Name: generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

Научная деятельность центра науки биоэкономики были финансовой поддержке Министерство инноваций, науки и исследований в рамках NRW-Strategieprojekt BioSC (№ 313/323-400-002 13). Авторы благодарят Министерство инноваций, науки и исследования Северный Рейн-Вестфалия Heinrich Heine Университета Дюссельдорфа для стипендию Ларс Freier в рамках промышленной биотехнологии кластера CLIB-выпускник. Дополнительное финансирование было получено от программы запрещено включение «Гельмгольца инноваций лаборатории «Гельмгольц-Объединение немецких поддержать «Микробного Биопроцесс лаборатории – Гельмгольца инновационная лаборатория».

Авторы не имеют ничего сообщать.

Универсальный характер представленных протокола позволяет различные приспособления, например, для изучения других микробов выражение хостов9,47,48,49,50, 51, или для оптимизации других свойств целевого белка, как шаблон или дисульфида облигации гликозилирования. Протокол может также должны быть адаптированы к доступных лабораторное оборудование. Интеграция системы MBR позволяет увеличить экспериментальной пропускной способности, которая дает большую экономию времени. Однако при замене полностью инструментальной и controllable биореакторов MBR систем, масштабируемость результаты должны рассматриваться8,37,52,53. Использование МЭ методологий и математическое моделирование помогает увеличить информативность данных измерений в отношении изучал объективные54 эффективного планирования экспериментальных и данных на основе модели интерпретации15.
Изменения в метод Рядом с универсальная и расширяемая роботизированной жидкости, обработки систем, как он используется в настоящем исследовании следует отметить, что есть несколько меньше жидкости, коммерчески доступных систем, которые способны выполнять эту задачу и могут быть размещены внутри обработки Ламинарный поток работы скамейки. Если не автоматизированная система дозирования, композиции различных средств массовой информации в соответствии с планом Доу также могут быть реализованы путем ручной дозирование с помощью единого или многоканальных пипеток. Поскольку ручной подготовки более подверженным ошибкам и потребует целенаправленных работы довольно долгое время, рекомендуется подготовить меньшее количество композиций различных средств массовой информации.
В зависимости от возможностей системы занятых MBR будет меняться соответствующий протокол культивирования. Например если не онлайн измерение биомассы формирования доступен, он может быть достаточно для измерения концентрации биомассы после окончания эксперимента роста. В сочетании с онлайн мониторинг pH и растворенного кислорода, который реализуется в нескольких системах MBR, насыщения роста может быть достоверно определен. В принципе рост эксперименты могут проводиться в ССП, только размещены внутри автоклавы-смесители, без использования системы MBR. В этом случае, должны обеспечиваться надлежащее выращивание условия: (1) кислорода ограниченной культивирования можно избежать с помощью MTPs с подходящим геометрией, в сочетании с надлежащей пожимая частоты и покачивая диаметров, например, площадь 96 или 24 глубокую хорошо пластины работали на 1000 об/мин на 3 мм броска или 250 об/мин на 25 мм броска, соответственно. Важно отметить, что чем ниже достижимых кислорода Максимальная скорость передачи, тем меньше углерода основной источник следует сосредоточить. Как упоминалось выше, для этого исследования, использование глюкозы 10 г/Л был подходящим для предотвращения ограничение кислорода для занятых культивирования условий; (2) выборки ССП культур для количественной оценки биомассы и продукта должны быть сведены к минимуму. Каждый раз, когда ССП удаляется от тряски инкубатора, передачи кислорода будет немедленно поломки которого может привести к неблагоприятным культивирования условий; (3) по мнению авторов не рекомендуется использовать ССП читателей как выращивания устройств, как эти устройства не были разработаны для этой цели. Например пожимая механики были построены для случайного смешивания планшет после добавления реагента и таким образом, часто не хватает надежности для длинных продолжительностью дней непрерывной тряски. Кроме того достаточного питания, необходимые для культивирования микроорганизмов не могут быть реализованы в этих читателей. Интеграция оптической плотности чтений в короткие интервалы времени требует остановки пожимая движения, привело неоднократные периоды ограничения кислорода. Кроме того испарения в таких системах течение длительного культивирования периодов будут исказить результаты. Для более подробной информации о удивительно сложной темы по использованию ССП для культивирования микроорганизмов читатель отсылался к литературы22,23,24,25,26 и ссылки на них.
Дополнительные соображения Для ускорения итеративной оптимизации шаги рекомендуется тщательно выбрать аналитического метода для количественной оценки продукта. Быстрые и простые методы должны быть предпочтительным за счет точности и аккуратности, как итеративный экспериментальный дизайн стратегия допускает экспериментальной неточность. Однако окончательные результаты должны проверяться против продукт достаточно точной и точные методы количественной оценки, которые могут быть более сложными. В целом тщательной оценки и принятия решений о процедурах исследования требуют усилий в начале исследования, но платить в долгосрочной перспективе, после того, как обычные методы были созданы.
Настоятельно рекомендуется определить ссылку эксперимент, который сравнивается все эксперименты во время оптимизации. То есть прикладной компонент средней концентрации, а также измеренных вывода нормализуются через деления значения ссылки. Таким образом, каждый применяется и измеренное значение может интерпретироваться как x сложить значения ссылки. Принимать во внимание различия между пластинами, пять ссылки являются эксперименты на каждой табличке. Среднее значение результатов измерений используется для нормализации.
Это правило не может быть гарантировано что развитые среды является также оптимальным решением для других штаммов. Однако улучшение средних скорее всего будет также подходит для выращивания выражение штаммы с небольшой генетические различия, например, когда производить фермент варианты с одной аминокислотных замен полученные от мутагенеза исследования ( Хотя даже точечные мутации были описаны эффект клеточный метаболизм и гетерологичных выражение производительности55,56). В этом случае представленный протокол может быть первым шагом, затем протоколы для высокой пропускной способности выражение показы57. Если протокол используется для среднего развития с последующим масштаба до ФРС партии культивирования, оптимизированной среде должны быть проверены для соответствующих условий биопроцессов, как клон, скрининг в кампании на микромасштабной определены различные Топ исполнителей для различных стратегий кормления и культивирования СМИ52,58. Кроме того введен KriKit36 вообще может способствовать более целостный Биопроцесс оптимизации.Только недавно инструмент способности были расширены также поддерживать40многоцелевых оптимизации, которые могут быть важны для оптимизации как первичные и вторичные процессы59,60.

