Name: generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

Den vitenskapelige aktiviteten til Bioeconomy Science Center ble økonomisk støttet av departementet for innovasjon, vitenskap og forskning innenfor rammen av NRW-Strategieprojekt BioSC (nr 313/323-400-002 13). Forfatterne takker departementet for innovasjon, vitenskap, og forskning av Nordrhein-Westfalen og Heinrich Heine University Düsseldorf for et stipend til Lars Freier i CLIB-Graduate klynge industrielle bioteknologi. Videre midler mottatt fra programmet for aktivering mellomrom "Helmholtz innovasjon Labs" av tyske Helmholtz forening til støtte til "mikrobiell Bioprocess Lab – A Helmholtz innovasjon Lab".

Forfatterne ikke avsløre.

Den generiske typen presentert protokollen lar ulike tilpasninger, f.eksfor å studere andre mikrobiell uttrykk verter9,47,48,49,50, 51, eller optimalisere andre egenskaper av målet protein, som glykosylering mønster eller disulphide obligasjoner. Protokollen må også tilpasses den tilgjengelige laboratorieutstyr. Integreringen av en MBR-system kan øke eksperimentelle gjennomstrømning, som gjør store besparelser i tid. Men når du erstatter fullstendig instrumenterte og kontrollerbar bioreaktorer MBR systemer, må skalerbarhet resultater vurderes8,37,52,53. Bruk av DOE metoder og matematisk modellering bidrar til å maksimere innhold av måledata når det gjelder de studerte objektive54 ved effektiv eksperimentelle planlegging og modell-basert data tolkning15.
Endringer til metoden Ved siden av multi-purpose og utvides robot flytende håndteringssystemer som brukes i denne studien, bør det nevnes at det er flere mindre væske håndteringssystemer kommersielt tilgjengelig som er i stand til å utføre denne oppgaven, og kan plasseres innenfor laminær strømning arbeid benker. Hvis ingen automatiserte pipettering systemer er tilgjengelig, kan ulike medier komposisjoner i henhold til DOE planen også realiseres ved manuell pipettering bruker enkelt og/eller flerkanals pipetter. Siden manuell forberedelsene er mer utsatt for feil og krever svært fokusert arbeid for ganske lang tid, anbefales det å forberede et lavere antall forskjellige medier komposisjoner.
Avhengig av funksjonene av næringsdrivende MBR, vil tilsvarende dyrking protokollen variere. For eksempel hvis ingen online måling av biomasse formasjon er tilgjengelig, kan det være tilstrekkelig å måle biomasse konsentrasjon etter ferdigstillelse av vekst eksperimentet. I kombinasjon med avlytting av pH og oppløst oksygen, som er implementert i flere MBR systemer, vekst metning kan bestemmes trygt. I prinsippet kan vekst eksperimenter utføres i MTPs alene plassert inne risting inkubatorer, uten bruk av en MBR-system. I dette tilfellet riktig dyrking forholdene må sikres: (1) oksygen-begrenset i nærområdet kan unngås ved å bruke MTPs med passende geometrier, sammen med riktig risting frekvenser og risting diameter, f.eks, square 96 eller 24 dyp bra plater drives på 1000 rpm på 3 mm kaste eller 250 rpm på 25 mm kaste, henholdsvis. Viktigere, jo lavere overføringshastigheter oppnåelig maksimalt oksygen, jo lavere viktigste karbon kilde bør være konsentrert. Som nevnt ovenfor, til denne studien var 10 g/L glukose egnet til å hindre oksygen-begrensning for næringsdrivende dyrking betingelsene; (2) prøvetaking av MTP kulturer for biomasse og produkt kvantifisering skal reduseres til et minimum. Hver gang MTP fjernes fra risting inkubator, oksygen overføring vil umiddelbart break-ned som kan resultere i ugunstig dyrking forhold; (3) i oppfatning av forfatterne anbefales ikke bruk av MTP lesere som dyrking enheter som disse enhetene ikke er utviklet for dette formålet. For eksempel risting mekanikk ble bygget for sporadiske blanding av microplates etter at reagens og dermed mangler ofte robusthet for lange serier av kontinuerlig risting levetid i dager. Videre kan ikke tilstrekkelig inngang kreves for mikrobiell nærområdet realiseres i disse leserne. Integrering av optisk tetthet i korte tidsintervaller krever stoppe av risting bevegelse, som fører til gjentatte perioder med oksygen-begrensning. Fordampning i slike systemer over lang dyrking perioder vil dessuten forvrenge resultater. Mer om overraskende komplisert tema på ved hjelp av MTPs for mikrobiell nærområdet, kalles leseren sitert litteratur22,23,24,25,26 og referanser der.
Ytterligere vurderinger Å fremskynde iterativ optimering skritt anbefales det å nøye Velg analytisk for produktet kvantifisering. Raske og enkle metoder bør være foretrukket på bekostning av presisjon og nøyaktighet, som iterativ eksperimentell design strategien tåler eksperimentelle unøyaktighet. Men må de endelige resultatene bekreftes mot tilstrekkelig presise og nøyaktige produktet kvantifisering metoder som kan være mer komplisert. Generelt, nøye vurdering og beslutningsprosesser om studien prosedyrene krever innsats i begynnelsen av studien, men betaler ut i det lange løp, etter at rutinemessig metoder har blitt etablert.
Det anbefales å definere en referanse eksperiment som er i forhold til alle eksperimentene under optimalisering. Dvs er anvendt middels komponent konsentrasjoner samt målt resultatet normalisert via dele referanseverdier. På denne måten hver brukes og målt verdi kan tolkes som x-fold av referanseverdi. Ta i kontoen variasjoner mellom platene, utføres fem referanse eksperimenter på hver plate. Middelverdien av målt resultatet brukes for normalisering.
Det kan vanligvis ikke garanteres at utviklet mediet er også egnet for andre stammer. Men vil forbedret mediet sannsynligvis også være egnet for dyrking uttrykket stammer med små genetiske forskjeller, f.eksnår produsere enzym varianter med enkelt aminosyre erstatninger Hentet fra mutagenese studier ( men selv enkelt punkt mutasjoner har blitt beskrevet effekt cellenes stoffskifte og heterologous uttrykk ytelse55,56). I dette tilfellet, kan presenterte protokollen være et første skritt, etterfulgt av protokoller for høy gjennomstrømming uttrykk screenings57. Hvis protokollen brukes for middels utvikling med påfølgende skalere opp til matet-batch i nærområdet, må optimalisert mediet bekreftes tilsvarende bioprocess forholdene, som klone screening kampanjer på Mikroskala identifisert ulike topp utøvere for ulike fôring strategier og dyrking media52,58. Videre kan de introduserte KriKit36 generelt bidra til bedre helhetlig bioprocess optimalisering.Bare nylig ble verktøyet evnene utvidet til også støtte flere objektive optimalisering40, som kan være viktig for å optimalisere både oppstrøms og nedstrøms prosesser59,60.

