Name: generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

As atividades científicas do centro de ciência de bioeconomia foram apoiadas financeiramente pelo Ministério da inovação, ciência e pesquisa no âmbito da BioSC NRW-Strategieprojekt (n º 313/323-400-002-13). Os autores agradecer o Ministério da inovação, ciência e pesquisa do Norte-Vestfália e a Heinrich Heine University Düsseldorf para uma bolsa de estudos para Lars Freier dentro Cluster CLIB-pós-graduação Biotecnologia Industrial. Mais financiamento foi recebido do programa espaços habilitando "Laboratórios de inovação de Helmholtz" da associação alemã de Helmholtz para apoiar o "microbiana Bioprocessos laboratório – A Helmholtz laboratório de inovação".

Os autores não têm nada para divulgar.

A natureza genérica do protocolo apresentado permite várias adaptações, por exemplo, para estudar a expressão microbiana anfitriões9,47,,48,49,50, 51, ou para otimizar a outras propriedades da proteína alvo, como títulos do padrão ou dissulfureto de glicosilação. O protocolo também pode precisar de ser adaptado para o equipamento de laboratório disponíveis. A integração de um sistema MBR permite aumentando o throughput experimental, que permite grande economia no tempo. No entanto, quando substituindo biorreatores totalmente instrumentados e controláveis pelos sistemas MBR, escalabilidade dos resultados deve ser considerada8,37,52,53. O uso de metodologias DOE e modelagem matemática ajuda a maximizar o conteúdo de informação de dados de medição em relação a objetiva estudados54 por eficiente planejamento experimental e de interpretação de dados baseados em modelo15.
Modificações para o método Ao lado de múltiplos propósito e expansível robótico líquido manipulação de sistemas como o usado neste estudo, deve-se mencionar que existem vários líquido menor manipulação sistemas comercialmente disponíveis, que são capazes de executar esta tarefa e podem ser colocados dentro bancada de trabalho de fluxo laminar. Se nenhum sistema automatizado de pipetagem é disponível, composições de meios diferentes de acordo com o plano DOE também podem ser realizadas por pipetagem manual usando pipetas única e/ou multi-canal. Desde a preparação manual é mais propenso a erros e exigirá trabalho altamente concentrado por muito tempo, é aconselhável preparar um número menor de composições diferentes mídias.
Dependendo dos recursos do sistema MBR independente, o protocolo de cultivo correspondente irá variar. Por exemplo, se nenhuma medição on-line de formação de biomassa está disponível, pode ser suficiente medir a concentração de biomassa após a conclusão do experimento crescimento. Em combinação com monitoramento on-line do pH e oxigênio dissolvido, que é implementado em vários sistemas MBR, a saturação de crescimento pode ser determinada com segurança. Em princípio, as experiências de crescimento podem ser conduzidas no MTPs sozinho colocados dentro de incubadoras, sem o uso de um sistema MBR a tremer. Neste caso, as condições de cultivo adequado tem que ser assegurada: cultivos de oxigênio-limitada (1) podem ser evitado pelo uso do MSDN com geometrias adequadas, em combinação com adequada frequências a tremer e tremer diâmetros, por exemplo, quadrado 96 ou 24 profunda placas bem operado a 1.000 rpm em jogar apenas 3 mm ou a 250 rpm em passos de 25 mm, respectivamente. Importante, quanto mais baixo as taxas de transferência de oxigênio máxima atingível, menor a fonte principal de carbono deve ser concentrada. Como mencionado acima, para este estudo, o uso de glicose 10 g/L foi adequado para evitar a limitação de oxigênio para as condições de cultivo empregados; (2) a amostragem das culturas MTP para quantificação de biomassa e o produto deve ser reduzida ao mínimo. Cada vez que o MTP é retirado da incubadora tremendo, transferência de oxigênio será imediatamente avaria que pode resultar em condições desfavoráveis de cultivo; (3) na opinião dos autores, o uso de leitores MTP como dispositivos de cultivo não é recomendado como esses dispositivos não foram desenvolvidos para esta finalidade. Por exemplo, agitação mecânica foram construídas para a mistura ocasionais de microplacas após a adição do reagente e, muitas vezes falta-lhes robustez para corridas longas de duração agitação contínua por dias. Além disso, entrada de alimentação suficiente necessária para cultivos microbianos não pode ser realizada nesses leitores. A integração das leituras de densidade óptica em breve intervalos de tempo requer parada do movimento de agitação, resultando em períodos repetidos de limitação de oxigênio. Além disso, a evaporação em tais sistemas, durante períodos de longo período de cultivo vai distorcer os resultados. Para obter mais detalhes sobre o tema surpreendentemente complexo sobre o uso do MSDN para cultivos microbianos, o leitor é referido a literatura citada22,23,24,25,26 e referências ali.
Considerações adicionais A passos de otimização iterativo de acelerar, é aconselhável selecionar cuidadosamente o método analítico para quantificação do produto. Rápido e simples métodos devem ser preferidos ao custo de precisão e exatidão, como a estratégia de projeto experimental iterativo tolera imprecisão experimental. No entanto, os resultados finais devem ser cotejados com métodos de quantificação do produto suficientemente precisa e exata que pode ser mais complicado. Em geral, cuidadosa avaliação e tomada de decisão sobre os procedimentos de estudo requerem esforço no início do estudo, mas pagam a longo prazo, depois que se estabeleceram métodos de rotina.
É altamente recomendável para definir um experimento de referência é comparado a todas as experiências durante a otimização. Ou seja, as concentrações de componente média aplicada, bem como saída medida é normalizada através de dividindo por valores de referência. Desta forma, cada um aplicado e o valor medido pode ser interpretado como a x-dobra o valor de referência. Para tomar em conta as variações entre as placas, cinco experimentos de referência são executados em cada prato. O valor médio dos resultados medidos é usado para a normalização.
Ele pode geralmente não ser garantido que o médio desenvolvido também é ideal para outras tensões. No entanto, o melhor médio provavelmente também será apropriado para cultivar variedades de expressão com pequenas diferenças genéticas, por exemplo, quando produzir variantes da enzima com substituições de aminoácidos única obtida (estudos de mutagênese Embora ainda única ponto foram descritas mutações para o metabolismo celular de efeito e expressão heteróloga desempenho55,56). Neste caso, o protocolo apresentado pode ser um primeiro passo, seguido por protocolos de expressão do elevado-throughput seleções57. Se o protocolo é usado para o desenvolvimento médio com escala-up subsequente para cultivos alimentados em lotes, o médio otimizado deve ser verificado para as respectivas condições de Bioprocessos, clone rastreio campanhas na microescala identificados diferente top artistas de diferentes estratégias de alimentação e de52,de meios de cultivo58. Além disso, o Danilo introduzido36 geralmente pode contribuir para otimização de Bioprocessos holística melhorada.Apenas recentemente, as capacidades da ferramenta foram estendidas para também oferecer suporte a multi-objetivo de otimização40, que pode ser importante para otimizar os dois processos de upstream e downstream59,60.

