Name: generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

L'attività scientifica del centro di scienza di bioeconomia era sostenuto finanziariamente dal Ministero dell'innovazione, scienza e della ricerca nell'ambito della BioSC NRW-Strategieprojekt (n. 313/323-400-002 13). Gli autori ringraziano il Ministero dell'innovazione, scienza e ricerca della Renania settentrionale-Vestfalia e Heinrich Heine University Düsseldorf per una borsa di studio a Lars Freier entro la biotecnologia industriale di Cluster CLIB-Graduate. Ulteriori finanziamenti è stato ricevuto dal programma di spazi di abilitazione "Helmholtz Innovation Labs" dell'Associazione Helmholtz tedesco per sostenere la "microbica Bioprocess Lab – A Helmholtz Innovation Lab".

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il carattere generico del protocollo presentato permette vari adattamenti, ad esempio, per studiare altri espressione microbica ospita9,47,48,49,50, 51, o per ottimizzare altre proprietà della proteina dell'obiettivo, come le obbligazioni di pattern o bisolfuro di glicosilazione. Il protocollo inoltre devono essere adattati per l'attrezzatura di laboratorio disponibili. L'integrazione di un sistema MBR permette di aumentare il throughput sperimentale, che consente un grande risparmio nel tempo. Tuttavia, quando sostituisce completamente strumentati e controllabile bioreattori di sistemi MBR, scalabilità dei risultati deve essere considerata8,37,52,53. L'utilizzo di metodologie DOE e modellazione matematica aiuta a massimizzare il contenuto informativo dei dati di misurazione rispetto l' oggettiva studiati54 da un'efficiente pianificazione sperimentale e interpretazione di dati basati su modello15.
Modifiche al metodo Accanto a multi-purpose ed espandibile robotica manipolazione dei liquidi sistemi come quello utilizzato in questo studio, va ricordato che ci sono parecchi più piccolo liquido sistemi disponibili in commercio che sono in grado di eseguire questa operazione e possono essere inseriti all'interno di movimentazione di banchi di lavoro a flusso laminare. Se nessun sistema di pipettaggio automatizzato è disponibile, composizioni di diversi media secondo il disegno DOE possono essere realizzate anche pipettando manuale utilizzando pipette mono e/o multi-canale. Poiché la preparazione manuale è più soggetto a errori e richiederà un lavoro altamente concentrato per un tempo abbastanza lungo, si consiglia di preparare un numero inferiore di composizioni di diversi media.
A seconda delle capacità del sistema MBR autonomo, varierà il corrispondente protocollo di coltivazione. Ad esempio, se non è disponibile alcuna misurazione online di formazione di biomassa, può essere sufficiente a misurare la concentrazione di biomassa dopo il completamento dell'esperimento di crescita. In combinazione con monitoraggio on-line il pH e l'ossigeno disciolto, che viene implementato in diversi sistemi MBR, la saturazione di crescita può essere determinata in modo sicuro. In linea di principio, gli esperimenti di crescita possono essere condotti in MTPs da solo collocato all'interno di agitazione incubatori, senza l'uso di un sistema MBR. In questo caso, le condizioni di corretta coltivazione necessario garantire: (1) ossigeno limitato coltivazioni possono essere evitato utilizzando MTPs con geometrie adatte, in combinazione con adeguata agitazione frequenze e scuotendo diametri, ad esempio, Piazza 96 o 24 profonda piatti ben operato a 1.000 giri/min a tiro di 3 mm o a 250 rpm a passi di 25 mm, rispettivamente. D'importanza, più basso i tassi di trasferimento di ossigeno massimo realizzabile, minore sarà la fonte principale di carbonio deve essere concentrata. Come accennato in precedenza, per questo studio, l'uso di 10 g/L glucosio era idoneo a prevenire la limitazione di ossigeno per le condizioni di coltivazione impiegato; (2) il campionamento