Moderne rekombinant genteknologi kan den vide bruken av tekniske enzymer for ulike applikasjoner i farmasøytisk industri, dyrefôr, organisk kjemi, og matfag1,2,3. Produksjon av tekniske enzymer i bulkmengder er et viktig tema for industriell bioteknologi og optimalisert rekombinante proteiner produksjon, og begge belastning og bioprocess engineering er nødvendig. Generasjonen av effektivt utviklet produksjon stammer, forskjellige genetisk biblioteker er tilgjengelig, f.eksbalansert gene expression4 eller økt sekresjon effektivitet5.
Corynebacterium glutamicum er en stor produsent av aminosyrer i industriell skala6,7 og representerer en attraktiv ikke-konvensjonelle uttrykket vert for sekretoriske produksjon av rekombinante proteiner8 ,9. Både generelle sekretoriske (Sec) og twin-arginine translokasjon (Tat) veien finnes i C. glutamicum og ble tatt i bruk for rekombinant protein sekresjon10. Erfaring i bioprocess engineering om aminosyre produksjon på industriell skala, samt muligheten til å skille ut proteiner til finans beløp11 og stor robusthet om bioprocess inhomogeneities funnet i stor skala i nærområdet12,13, gjør C. glutamicum en lovende plattform organisme for sekretoriske produksjon av heterologous proteiner i industriell skala.
Ernæring middels optimalisering er kjent for å forbedre rekombinante proteiner produksjon med mikrobiell systemer14,15,16,17 og følgelig justering av medium komposisjon er en givende skritt i bioprocess utvikling med hensyn til optimal produktivitet18,19,20,21. Intens forskning på anvendelse av microtiter plater (MTPs) for mikrobiell dyrking22,23,24 banet vei for utvikling og design av MTPs for mikrobiell dyrking25 ,26 og utvikling av MTP-basert microbioreactor (MBR) systemer med avlytting og miljømessige kontrollere27,28. MBRs aktiverer en betydelig økning i eksperimentell dyrking gjennomstrømming. Dessuten er MBR systemer stammer fra andre typer bioreaktorer, f.eks, boble kolonner eller rørt tank reaktorer, tilgjengelig for mikrobiell bioprocess optimalisering29,30,31, 32.
Generelt, nytte optimalisering studier økt eksperimentelle gjennomstrømning, som blir enda kraftigere i kombinasjon med DOE metoder, som vurdere interaksjoner mellom design variabler eller redusere høy-dimensjonale søk på spaces. Følgelig kombinert bruk av MBR systemer, lab automatisering og DOE har vist seg for å være en kraftig metode i bioteknologi,8,,16,,33,,34,,35.
En protokoll for medier optimalisering presenteres kombinere state-of-the-art lab automatisering, MBR teknologi med elektronisk prosess overvåking og Kriging-basert data analyse/eksperimentell design. Kriging-metode er implementert i en MATLAB verktøykasse ("KriKit") som kan lastes ned og brukes uten kostnad36. Som eksempel vises maksimering av sekretoriske grønne ﬂuorescent protein (GFP) med C. glutamicum ved å optimalisere sammensetningen av CgXII minimal medium. GFP titer ble valgt som optimalisering målet som det kan kvantifiseres lett og det er mye brukt som modell protein for studier på MBR systemer37,38,39.
Presentert rammene er delt i fire trinn, som er illustrert i figur 1. Trinnene er merket av for rammer og svarer til deler av protokollen. Det første trinnet (figur 1A) er å definere prosjektmålene og å finne de nødvendige metodene. Kombinasjonen av DOE metoder, MBR teknologi og lab automatisering lar en økt eksperimentelle overføringshastighet som krever kraftig databehandling. Det andre trinnet (figur 1B) mål å oppdage følsom design variabler (dvs., mellomstore komponenter) med høy innflytelse på optimalisering målet. Dette fører til et redusert antall design variabler av interesse. Det tredje trinnet (figur 1 c) består av en iterativ optimalisering for en mer detaljert undersøkelse av funksjonelle forholdet mellom gjenstående design variablene og målet med interesse. Bruker suksessivt utvidet datasettet, brukes Kriging tilnærming til å forutsi eksperimentelle utfallet unmeasured steder. Iterativ syklusen stopper så snart Kriging modellen spår en optimal eller platå med tilstrekkelig nøyaktighet. Resultatene er bekreftet i fjerde trinn (figur 1 d), begynner med en ytterligere sensitivitetsanalyse rundt identifiserte optimal. Hvis først ufølsom komponenter er funnet for å være ufølsom også i regionen optimal, er det rimelig å anta at dette gjelder under iterativ optimalisering prosedyren i det tredje trinnet. Etterpå er det anbefales å bekrefte optimalisering resultater ved ortogonale metoder, for eksempel en aktivitet analysen eller SDS-side.
Den generiske typen presentert protokollen tillater enkel tilpasning til ulike laboratorieutstyr, andre uttrykk verter og målet proteiner av valg, i tillegg til ytterligere bioprocess variabler som pH verdien eller dyrking temperatur.Videre kan andre optimalisering mål som protein produksjon rate, bestemt avkastning eller produktkvalitet være valgt for å passe omfanget av andre optimalisering studier.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
Figur 1 : Arbeidsflyt optimalisering studium. Fire ramme boksene svarer til deler av protokollen, "Bli gravid the studie og definisjon av metoder" (del 1), "Sensitivitetsanalyse" (del 2), "Iterativ optimalisering" (del 3) og "Validering" (del 4). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioLector</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>G-BL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowerplate</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>MTP-48-BOH</td>
			<td>For cultivation in the BioLector device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing foil</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>F-GP-10</td>
			<td>Sterile sealing for Flowerplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>2016b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KriKit</td>
			<td>Forschungszentrum J&#252;lich</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Freely available, MATLAB installation required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus pipetting robot</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Includes &#34;WinPrep&#34; software installation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-column deep well microplate</td>
			<td>E&#38;K Scientific</td>
			<td>EK-2034</td>
			<td>Container for medium stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplates, transparent, F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td>For Bradford protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;clear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655087</td>
			<td>For flourescence measurement in cell-free supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Research&#160;plus multi-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Facilitates manual liquid handling with microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruPAG&#160;Precast Gels</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCG2002</td>
			<td>For SDS-Page analysis of cell-free supernantants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&#8211;42 (2007)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology

En kjernevirksomhet i industrielle bioteknologi bruker mikrobiell produksjon celle fabrikker er gjentakelsene av prosessen av belastning engineering og optimalisering av bioprocess. Et viktig aspekt er forbedring av dyrking medium for å gi et optimalt miljø for mikrobiell dannelsen av produktet av interesse. Det er godt akseptert at media sammensetningen kan dramatisk påvirke ytelsen til bioprocess. Ernæring middels optimalisering er kjent for å forbedre rekombinante proteiner med mikrobiell systemer og dermed, dette er en givende trinn i bioprocess utvikling. Imidlertid er ofte målestokk media oppskrifter Hentet fra litteratur, siden skreddersydd design av dyrking medium er en langtekkelig oppgave som krever microbioreactor-teknologi for tilstrekkelig dyrking gjennomstrømning, rask produktet analytics, samt støtte håndtering trinnene av lab robotikk aktivere pålitelighet i væske. Videre er avanserte matematiske metoder nødvendig for rasjonelt analyse av måledata og effektivt designe parallelle eksperimenter som for å oppnå optimal informasjon innhold.
Den generiske typen presentert protokollen tillater enkel tilpasning til ulike laboratorieutstyr, andre uttrykk verter og målet proteiner av interesse, samt ytterligere bioprocess parametere. Videre kan andre optimalisering mål som protein produksjon rate, bestemt avkastning eller produktkvalitet være valgt for å passe omfanget av andre optimalisering studier. Anvendt Kriging verktøykassen (KriKit) er et generelt verktøy for Design av eksperimenter (DOE) som bidrar til bedre helhetlig bioprocess optimalisering. Den støtter også flere objektive optimalisering som kan være viktig å optimalisere både oppstrøms og nedstrøms prosesser.

