanalyse. Die Werte der Koeffizienten, die durchschnittliche Wirkung darstellt, bei der Erhöhung der jeweiligen Komponente Medienkonzentration aus seiner Mitte Wert auf den maximalen Wert. Da eine optimale Versuchsplanung verwendet wurde, hängt die Standardabweichung nur die experimentelle Variante mit der optimierten mittlerer Zusammensetzung. Experimentelle Variante leicht erhöht im Vergleich zu der Variante mit dem Referenzmedium. Koeffizient Werte wurden durch den maximal-Wert (0.0106 für Komponente Mn2 +) normalisiert. Normalisierte und absolute Koeffizient Standardabweichung ist 3,63 und 0.0385, beziehungsweise.

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Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generischen Protokoll zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion mit automatisierten Microbioreactor Technologie

Dieses Manuskript beschreibt einen generischen Ansatz für maßgeschneiderte Gestaltung der mikrobiellen Anbau-Medien. Ermöglicht wird das durch einen iterativen Workflow kombinieren Kriging-basierte experimentelle Design und Microbioreactor Technologie für ausreichend Anbau Durchsatz, gestützt durch Labor-Robotik, Zuverlässigkeit und Schnelligkeit in Flüssigkeit Umgang mit Medien zu erhöhen Vorbereitung.

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Entwickeln von benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Wirtszellprotein Assays mit Akustikvlies Mikropartikeltechnologie

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Forschung

Biotechnik

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: eine automatisierte Plattform für Biomasse Enzym-Entdeckung und Cocktail-Optimierung

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

Hochdurchsatz-, Automated Extraktion von DNA und RNA aus klinischen Proben mit TruTip Technologie Gemeinsames Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menschliches Knorpelgewebe Herstellung unter Verwendung von dreidimensionalen Inkjet-Drucktechnologie

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Herstellung von Chemikalien durch<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Bambushydrolysat als Ausgangsmaterial verwenden

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Reinigung und Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus chinesischen Hamster-Ovarialzellen mit einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Prozessoptimierung mit automatisierten Mikro-Bioreaktoren mit hohem Durchsatz in der chinesischen Hamster-Ovarialzell-Kultivierung

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...