Tecnologia moderna genética recombinante permite a ampla utilização de enzimas técnicas para diversas aplicações na indústria farmacêutica, animal, alimentação, química orgânica e1,2,3de processamento de alimentos. A produção de enzimas técnicas em grandes quantidades é um tópico importante para a biotecnologia industrial e para a produção de proteínas recombinantes otimizado e ambos Coe e engenharia de Bioprocessos é necessária. Para a geração de cepas de produção eficientemente projetado, bibliotecas genéticas diferentes estão disponíveis, por exemplo, para a expressão de gene equilibrada4 ou aumento da secreção de eficiência5.
Corynebacterium glutamicum é um importante produtor de aminoácidos em escala industrial6,7 e representa um host atraente expressão não-convencionais para a produção de secreção de proteínas recombinantes8 ,9. O general secretora (Sec) e via de translocação gêmeo-arginina (Tat) estão presentes em c. glutamicum e foram aplicadas com êxito para a secreção de proteína recombinante10. Vasta experiência em engenharia de Bioprocessos em matéria de produção de aminoácidos em escala industrial, bem como a capacidade de secretar proteínas g/L de montantes11 e grande robustez relativa heterogeneidades de Bioprocessos, encontradas em larga escala cultivos12,13, faça glutamicum c. um organismo plataforma promissora para a produção de secreção de proteínas heterólogos em escala industrial.
Otimização de média nutrição é conhecida para melhorar a produção de proteína recombinante com sistemas microbianos14,15,16,17 e consequentemente, o ajustamento de médio composição é um passo gratificante em Bioprocessos desenvolvimento no que diz respeito a produtividade ideal18,19,20,21. Intensas pesquisas sobre a aplicação de placas de microtitulação (MTPs) para cultivo microbiano22,23,24 pavimentaram o caminho para o desenvolvimento e design de MTPs para cultivo microbiano25 ,26 e o desenvolvimento de sistemas baseados em MTP microbioreactor (MBR) com monitoramento on-line e ambiental controle27,28. MBR permite um aumento significativo na produtividade do cultivo experimental. Além disso, sistemas MBR decorrentes de outros tipos de biorreatores, por exemplo, colunas de bolhas ou mexido tanque reatores, estão disponíveis para Bioprocessos microbiana otimização29,30,31, 32.
Em geral, estudos de otimização beneficiam maior throughput experimental, que se torna ainda mais poderoso em combinação com metodologias DOE, como para avaliar as interações entre as variáveis de projeto ou reduzir os espaços de busca de alta dimensão. Consequentemente, o uso combinado de MBR sistemas, automação de laboratório e DOE provou para ser um método poderoso em biotecnologia8,16,33,34,35.
Apresenta-se um protocolo para otimização de mídia combinando a automação de laboratório de estado-da-arte, tecnologia MBR com acompanhamento de processo on-line e análise/experimental design Kriging-base de dados. A metodologia de Kriging é implementada em um Toolbox MATLAB ("KriKit"), que pode ser baixado e usado livre de carga36. Como exemplo de aplicação, maximização da produção de proteína (GFP) secretoras ﬂuorescent verde com c. glutamicum é mostrada através da otimização da composição do meio mínimo de CgXII. Título GFP foi escolhido como o objetivo de otimização, como isso pode ser quantificado facilmente e é aplicado extensamente como proteína de modelo para estudos sobre MBR sistemas37,38,39.
O quadro apresentado é dividido em quatro etapas, que são ilustradas na Figura 1. As etapas são indicadas por quadros de caixa e correspondem às seções do protocolo. A primeira etapa (figura 1A) é definir os objetivos do projeto e para determinar os métodos necessários. A combinação de metodologias DOE, MBR tecnologia e automação de laboratório permite uma maior throughput experimental que exige poderosa de processamento de dados. A segunda etapa (figura 1B) visa detectar variáveis de projeto sensível (isto é, componentes médios) com alta influência sobre o objetivo de otimização. Isto leva a um número reduzido de variáveis de projeto de interesse. A terceira etapa (Figura 1) é composto por uma otimização iterativa para uma investigação mais detalhada da relação funcional entre as restantes variáveis de projeto e o objetivo de interesse. Usando o conjunto de dados sucessivamente estendido, a abordagem de Kriging é aplicada para prever o resultado experimental em locais não mensuráveis. O ciclo iterativo é interrompida assim que o modelo de Kriging prevê um ideal ou um planalto com uma precisão suficiente. Os resultados são verificados na quarta etapa (Figura 1), começando com uma nova análise de sensibilidade em torno do optimum identificado. Se inicialmente, diferenciação de componentes são encontrados para ser insensível também na região ideal, é razoável supor que isto prende verdadeiro durante o procedimento iterativo de otimização na terceira etapa. Depois disso, é aconselhável verificar resultados de otimização da aplicação dos métodos ortogonais, como um ensaio de atividade ou SDS-Page.
A natureza genérica do protocolo apresentado permite fácil adaptação ao equipamento de laboratório diferentes, outros hosts de expressão e proteínas alvo de escolha, bem como mais Bioprocessos variáveis como a temperatura de pH valor ou cultivo.Além disso, outros objetivos de otimização como taxa de produção de proteína, rendimento específico ou qualidade do produto podem ser escolhidos para caber o escopo de outros estudos de otimização.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
Figura 1 : Fluxo de trabalho de estudo de otimização. As caixas de quatro quadros correspondem às seções do protocolo, "Conceber o estudo e definição de métodos" (secção 1), "Análise de sensibilidade" (secção 2), "Optimization iterativo" (secção 3) e "Validação" (secção 4). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioLector</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>G-BL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowerplate</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>MTP-48-BOH</td>
			<td>For cultivation in the BioLector device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing foil</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>F-GP-10</td>
			<td>Sterile sealing for Flowerplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>2016b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KriKit</td>
			<td>Forschungszentrum J&#252;lich</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Freely available, MATLAB installation required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus pipetting robot</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Includes &#34;WinPrep&#34; software installation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-column deep well microplate</td>
			<td>E&#38;K Scientific</td>
			<td>EK-2034</td>
			<td>Container for medium stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplates, transparent, F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td>For Bradford protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;clear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655087</td>
			<td>For flourescence measurement in cell-free supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Research&#160;plus multi-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Facilitates manual liquid handling with microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruPAG&#160;Precast Gels</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCG2002</td>
			<td>For SDS-Page analysis of cell-free supernantants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&#8211;42 (2007)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology

Um negócio em biotecnologia industrial usando fábricas de célula de produção microbiana é o processo iterativo de tensão de engenharia e otimização das condições de Bioprocessos. Um aspecto importante é a melhoria do meio de cultivo para fornecer um ambiente ideal para formação microbiana do produto de interesse. É bem aceite que a composição de mídia dramaticamente pode influenciar o desempenho geral de Bioprocessos. Otimização de média nutrição é conhecida por melhorar a proteína recombinante produção com sistemas microbianos e, portanto, este é um gratificante passo no desenvolvimento de Bioprocessos. No entanto, receitas de mídia padrão muitas vezes são tomadas a partir de literatura, desde o design à medida do meio de cultivo é uma tarefa tediosa que exige tecnologia microbioreactor para a taxa de transferência de cultivo suficientes, análise de produto rápido, bem como suporte por robótica de laboratório para permitir confiabilidade nas etapas de manuseio de líquidos. Além disso, métodos matemáticos avançados são necessários para racionalmente analisando dados de medição e projetar eficientemente experiências paralelas tais como conseguir conteúdo de informação ideal.
A natureza genérica do protocolo apresentado permite fácil adaptação ao equipamento de laboratório diferentes, outros hosts de expressão e proteínas alvo de interesse, bem como parâmetros de Bioprocessos ainda mais. Além disso, outros objetivos de otimização como taxa de produção de proteína, rendimento específico ou qualidade do produto podem ser escolhidos para caber o escopo de outros estudos de otimização. O Toolbox de Kriging aplicada (KriKit) é uma ferramenta geral para Design de experimentos (DOE) que contribui para a optimização de Bioprocessos holística melhorada. Ele também suporta otimização multi-objetiva que pode ser importante na otimização de processos de upstream e downstream.