Introdusert protokollen ble brukt for å maksimere titer av utskilles GFP. Spesielt GFP titer etter 17 h dyrking ble valgt som optimalisering mål. Online fluorescens oppdagelsen av GFP lov enkelt produkt kvantifisering. Men er normalisering av GFP signal med data fra en referanse dyrking uunnværlige for å garantere reproduserbarhet og sammenlignbare resultater. En pre-utvalget av media komponentene ble utført på en rasjonell basis som beskrevet i del 1. Eksperimenter ble utført følge instruksjonene av del 1: parameterne for våt laboratorium prosedyrer ble definert for hele studiet sikrer konsistens og reproduserbarhet resultater.
Som beskrevet i del 2, ble en første screening utført for å identifisere relevante komponenter viser en betydelig innvirkning på optimalisering målet for videre, mer detaljerte studier. MTP-basert MBR systemet tillater 48 eksperimenter utføres parallelt. Tatt i betraktning maksimalt antall parallelle eksperimenter på en MTP (48) og antall medier komponenter (11) gjør den 2IVutforme11-6 Brøkdelen et passende valg. Denne eksperimentell design består av 32 eksperimenter og lar estimering av det hovedavdeling bevirke for hver av de undersøkte mediekomponenter. Gjenværende dyrking brønnene (16) ble brukt for flere gjentak eksperimenter med referanse medium for å vurdere reproduserbarhet og posisjonelle effekter. Dvs hvert eksperiment er utført én gang (ingen gjentak), unntatt for referanse eksperimentet (fem gjentak).
Tabell 1 oppsummerer resultatet av screening analysen. I området vurdert konsentrasjon viser varierende flertallet av media komponentene ikke en merkbar effekt på målet. Komponenten NH4+ viser en sterk negativ effekt, mens Ca2 + og Mg2 + Vis sterkeste positiv tendensen. Effekten av Mg2 + er ikke betydning for dagens konsentrasjon utvalg, men kan være for bredere konsentrasjon. Det ble derfor besluttet å utelate NH4+ fra mediet og undersøke effekten av Ca2 + og Mg2 + i videre studier.
Del 3 beskriver iterativ optimalisering fremgangsmåten som brukes for å maksimere GFP fluorescens signalet mens varierende konsentrasjonen av Ca2 + og Mg2 +. I gjentakelse 1 ble hypotesen at NH4+ kan utelates testet. Konsentrasjon området for Ca2 + og Mg2 + ble innført fra screening analyse. Den laveste konsentrasjonen av NH4+ ble satt til null og maksimal konsentrasjon ble vedtatt fra screening eksperimentet. I de følgende eksperimentene, ble komponent-konsentrasjoner distribuert over 3 x 3 x 3 rutenett i det definerte konsentrasjon utvalget, resulterer i 27 eksperimenter. Under alle i nærområdet, fem gjentak av referanse medium var inkludert, som tjente som interne standard og å sikre at ingen posisjonelle effekt over MTP oppstod. De resterende 16 brønner, ble konsentrasjonen av NH4+Ca2 +og Mg2 + tilfeldig delt innenfor de angitte områdene.
Figur 5 A visualiserer resultatene av de første gjentakelsene. Akseetiketter se komponenten konsentrasjonen brukes i den opprinnelige referanse mediet, indikert ved x Ref. Blå overflater representerer Kriging innskuddene som ble beregnet ved hjelp av KriKit programvare. Hver overflaten er forbundet med en relativ konsentrasjon for NH4+ (mørk blå: 0 x Ref, rutete: 1 x Ref, lys blå: 2 x Ref). Denne visuelle representasjonen avslører at det er gunstig å utelate NH4+. Interpolering flater viser de positive effektene av både Mg2 + og Ca2 +, som alle flyene stige med økende konsentrasjoner.
Basert på resultatene av gjentakelse 1, ble det besluttet å utvide konsentrasjon område av Ca2 + og Mg2 + ved å doble maksimumskonsentrasjoner og skiftende vinduet eksperimentell design til øverst til høyre, se figur 5 B. innenfor dette intervallet konsentrasjonen ble distribuert på en 6 x 6 rutenettet. Dette sikrer en jevn distribusjon over full konsentrasjon området, fører til optimal Kriging interpolering resultater. Figur 5 B viser Kriging interpolering tomten basert på samlede data målt i begge gjentakelser (røde prikker og gule ruter). For begge, Ca2 + og Mg2 +, fortsetter den positive effekten av økende konsentrasjonene. Følgelig prosedyren ble gjentatt ved å doble maksimal konsentrasjon og dermed vinduet eksperimentell design var flyttet å utforske grensene for øverst til høyre.