delle culture MTP per quantificazione biomassa e prodotto dovrebbe essere ridotto al minimo. Ogni volta che il MTP è rimosso dall'incubatrice agitazione, trasferimento di ossigeno sarà immediatamente ripartizione che può provocare condizioni di coltivazione sfavorevole; (3) nel parere degli autori, l'uso dei lettori MTP come dispositivi di coltivazione non è raccomandato come questi dispositivi non sono stati sviluppati per questo scopo. Ad esempio, agitazione meccanica sono stati costruiti per la miscelazione occasionale di micropiastre dopo l'aggiunta del reagente e così, spesso mancanza di robustezza per lunghe percorrenze di agitazione continua durare per giorni. Inoltre, non può essere realizzato sufficienti input di alimentazione necessario per colture microbiche in questi lettori. L'integrazione delle letture di densità ottica in breve intervalli di tempo richiede arresto del movimento d'agitazione, conseguente a ripetuti periodi di prescrizione di ossigeno. Inoltre, evaporazione in tali sistemi su periodi lunghi coltivazione sarà falsare i risultati. Per maggiori dettagli sull'argomento sorprendentemente complesso sull'utilizzo MTPs per colture microbiche, si rimanda il lettore alla letteratura citata22,23,24,25,26 e bibliografia citata.
Ulteriori considerazioni Per fasi di ottimizzazione iterativa di Speed-up, si consiglia di selezionare con attenzione il metodo analitico per la quantificazione del prodotto. Veloci e semplici metodi dovrebbero essere preferiti al costo di precisione e accuratezza, come la strategia di disegno sperimentale iterativo tollera sperimentale inesattezza. Tuttavia, i risultati finali devono essere verificati contro metodi di quantificazione del prodotto sufficientemente precise ed accurate che potrebbero essere più complicati. In generale, un'attenta valutazione e il processo decisionale circa le procedure di studio richiedono impegno all'inizio dello studio, ma pagare a lungo termine, dopo i metodi di routine sono stati stabiliti.
Si consiglia di definire un esperimento di riferimento che è rispetto a tutti gli esperimenti durante l'ottimizzazione. Cioè, le concentrazioni medie applicate componente così come uscita misurata è normalizzato tramite dividendo per i valori di riferimento. In questo modo, ciascuno applicato e il valore misurato può essere interpretato come la x-piega del valore di riferimento. Per tener conto delle variazioni tra le piastre, cinque esperimenti di riferimento vengono eseguiti su ogni piatto. Il valore medio dei risultati misurati viene utilizzato per la normalizzazione.
Non può generalmente essere garantito che il mezzo sviluppato è anche ottimo per altri ceppi. Tuttavia, il mezzo migliore probabilmente sarà anche appropriato per coltivare ceppi di espressione con piccole differenze genetiche, per esempio, quando produrre varianti di enzima con singolo amminoacido sostituzioni ottenuti da (studi di mutagenesi anche se per effetto di metabolismo cellulare e l'espressione eterologa prestazioni55,56, sono state descritte anche singole mutazioni puntiformi). In questo caso, il protocollo presentato può essere un primo passo, seguito da protocolli per espressione high-throughput screening57. Se il protocollo viene utilizzato per lo sviluppo medio con successiva scala-fino a coltivazioni di fed-batch, il supporto ottimizzato deve essere verificato per le corrispondenti condizioni di bioprocessi, come clone campagne a Microscala di screening identificato diversi top interpreti per diverse strategie d'alimentazione e coltivazione media52,58. Inoltre, l'introdotto KriKit36 generalmente possono contribuire alla ottimizzazione migliorata bioprocessi olistico.Solo di recente, le abilità di strumento sono estesi per supportare anche ottimizzazione multi-obiettivo40, che può essere importante per l'ottimizzazione di entrambi i processi a Monte e a valle59,60.