O protocolo introduzido foi aplicado para maximização do título do GFP secretado. Especificamente, o título GFP após 17 h de cultivo foi escolhido como o objetivo de otimização. Deteção de fluorescência on-line de GFP permitiu a quantificação simples produto. No entanto, a normalização do sinal GFP com dados de um cultivo de referência é indispensável para garantir a reprodutibilidade e a comparabilidade dos resultados. Uma pré-seleção de componentes de mídia foi realizada em uma base racional conforme descrito na seção 1. Foram realizados experimentos, seguindo as instruções da secção 1: os parâmetros dos procedimentos de laboratório molhado foram definidos para o estudo inteiro garantindo consistência e reprodutibilidade dos resultados.
Conforme descrito na secção 2, realizou-se uma triagem inicial para identificar os componentes relevantes mostrando um impacto significativo sobre o objetivo de otimização para o estudo mais adicional, mais detalhado. O sistema MBR MTP-baseado permite 48 experimentos a ser executadas em paralelo. Tendo em conta o número máximo possível de experiências paralelas em um MTP (48) e o número total de mídia componentes (11) faz o 2IV11-6 fracionário desenha uma escolha apropriada. Este projeto experimental compreende 32 experimentos e permite a estimativa do efeito principal para cada um dos componentes de mídia investigadas. Os restantes poços de cultivo (16) foram usados para múltiplas repetições de experiências com o meio de referência para avaliar a reprodutibilidade e efeitos posicionais. Ou seja, cada experimento é executado uma vez (sem repetições), exceto o experimento de referência (cinco repetições).
A tabela 1 resume os resultados da análise de rastreio. Na faixa de concentração considerada, variando a maioria dos componentes de mídia não mostrou um efeito perceptível sobre o objetivo. Componente de NH4+ mostra um forte efeito negativo, enquanto Ca2 + e Mg2 + mostram a tendência positiva mais forte. O efeito de Mg2 + não é significativo para o intervalo de concentração atual, mas pode ser para uma gama mais ampla de concentração. Consequentemente, decidiu-se omitir o NH4+ do meio e investigar o efeito de Ca2 + e Mg2 + em novas experiências.
Seção 3 descreve o procedimento iterativo de otimização que é usado para maximizar o sinal de fluorescência do GFP enquanto variando as concentrações de Ca2 + e Mg2 +. Na iteração 1, foi testada a hipótese que NH4+ pode ser omitido. O intervalo de concentração de Ca2 + e Mg2 + foi adotado a partir da análise de rastreio. A concentração mínima de NH4+ foi definida como zero e a concentração máxima foi adoptada no experimento de triagem. Nos experimentos seguintes, as concentrações do componente foram distribuídas em um 3 x 3 x 3 grade dentro do intervalo de concentração definida, resultando em 27 experimentos. Durante todos os cultivos, cinco repetições do meio de referência foram incluídas, que serviu como padrão interno e para garantir que não há efeitos posicionais sobre o MTP ocorreram. Para os restantes 16 poços, as concentrações de NH4+, Ca2 +e Mg2 + foram aleatoriamente distribuídas dentro das escalas determinadas.
Figura 5 A visualiza os resultados das primeiras iterações. Rótulos de eixo referem-se as concentrações do componente usadas no meio de referência original, indicado por x Ref. As superfícies de azuis representam as interpolações de krigagem que foram calculadas utilizando o software KriKit. Cada superfície é associado com um nível de concentração relativa de NH4+ (azul escuro: 0 x Ref, xadrez: 1 x Ref, luz azul: 2 x Ref). Esta representação visual revela que é favorável para omitir NH4+. Superfícies de interpolação também mostram os efeitos positivos de Mg2 + e Ca2 +, como todos os aviões ascensão com concentrações crescentes.
Baseado nos resultados da iteração 1, decidiu expandir a concentração gama de Ca2 + e Mg2 + , duplicando as concentrações máximos e deslocando a janela de desenho experimental para o canto superior direito, ver Figura 5 B. dentro deste intervalo, as concentrações foram distribuídas em uma grade 6 x 6. Isso garante uma distribuição uniforme ao longo do intervalo de concentração total, levando a resultados óptimos de interpolação Kriging. Figura 5 B mostra a trama de interpolação Kriging baseada em dados combinados medido em ambas as iterações (pontos vermelhos e amarelos quadrados). Para tanto, Ca2 + e Mg2 +, o efeito positivo de aumentar suas concentrações continua. Consequentemente, o procedimento foi repetido, duplicando a concentração máxima e assim, a janela de desenho experimental foi movida para explorar os limites do canto superior direito.