Figur 6 A gir en oversikt over gjenstående optimalisering prosedyren. Analyse av innsamlede datasettet til gjentakelse 3 avslørte en begrensning av den positive effekten av Mg2 +, i.e., en optimal konsentrasjon utvalg av Mg2 + ble identifisert. Det ble derfor besluttet å utvide ytterligere konsentrasjon området bare for Ca2 + (gjentakelse 4). Denne fremgangsmåten ble gjentatt to ganger (gjentakelse 5 og 6) til en metning av GFP ble funnet. Denne metning er forklart av nedbør av Ca-salter for anvendt konsentrasjonen av Ca2 +, som ikke er tilgjengelig for cellene.
Som eksperimentelle resultater er alltid opprørt av støy, den resulterende Kriging interpolering vises uregelmessig og visuell inspeksjon kan føre til falsk konklusjoner. Men kan hvilket optimal konsentrasjon media komponentene for mettet GFP signalet pålitelig identifiseres med statistiske z -test, som også er implementert i KriKit. Z -testen bruker direkte iboende statistisk informasjon gitt av Kriging metoden, dvs, prediksjon verdier og prediksjon usikkerhet. Figur 6 B viser identifiserte platået, som bestemt og visualisert ved hjelp KriKit verktøykassen.KriKit verktøykassen er fritt tilgjengelig36 og kommer med en detaljert tutorial som forklarer hvordan du bruker funksjonene.
Hvis det finnes mer enn to aktuelle komponenter, når 3D-visualisering grensen. KriKit gir flere andre mulige visuell representasjon metoder som filmer eller "screening tomten". Hvis potensialet optimal ligger innenfor området definert konsentrasjon, er nye eksperimenter automatisk utformet med forventet forbedring40,46. Eksperimentell design basert på forventet forbedring er integrert i KriKit verktøykassen. Mer informasjon finnes i dokumentasjonen.
Etter iterativ prosedyren, var en verifikasjon av resultatene gjennomført, som beskrevet i del D. Gyldigheten av første forutsetninger ble sjekket ved å utføre en ekstra sensitivitetsanalyse bruker den optimale medium komposisjonen. Dvs alle første mediekomponenter rundt var varierte, men Ca2 + og Mg2 + ble satt til deres optimal konsentrasjon nivåer. I denne studien de optimale konsentrasjonene <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 x Ref og <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6,8 x Ref ble valgt. Tabell 2 viser resultatene av validering screening. Ligner på første følsomheten screening (jf. tabell 1), NH4+ har fortsatt en betydelig negativ påvirkning og gjenværende effekter er fortsatt ubetydelig.
På grunn av lett tilgang, ble GFP fluorescens signalet fra dyrking suspensjon brukt til å kvantifisere den ekstracellulære GFP titer under alle eksperimenter. Verifikasjon årsaker ble GFP fluorescens validert mot andre målinger. Fordi GFP er secreted via Tat-veien, kan ikke fluorescens signalet forskjellsbehandle intra- og ekstracellulære GFP. Dermed ble nærområdet reprodusert med referanse mediet og optimalisert medium. Foruten fluorescens måling fra celle-fri dyrking supernatants, proteininnhold ble kvantifisert Bradford analysen og (semi)-kvalitative GFP forbedring visualisert ved SDS-side15. Alle resulterende måling signaler var omtrent fordoblet for lokalt med optimalisert medium i forhold til referanse medium og godkjent den ca 100% forbedring av utskillelsen av optimalisert medium. Følgelig betraktes GFP bestemt fluorescens for dyrking suspensjon som en egnet beregning for optimalisering målsettingen, dvsden ekstracellulære GFP titer.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
Figur 2 : Skjermene fra volumlisten pipettering for sensitivitetsanalyse. Oppføringer i den første kolonnen tilordner en unik ID til alle volumer på rad; Denne identifikatoren er MTP nummer av målet dyrking MTP på flytende handler skrivebordet, jf Figur 4C. Resten av kolonnene kode volumer for ulike løsninger ("Sln-01" til "Sln-15") for å være pipetted. Det kumulative volumet i én rad tilsvarer siste dyrking volumet tilsvarende godt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