La tecnologia moderna gene ricombinante consente l'ampio uso di enzimi tecnici per varie applicazioni nell'industria farmaceutica, zootecnia, chimica organica e1,2,3di trasformazione alimentare. La produzione di enzimi tecnici allo stato sfuso è un argomento importante per la biotecnologia industriale e per la produzione di proteine ricombinanti ottimizzato ed entrambi colare e ingegneria di bioprocess è necessaria. Per la generazione di ceppi ingegnerizzati in modo efficiente produzione, librerie genetiche differenti sono disponibili, ad esempio, per equilibrato gene expression4 o secrezione aumentata efficienza5.
Glutamicum del corinebatterio è un importante produttore di aminoacidi alla scala industriale6,7 e rappresenta un host attraente espressione non convenzionali per la produzione di secrezione di proteine ricombinanti8 ,9. Sia il generale secretiva (Sec) e la via di twin-arginina traslocazione (Tat) sono presenti in c. glutamicum e sono state applicate correttamente per proteina ricombinante secrezione10. Vasta esperienza nell'ingegneria dei bioprocessi per quanto riguarda la produzione dell'amminoacido a scala industriale, come pure la capacità di secernere proteine g/L importi11 e grande robustezza relativa disomogeneità di bioprocessi trovato in larga scala coltivazioni12,13, effettuare c. glutamicum un organismo piattaforma promettente per la produzione di secrezione delle proteine eterologhe in scala industriale.
Ottimizzazione media nutrizione è noto per migliorare la produzione di proteine ricombinanti con sistemi microbici14,15,16,17 e di conseguenza, la regolazione del mezzo composizione è un passo gratificante in bioprocessi sviluppo per quanto riguarda la produttività ottimale18,19,20,21. Intense ricerche sull'applicazione delle piastre di microtitolazione (MTPs) per coltura microbica22,23,24 ha spianato la strada per lo sviluppo e la progettazione di MTPs per coltura microbica25 ,26 e lo sviluppo di sistemi basati su MTP microbioreactor (MBR) con monitoraggio on-line e ambientale controllo27,28. MBR permettono un significativo aumento della velocità effettiva coltivazione sperimentale. Inoltre, sono disponibili per bioprocessi microbica ottimizzazione29,30,31, sistemi MBR derivanti da altri tipi di bioreattori, ad esempio, bolla colonne o agitata serbatoio reattori, 32.
In generale, gli studi di ottimizzazione beneficiano della maggiore velocità effettiva sperimentale, che diventa ancora più potente in combinazione con metodologie DOE, ad esempio per valutare le interazioni tra le variabili di progetto o ridurre gli spazi di ricerca alto-dimensionali. Di conseguenza, l'uso combinato di sistemi MBR, automazione di laboratorio e DOE ha dimostrato di essere un metodo efficace nella biotecnologia8,16,33,34,35.
Un protocollo per l'ottimizzazione dei media è presentato combinando automazione di laboratorio state-of-the-art, tecnologia MBR con monitoraggio online di processo e progettazione sperimentale/analisi dati basati su Kriging. La metodologia di Kriging è implementata in una Toolbox di MATLAB ("KriKit") che può essere scaricato e utilizzato gratuitamente carica36. Come esempio di applicazione, massimizzazione della produzione di proteine (GFP) secretiva ﬂuo verde con c. glutamicum è mostrato ottimizzando la composizione del terreno minimo CgXII. Titolo GFP è stato scelto come l'obiettivo di ottimizzazione come esso può essere facilmente quantificato e ampiamente si applica come proteina di modello per lo studio del MBR sistemi37,38,39.
Il quadro presentato è diviso in quattro fasi, che sono illustrati nella Figura 1. I passaggi sono indicati da cornici di casella e corrispondono alle sezioni del protocollo. Il primo passo (Figura 1A) è di definire gli obiettivi di progetto e di determinare i metodi richiesti. La combinazione di metodologie DOE, tecnologia MBR e automazione di laboratorio consente un aumentare il throughput sperimentale che richiede potente elaborazione di dati. Il secondo passo (Figura 1B) mira a rilevare le variabili design sensibile (cioè, componenti medie) con alta influenza sull'obiettivo ottimizzazione. Questo porta ad un ridotto numero di variabili di progetto di interesse. Il terzo passo (Figura 1) comprende un'ottimizzazione iterativa per una ricerca più dettagliata del rapporto funzionale tra le restanti variabili di progetto e l'obiettivo di interesse. Utilizzando il set di dati successivamente estesi, l'approccio di Kriging è applicato per prevedere il risultato sperimentale alle posizioni non misurati. Il ciclo iterativo si arresta non appena il modello Kriging predice un'ottimale o altopiano con sufficiente precisione. I risultati sono verificati nel quarto passaggio (Figura 1), a partire da un'ulteriore analisi di sensibilità intorno l'optimum identificato. Se inizialmente, insensibile componenti si trovano ad per essere insensibili anche nella regione ottima, è ragionevole supporre che questo vale durante la procedura di ottimizzazione iterativa nel terzo passo. In seguito, si consiglia di verificare i risultati di ottimizzazione di applicazione dei metodi ortogonali, come un saggio di attività o SDS-Page.
Il carattere generico del protocollo presentato consente facile adattamento di attrezzature di laboratorio diversi, altri host espressione e proteine bersaglio di scelta, così come ulteriori bioprocessi variabili come la temperatura di valore o coltivazione di pH.Inoltre, altri obiettivi di ottimizzazione come tasso di produzione di proteina, resa specifica o qualità del prodotto possono essere scelti per adattarsi l'ambito di altri studi di ottimizzazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
Figura 1 : Flusso di lavoro di studio di ottimizzazione. I quattro riquadri corrispondono alle sezioni del protocollo, "Concepire the studio e definizione di metodi" (sezione 1), "Sensitivity Analysis" (sezione 2), "Ottimizzazione iterativa" (sezione 3) e "Convalida" (sezione 4). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioLector</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>G-BL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowerplate</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>MTP-48-BOH</td>
			<td>For cultivation in the BioLector device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing foil</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>F-GP-10</td>
			<td>Sterile sealing for Flowerplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>2016b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KriKit</td>
			<td>Forschungszentrum J&#252;lich</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Freely available, MATLAB installation required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus pipetting robot</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Includes &#34;WinPrep&#34; software installation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-column deep well microplate</td>
			<td>E&#38;K Scientific</td>
			<td>EK-2034</td>
			<td>Container for medium stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplates, transparent, F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td>For Bradford protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;clear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655087</td>
			<td>For flourescence measurement in cell-free supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Research&#160;plus multi-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Facilitates manual liquid handling with microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruPAG&#160;Precast Gels</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCG2002</td>
			<td>For SDS-Page analysis of cell-free supernantants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&#8211;42 (2007)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology

Un core business in biotecnologie industriali utilizzando fabbriche di produzione microbica delle cellule è il processo iterativo di ceppo ingegneria e ottimizzazione delle condizioni di bioprocessi. Un aspetto importante è il miglioramento di medium di coltivazione per fornire un ambiente ottimale per la formazione microbica del prodotto di interesse. È ben accettato che la composizione media può influire notevolmente le prestazioni complessive di bioprocessi. Ottimizzazione media nutrizione è noto per migliorare la proteina ricombinante produzione con sistemi microbici e, quindi, questo è un gratificante passo nello sviluppo di bioprocessi. Tuttavia, ricette molto spesso standard multimediali sono tratti dalla letteratura, poiché la progettazione su misura di medium di coltivazione è un compito noioso che richiede tecnologia microbioreactor per una velocità effettiva coltivazione sufficiente, analitica rapida del prodotto, così come supporto di robotica lab per abilitare affidabilità nelle operazioni di gestione dei liquidi. Inoltre, metodi matematici avanzati sono necessari per analizzare razionalmente i dati di misura e in modo efficiente progettazione di esperimenti paralleli come raggiungere contenuto informativo ottimale.
Il carattere generico del protocollo presentato consente facile adattamento alla strumentazione di laboratorio diversi, altri host espressione e proteine bersaglio di interesse, così come ulteriori parametri di bioprocessi. Inoltre, altri obiettivi di ottimizzazione come tasso di produzione di proteina, resa specifica o qualità del prodotto possono essere scelti per adattarsi l'ambito di altri studi di ottimizzazione. Il Toolbox di Kriging applicata (KriKit) è uno strumento generale per progettazione di esperimenti (DOE) che contribuisce alla ottimizzazione migliorata bioprocessi olistico. Supporta anche ottimizzazione multi-obiettivo che può essere importante nell'ottimizzare processi upstream e downstream.