Figura 6 A dá uma visão geral do processo de otimização restantes. A análise do conjunto de dados recolhido até iteração 3 revelou que uma limitação do efeito positivo de Mg2 +, ou seja, uma concentração óptima gama de Mg2 + foi identificada. Por conseguinte, decidiu expandir ainda mais o intervalo de concentração apenas para Ca2 + (iteração 4). Este procedimento foi repetido duas vezes (iteração 5 e 6) até que uma saturação do sinal de GFP foi encontrada. Esta saturação é explicada pela precipitação de sais de Ca para as concentrações aplicadas de Ca2 +, que não estão disponíveis para as células.
Como resultados experimentais são sempre perturbados pelo barulho, a resultante interpolação Kriging aparece irregular e inspeção visual pode levar a conclusões falsas. No entanto, o intervalo de concentração ideal de componentes de mídia para o sinal GFP saturado pode ser confiantemente identificado com o estatística z -teste, que também é implementado no Danilo. O z -teste usa diretamente a informação estatística intrínseca fornecida pela krigagem método, ou seja, valores de previsão e incertezas de previsão. Figura 6 B mostra o planalto identificado, como determinado e visualizado usando a caixa de ferramentas do Danilo.A caixa de ferramentas do Danilo é livremente disponível36 e vem com um tutorial detalhado que explica como usar seus recursos.
Se mais de dois componentes relevantes são encontrados, 3D-visualização atinge seu limite. Danilo fornece vários outros métodos de representação visual possível, tais como filmes ou "trama de triagem". Se o potencial ideal está dentro do intervalo de concentração definidas, novas experiências são projetadas automaticamente usando a melhoria esperada de40,46. O delineamento experimental baseado na melhoria esperada é integrado na caixa de ferramentas Danilo. Informações mais detalhadas podem ser encontradas na documentação do software.
Após o procedimento iterativo, foi realizada uma verificação dos resultados, conforme descrito na parte D. A validade dos pressupostos iniciais foi verificada através da realização de uma análise de sensibilidade adicional usando a composição ideal média. Ou seja, todos os componentes de mídia inicial de interesse eram variados, mas Ca2 + e Mg2 + foram definidas para seus níveis de concentração ideal. Neste estudo, as concentrações ideais <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 x Ref e <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6,8 x Ref foram escolhidos. A tabela 2 mostra os resultados da análise validação. Semelhante a sensibilidade inicial de triagem (cf. quadro 1), NH4+ ainda tem uma influência negativa significativa e efeitos restantes são ainda insignificantes.
Devido ao fácil acesso, o sinal de fluorescência do GFP da suspensão do cultivo foi utilizado para quantificar o título GFP extracelular durante todos os experimentos. Por razões de verificação, fluorescência de GFP foi validada contra outras medições. Porque GFP é secretada através da via-Tat, o sinal de fluorescência não pode discriminar entre intrae extracelular GFP. Assim, cultivos foram reproduzidos usando o meio de referência e o médio otimizado. Além da medição de fluorescência de sobrenadantes de cultivo sem célula, teor de proteínas foi quantificado pelo ensaio de Bradford e (semi)-melhoria qualitativa de GFP visualizado por SDS-Page15. Toda a medida resultante sinaliza aproximadamente foram dobrados para cultivos com meio otimizado em relação ao meio de referência e validado a cerca de 100% de melhoria do desempenho de secreção de médio otimizado. Por conseguinte, fluorescência específica de GFP de suspensão de cultivo pode ser considerada uma métrica adequada para o objetivo de otimização, ou seja, o título GFP extracelular.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
Figura 2 : Captura de tela da lista de pipetagem de volume para a análise de sensibilidade. Entradas na primeira coluna atribuir um identificador exclusivo para todos os volumes de uma linha; Esse identificador é o MTP bom número do cultivo alvo MTP o worktable líquido manipulador, cf. Figura 4C. Colunas restantes encode volumes para diferentes soluções ("Sln-01" a "15-Sln") para ser pipetado. O volume acumulado de uma linha corresponde ao volume final de cultivo do bem correspondente. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