Figur 3 : Skjermene fra væsken kontroll programvare "WinPREP". Venstre: Rad-bestilt kommandoer, inkludert en overføring kommando for hver aksje løsning å være pipetted. Før siste kommandoen for inoculum tillegg settes en bruker spørsmål for å sikre frø kulturen er plassert på bordet akkurat i tide. Høyre: Skjematisk av skrivebordet, inkludert kilde labware for variasjon aksjer (to dypt bra plater med 12 kolonnen som brønner), reagens bunnen for resten lager, vann og inoculum og media forberedelse målet dyrking MTP. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
Figur 4 : Samling av detaljert skjermbilder for oppsett av pipettering av en lagerløsning. (A) pakket kommandoen for pipettering av Fe lager. Kilde labware og kilde godt merket innenfor på skrivebordet, Les ramme og røde kolonne av tilsvarende dypt godt plate. Destinasjon labware og destinasjon brønner i merkes av blå ramme rundt og blå wells fra målet dyrking MTP. (B) detaljert eksempel syn på tildeling av pipettering volumer for dette trinnet (Fe lager løsning). Antall destinasjoner er lest fra pipettering listen, som har 48 rader. Dispense volumene alle mål brønner for Fe lagerløsning finnes i kolonne 4 i listen pipettering. Merk at den første kolonnen i listen pipettering inneholder identifikatorer og ikke volumer som skal overføres, se figur 2. (C) detaljer om destinasjon godt nummerering. Volumer som er skrevet i raden #1 tilsvarende pipettering listen vil bli pipetted i godt merket som #1 og så videre. Wells #01, #08, #41 og #48 tilsvarer brønner A01, A08, F01 og F08 alfanumerisk kodingen, som også er skrevet i dyrking MTP selv. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
Figur 5 : Detaljert resultater fra den første gjentakelsen. (A) Kriging interpolering basert på eksperimentelle data av gjentakelse 1. Røde prikkene angir datasettet. For sammenligning, alle tre interpolering flater er overlagd i en handling (mørk blå: 0 x Ref, rutete: 1 x Ref, lys blå: 2 x Ref). En alternativ representasjon av resultatene kan finnes andre steder15. (B) Kriging interpolering basert på eksperimenter utført i gjentakelse 1 (røde prikker) og gjentakelse 2 (gul ruter).Deler av dataene som vises i denne illustrasjonen har vært publisert tidligere15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
Figur 6 : Skildring av iterativt samlet optimalisering resultater. (A) Final Kriging modell prediksjon. (B) Statistisk identifikasjon av optimale området (rød) basert på statistiske z-test, som leveres av KriKit. Bokser angir etterfølgende trinnene iterativ design og gjennomføring av eksperimenter. Deler av dataene som vises i denne illustrasjonen har vært publisert tidligere15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Normalisert koeffisienten middelverdien</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>-0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0,03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>0,06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 1: resultatene av sensitivitetsanalyse. Koeffisient verdier som representerer den gjennomsnittlige effekten når øker respekt media komponent konsentrasjonen fra center verdien til maksimumsverdien. For optimal eksperimentell design, som finnes i standard litteratur og brukt her, standardavvik representerer direkte eksperimentell variasjonen skyldes replikering av referanse eksperimentet. Koeffisient verdier var normalisert av maksimums-verdien (0.0422 for komponent Ca2 +). Normalisert og absolutt koeffisient standardavviket er 0.54 og 0.0226, henholdsvis.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Normalisert koeffisienten middelverdien</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>0.69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 2: resultatene av den endelige sensitivitetsanalyse. Koeffisient verdier som representerer den gjennomsnittlige effekten når øker respekt media komponent konsentrasjonen fra center verdien til maksimumsverdien. Som en optimal eksperimentell design ble brukt, avhenger standardavviket bare eksperimentelle variasjon med optimalisert middels sammensetningen. Eksperimentell variasjoner økt litt i forhold til variasjon med referanse medium. Koeffisient verdier var normalisert av maksimums-verdien (0.0106 for komponent Mn2 +). Normalisert og absolutt koeffisient standardavviket er 3.63 og 0.0385, henholdsvis.

Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generisk protokoll for optimalisering av Heterologous Protein produksjonen ved hjelp av automatisert Microbioreactor teknologi

Dette manuskriptet beskriver en generisk tilnærming for skreddersydd design av mikrobielle dyrking media. Dette er aktivert av en iterativ arbeidsflyt kombinerer Kriging-baserte eksperimentell design og microbioreactor teknologi for tilstrekkelig dyrking gjennomstrømning, som støttes av lab robotikk å øke pålitelighet og hastighet i væske håndtering media forberedelse.

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: en Automated Plattform for Biomasse enzym Discovery og Cocktail Optimization

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

Høy gjennomstrømning, Automated Utvinning av DNA og RNA fra kliniske prøver ved hjelp TruTip Technology på Common Væskehåndtering Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelig bruskvev Fabrication Bruke Tredimensjonal Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Bruke Tomoauto: En protokoll for høy gjennomstrømming Automated Cryo-elektron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Helautomatisk Sentrifugal mikrofluid Enhet for Ultra Protein Detection fra Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Produksjon av kjemikalier av<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Bruke bambushydrolysat som råstoff

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Bruk av høy gjennomstrømming automatisert Microbioreactor System for produksjon av modellen IgG1 i CHO celler

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rensing og analyse av en monoklonale antistoff fra kinesisk hamster eggstokk celler ved hjelp av en automatisert Microbioreactor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Prosessoptimalisering ved hjelp av høy gjennomstrømning automatiserte mikrobioreaktorer i kinesisk hamster eggstokk celle dyrking

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...