Il protocollo introdotto è stato applicato per massimizzare il titolo di GFP secrete. In particolare, il titolo GFP dopo 17h di coltivazione è stato scelto come l'obiettivo di ottimizzazione. Rilevazione della fluorescenza online di GFP ammessi quantificazione semplice prodotto. Tuttavia, la normalizzazione del segnale GFP con dati da una coltura di riferimento è indispensabile per garantire la riproducibilità e la comparabilità dei risultati. Una pre-selezione di componenti multimediali è stata effettuata su una base razionale, come descritto nella sezione 1. Gli esperimenti sono stati effettuati seguendo le istruzioni della sezione 1: sono stati definiti i parametri delle procedure di laboratorio bagnato per lo studio di tutto assicurando la coerenza e la riproducibilità dei risultati.
Come descritto nella sezione 2, è stato effettuato un primo screening per l'identificazione di componenti rilevanti mostrano un impatto significativo sull'obiettivo ottimizzazione per lo studio ulteriore e più dettagliato. Il sistema MBR basati su MTP permette 48 esperimenti per essere eseguite in parallelo. Tenendo conto del massimo numero possibile di esperimenti paralleli su un MTP (48) e il numero totale di marche di supporti componenti (11) il 2IV11-6 frazionario progettare una scelta appropriata. Questo disegno sperimentale comprende 32 esperimenti e permette la stima dell'effetto principale per ciascuno dei componenti multimediali studiati. I restanti pozzetti di coltivazione (16) sono stati utilizzati per più ripetizioni di esperimenti con il mezzo di riferimento per valutare la riproducibilità ed effetti posizionali. Cioè, ogni esperimento è condotto una volta (non repliche), salvo l'esperimento di riferimento (cinque repliche).
La tabella 1 riassume i risultati dell'analisi di screening. Nella gamma di concentrazione considerata, variando la maggior parte dei componenti media non ha mostrato un effetto evidente sull'obiettivo. Componente di NH4+ Mostra un forte effetto negativo, mentre Ca2 + e Mg2 + mostrano la più forte tendenza positiva. L'effetto di Mg2 + non è significativo per l'attuale gamma di concentrazione, ma potrebbe essere per una più ampia gamma di concentrazione. Di conseguenza, è stato deciso di omettere NH4+ dal mezzo e per studiare l'effetto di Ca2 + e Mg2 + in ulteriori esperimenti.
Sezione 3 descrive la procedura di ottimizzazione iterativa che viene utilizzata per massimizzare il segnale di fluorescenza di GFP pur variando le concentrazioni di Ca2 + e Mg2 +. Nell'iterazione 1, è stato testato l'ipotesi che NH4+ può essere omesso. L'intervallo di concentrazione per Ca2 + e Mg2 + è stato adottato dall'analisi di screening. La concentrazione minima di NH4+ è stata impostata su zero e la concentrazione massima è stata adottata dall'esperimento lo screening. Nei seguenti esperimenti, le concentrazioni di componente sono state distribuite sopra un 3 × 3 × 3 griglia all'interno dell'intervallo di concentrazione definita, con conseguente 27 esperimenti. Durante tutte le colture, cinque repliche di medie di riferimento sono stati inclusi, che ha servito come standard interno e per garantire che si è verificato nessun effetti posizionali sopra il MTP. Per i restanti 16 pozzetti, le concentrazioni di NH4+, Ca2 +e Mg2 + sono state distribuite in modo casuale all'interno delle gamme data.
Figura 5 A Visualizza i risultati delle prime iterazioni. Le etichette dell'asse si riferiscono alle concentrazioni componente utilizzate nel mezzo di riferimento originale, indicato dalla x Ref. Le superfici blue rappresentano le interpolazioni Kriging che sono state calcolate utilizzando il software KriKit. Ogni superficie è associato un livello di concentrazione relativa per NH4+ (blu scuro: 0 x Ref, a scacchi: 1 x Ref, blu chiaro: 2 x Ref). Questa rappresentazione visiva rivela che è favorevole per omettere NH4+. Superfici di interpolazione mostrano anche gli effetti positivi di Mg2 + e Ca2 +, come tutti gli aerei aumento con concentrazioni crescenti.
Sulla base dei risultati dell'iterazione 1, si decise di espandere la concentrazione gamma di Ca2 + e Mg2 + raddoppiando le concentrazioni massime e spostando la finestra di progettazione sperimentale verso l'angolo superiore destro, vedere la Figura 5 B. all'interno di questa gamma, le concentrazioni sono state distribuite su una 6x6 griglia. Ciò garantisce una distribuzione uniforme sopra la gamma di piena concentrazione, portando a risultati ottimali di interpolazione Kriging. Figura 5 B Mostra la trama di interpolazione Kriging basata su dati combinati misurato in entrambe le iterazioni (puntini rossi e quadrati gialli). Per entrambi, Ca2 + e Mg2 +, continua l'effetto positivo delle loro concentrazioni aumentanti. Di conseguenza, la procedura è stata ripetuta raddoppiando la massima concentrazione e così, la finestra di progettazione sperimentale è stata spostata per esplorare i confini dell'angolo superiore destro.