Figura 3 : Screenshot do líquido manipulação de software de controle "WinPREP". Esquerda: Linha-ordenou comandos, incluindo um comando de transferência para cada solução a ser pipetado. Antes do comando final para adição do inóculo, um prompt de usuário é inserido para garantir que a cultura de semente é colocada na mesa na hora certa. Direita: Esquema de tabela de trabalho, incluindo a labware fonte para variação de existências (duas placas de poço profundo com 12 poços de coluna-como), a calha de reagente para estoque de descanso, água e inóculo e o cultivo de alvo de preparação de mídia MTP. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
Figura 4 : Compilação de screenshots detalhados para instalação de pipetagem de uma solução stock. (A) desembrulhou o comando para pipetagem de estoque de Fe. Labware fonte e origem bem dentro são marcadas sobre o worktable pela leitura do quadro e coluna vermelha da placa correspondente de poço profundo. Labware de destino e destino poços dentro são marcados pelo quadro azul ao redor e azuis poços de cultivo o alvo MTP. (B) vista de exemplo detalhado na atribuição de pipetagem volumes para esta etapa (solução estoque de Fe). Número de destinos é ler a lista de pipetagem, que possui 48 linhas. Os volumes de distribuição para todos os poços de destino para solução estoque de Fe encontra-se na coluna 4 na lista de pipetagem. Observe que a primeira coluna na lista de pipetagem contém identificadores e volumes não ser transferido, ver Figura 2. (C) detalhes sobre destino bem numeração. Volumes de escritos na linha #1 da lista correspondente de pipetagem vão ser pipetados em bem marcado como #1 e assim por diante. Poços #01, 08 #, #41 e #48 correspondem aos poços A01, A08, F01 e F08 para a codificação alfa-numérico, que é também impresso em cultivo MTP em si. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
Figura 5 : Detalhados os resultados da primeira iteração. (A) interpolação Kriging baseado em dados experimentais de iteração 1. Pontos vermelhos indicam o conjunto de dados. Para comparação, todas as superfícies de interpolação três são sobrepostas em uma trama (azul escuro: 0 x Ref, xadrez: 1 x Ref, luz azul: 2 x Ref). Uma representação alternativa dos resultados pode ser encontrada em outros lugares15. (B) interpolação Kriging baseada em experiências realizadas em iteração 1 (pontos vermelhos) e iteração 2 (quadrados amarelos).Partes dos dados apresentados nesta figura tem sido previamente publicados15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
Figura 6 : Descrição dos resultados de otimização iterativamente coletados. Kriging Final (A) modelo de previsão. (B) identificação estatística de área ideal (vermelho) baseia-se a estatística z-test, que é fornecido pelo Danilo. Caixas indicam sucessivas etapas de projeto iterativo e execução de experimentos. Partes dos dados apresentados nesta figura tem sido previamente publicados15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente de</td>
			<td>Valor médio do coeficiente normalizado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mn2 +</td>
			<td>-0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0,03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3BO3-</td>
			<td>0,06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: resultados da análise de sensibilidade. Valores do coeficiente que representa o efeito médio quando aumentando a concentração do componente respectivos meios de comunicação de seu valor de centro para seu valor máximo. Para ideais projetos experimentais, como encontrado na literatura padrão e usado aqui, o desvio-padrão representa diretamente a variação experimental devido à replicação do experimento referência. Valores do coeficiente foram normalizados pelo valor maxium (0.0422 para componente Ca2 +). Desvio-padrão coeficiente normalizado e absoluto é 0,54 e 0.0226, respectivamente.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente de</td>
			<td>Valor médio do coeficiente normalizado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mn2 +</td>
			<td>1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>0,69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3BO3-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: resultados da análise de sensibilidade final. Valores do coeficiente que representa o efeito médio quando aumentando a concentração do componente respectivos meios de comunicação de seu valor de centro para seu valor máximo. Como um projeto experimental óptimo foi usado, o desvio padrão só depende a variação experimental usando a composição média otimizada. Variação experimental ligeiramente aumentada em comparação com a variação usando o meio de referência. Valores do coeficiente foram normalizados pelo valor maxium (0.0106 para componente Mn2 +). Desvio-padrão coeficiente normalizado e absoluto é 3.63 e 0.0385, respectivamente.

Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Protocolo genérico para otimização da produção de proteína heteróloga usando tecnologia automatizada de Microbioreactor

Este manuscrito descreve uma abordagem genérica de design à medida dos meios de cultivo microbiano. Isso é ativado por um fluxo de trabalho iterativo combinando Kriging experimental design e microbioreactor tecnologia para throughput de cultivo suficientes, que é apoiado pela robótica de laboratório para aumentar a confiabilidade e a velocidade em mídia de manuseio de líquidos preparação.

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Desenvolvimento personalizado Ovário de Hamster Chinês hospedar-Cell ensaios de proteína utilizando a Tecnologia micropartícula Acústico Membrana

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Bioengenharia

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: uma plataforma automatizada para Discovery Biomassa Enzima e Otimização Cocktail

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

Alto rendimento, extração automatizada de DNA e RNA de amostras clínicas utilizando a Tecnologia TruTip em Robots Liquid Handling comuns

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Usando Tomoauto: Um Protocolo de métodos de alta capacidade automatizada Cryo-Electron Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Totalmente dispositivo automático centrífugo microfluídicos para a detecção de proteínas Ultrasensitive de Sangue Total

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Produção de produtos químicos por<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Usando o hidrolisado de bambu como matéria-prima

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Otimização de processos usando micro-bioreatores automatizados de alto throughput no cultivo de células de ovário de hamster chinês

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...