Figura 6 A dà una panoramica della procedura di ottimizzazione rimanenti. L'analisi del set di dati raccolti fino a iterazione 3 ha rivelato che una limitazione dell'effetto positivo di Mg2 +, cioè, una concentrazione ottimale gamma di Mg2 + è stata identificata. Si decise pertanto di ampliare ulteriormente la gamma di concentrazione solo per Ca2 + (iterazione 4). Questa procedura è stata ripetuta due volte (iterazione 5 e 6) fino a quando non è stata trovata una saturazione del segnale GFP. Questa saturazione è spiegata dalla precipitazione di sali di Ca per le concentrazioni applicate di Ca2 +, che non sono disponibili per le cellule.
Come risultati sperimentali sono sempre turbati dal rumore, l'interpolazione Kriging risultante appare irregolare e ispezione visiva potrebbe condurre a conclusioni false. Tuttavia, la gamma di concentrazione ottimale di componenti multimediali per il segnale GFP saturo può essere identificata attendibilmente con lo statistica z -test, che viene inoltre implementato in KriKit. Il test z -utilizza direttamente le intrinseche informazioni statistiche fornite da Kriging metodo, cioè, i valori di previsione e incertezze di pronostico. Figura 6 B Mostra l'altopiano identificato, come determinato e visualizzati utilizzando KriKit casella degli strumenti.Casella degli strumenti KriKit è liberamente disponibile36 e viene fornito con un dettagliato tutorial che spiega come utilizzare le sue caratteristiche.
Se vengono trovati più di due componenti rilevanti, visualizzazione 3D raggiunge il limite. KriKit fornisce diversi altri metodi di rappresentazione visiva possibile quali film o "trama di screening". Se il potenziale ottima si trova all'interno dell'intervallo di concentrazione definita, nuovi esperimenti automaticamente sono progettati utilizzando il miglioramento previsto40,46. Il disegno sperimentale basato sul miglioramento previsto è integrato nel pannello degli strumenti KriKit. Informazioni più dettagliate si trovano nella documentazione del software.
Dopo la procedura iterativa, è stata condotta una verifica dei risultati, come descritto nella parte D. La validità dell'ipotesi iniziale era controllata eseguendo un'analisi di sensibilità aggiuntivi utilizzando la composizione media ottimale. Cioè, tutti i componenti di media iniziale di interesse sono state varie, ma Ca2 + e Mg2 + sono stati impostati i livelli di concentrazione ottimale. In questo studio, le concentrazioni ottimali <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 x Ref e <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6,8 x Ref sono stati scelti. La tabella 2 Mostra i risultati dello screening convalida. Simile alla sensibilità iniziale di screening (cfr. tabella 1), NH4+ ancora ha una notevole influenza negativa e restanti effetti sono ancora trascurabili.
Grazie al facile accesso, il segnale di fluorescenza di GFP dalla sospensione di coltivazione è stato utilizzato per quantificare il titolo GFP extracellulare durante tutti gli esperimenti. Per motivi di verifica, fluorescenza GFP è stata convalidata contro altre misurazioni. Perché GFP è secreta via la via di Tat, il segnale di fluorescenza non può discriminare tra intra - ed extracellulare GFP. Così, coltivazioni sono state riprodotte utilizzando il mezzo di riferimento e il supporto ottimizzato. Oltre alla misura di fluorescenza da surnatanti di coltura senza cellula, contenuto proteico è stato quantificato dall'analisi di Bradford e (semi)-miglioramento qualitativo di GFP visualizzata da SDS-Page15. Misura risultante tutti i segnali erano approssimativamente raddoppiato per coltivazioni con mezzo ottimizzato rispetto alle medie di riferimento e convalidato i circa 100% di miglioramento delle prestazioni di secrezione del mezzo ottimizzato. Di conseguenza, la fluorescenza specifica GFP della sospensione di coltivazione può essere considerata una metrica adatta per l'obiettivo di ottimizzazione, vale a dire, il titolo GFP extracellulare.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
Figura 2 : Screenshot dall'elenco per analisi di sensitività pipettaggio volume. Le voci nella prima colonna assegna un identificatore univoco a tutti i volumi di una riga; Questo identificatore è il MTP ben numero della coltivazione destinazione MTP sul piano liquido gestore, cfr . Figura 4C. Restanti colonne encode volumi per diverse soluzioni ("Sln-01" a "Sln-15") per essere dispensato. Il volume cumulativo di una riga corrisponde al volume finale di coltivazione del corrispondente bene. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
Figura 3 : Screenshot dal liquido gestione software di controllo "WinPREP". Sinistra: Ordinato da riga comandi, tra cui un comando di trasferimento per ogni soluzione di riserva essere dispensato. Prima il comando finale per aggiunta di inoculo, è inserito un prompt utente affinché che la cultura di seme è posto al tavolo giusto in tempo. A destra: Disegno schematico del worktable, compresi l'attrezzatura di laboratorio di origine per variazione delle scorte (due piastre pozzi profondo con 12 pozzetti colonna-like), il trogolo di reagente per resto Stock, acqua e inoculo e la coltivazione di destinazione di preparazione media MTP. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
Figura 4 : Compilazione delle schermate dettagliate per l'installazione del pipettaggio di una soluzione di riserva. (A) comando per il pipettaggio di Stock in Fe da scartare. Labware fonte e origine ben all'interno sono contrassegnati sul piano di lettura telaio e colonna rossa della piastra pozzo profondo corrispondente. Labware destinazione e pozzi di destinazione all'interno sono contrassegnati dal telaio blu intorno e blu pozzi della coltivazione destinazione MTP. (B) Vedi esempio dettagliato su incarico di pipettaggio volumi per questo passaggio (soluzione Fe). Numero di destinazioni viene letto dall'elenco pipettaggio, quale ha 48 righe. I volumi di erogazione per tutti i pozzi di destinazione per la soluzione Fe è individuato nella colonna 4 l'elenco pipettaggio. Si noti che la prima colonna nell'elenco pipettaggio contiene gli identificatori e non volumi per essere trasferiti, Vedi Figura 2. (C) Dettagli sulla destinazione ben numerazione. Volumi scritti nella riga #1 dell'elenco pipettaggio corrispondente verranno essere pipettati in pozzo contrassegnato come #1 e così via. Wells #01, #08, #41 e #48 corrispondono a pozzi A01, A08, F01 e F08 per la codifica alfa-numerico, che è anche stampato in coltivazione MTP stessa. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
Figura 5 : Risultati dalla prima iterazione dettagliati. (A) interpolazione Kriging basata su dati sperimentali di iterazione 1. Punti rossi indicano il set di dati. Per confronto, tutte le superfici di interpolazione tre sono sovrapposti in una trama (blu scuro: 0 x Ref, a scacchi: 1 x Ref, blu chiaro: 2 x Ref). Una rappresentazione alternativa dei risultati può essere trovata altrove15. (B) interpolazione Kriging basata sugli esperimenti eseguiti in iterazione 1 (punti rossi) e iterazione 2 (quadrati gialli).Parti dei dati presentati in questa figura sono stati precedentemente pubblicati15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
Figura 6 : Rappresentazione dei risultati di ottimizzazione in modo iterativo raccolti. Kriging finale (A) modello di previsione. (B) Identificazione statistica dell'area ottima (rosso) basato sulla statistica z-test, che è fornito da KriKit. Riquadri indicano le fasi successive di progettazione iterativa ed esecuzione degli esperimenti. Parti dei dati presentati in questa figura sono stati precedentemente pubblicati15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Valore medio coefficiente normalizzato</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0,08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>-0,05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI2 +</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0,10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0,03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>0,06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: risultati delle analisi di sensibilità. Valori del coefficiente che rappresenta l'effetto medio quando si aumenta la concentrazione del componente rispettivi media rispetto al valore di centro al suo valore massimo. Per ottimale disegni sperimentali, come trovato in letteratura standard e utilizzato qui, la deviazione standard rappresenta direttamente la variazione sperimentale a causa della replica dell'esperimento di riferimento. Valori del coefficiente sono stati normalizzati dal valore maxium (0,0422 per componente Ca2 +). Deviazione standard coefficiente normalizzato e assoluto è 0.54 e 0.0226, rispettivamente.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Valore medio coefficiente normalizzato</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0,52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI2 +</td>
			<td>0,69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0,51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0,45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: risultati delle analisi di sensibilità finale. Valori del coefficiente che rappresenta l'effetto medio quando si aumenta la concentrazione del componente rispettivi media rispetto al valore di centro al suo valore massimo. Come è stato utilizzato un disegno sperimentale Ottimo, la deviazione standard dipende solo la variazione sperimentale utilizzando la composizione media ottimizzata. Variazione sperimentale è leggermente aumentato rispetto la variazione utilizzando il mezzo di riferimento. Valori del coefficiente sono stati normalizzati dal valore maxium (0.0106 per componente Mn2 +). Deviazione standard coefficiente normalizzato e assoluto è 3.63 e 0.0385, rispettivamente.

Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Protocollo generico per l'ottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando tecnologia automatizzata di Microbioreactor

Questo manoscritto descrive un approccio generico per la progettazione su misura di media di coltura microbica. Questa opzione è attivata da un flusso di lavoro iterativo che unisce Kriging sperimentale design e microbioreactor tecnologia per una velocità effettiva coltivazione sufficiente, che è supportata da robotica lab per aumentare affidabilità e velocità nella gestione dei mezzi liquidi preparazione.

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Sviluppo di ovaio di criceto cinese-dosaggi delle proteine ​​della cellula ospite con la tecnologia Acoustic microparticelle di membrana

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Ricerca

Bioingegneria

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: una piattaforma automatizzata per la scoperta degli enzimi biomassa e ottimizzazione Cocktail

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

Ad alta velocità, l&#39;estrazione automatizzata di DNA e RNA da campioni clinici utilizzando la tecnologia TruTip su Robot Gestione liquidi comuni

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Umana Cartilagine Tessuto Fabrication Uso tridimensionale Tecnologia Inkjet Printing

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Completamente dispositivo automatizzato centrifuga Microfluidic per il rilevamento di proteine ​​Ultrasensitive da sangue intero

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Produzione di sostanze chimiche da parte di<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Uso di idrolizzato di bambù come alimentazione

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Ottimizzazione dei processi mediante microreattori automatizzati ad alta velocità effettiva nella coltivazione delle cellule ovaio dell'ammasso cinese

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...