Рекомбинатные современной генной технологии позволяет широкое использование технических ферментов для различных применений в фармацевтической промышленности, животное питание, Органическая химия и пищевой1,2,3. Производство технических ферментов в больших количествах является главной темой для промышленной биотехнологии и оптимизированный Рекомбинантный белок производства и оба штамма и Биопроцесс инженерных необходима. Для поколения эффективно инженерии производства штаммов, имеются различные генетические библиотеки, например, для сбалансированного ген выражение4 или увеличение секреции эффективность5.
Corynebacterium glutamicum является крупным производителем аминокислот в промышленном масштабе6,7 и представляет хосту привлекательным нетрадиционных выражение для производства секреторную рекомбинантных белков8 ,9. Общие секреторной (Sec) и Твин аргинин транслокация (ТАТ) путь присутствуют в C. glutamicum и успешно применялись для рекомбинантных белков секрецию10. Обширный опыт в машиностроении Биопроцесс относительно аминокислота производства в промышленном масштабе, а также способность выделяют белки г/Л суммы11 и большой прочностью, относительно Биопроцесс неоднородностей в больших масштабах культивирования12,13, сделать C. glutamicum перспективной платформы организма для производства секреторную гетерологичных белков в промышленных масштабах.
Средний оптимизации питания, как известно, улучшить производство рекомбинантных белков с микробных систем14,,1516,17 и, следовательно, корректировка среднего Композиция представляет собой полезный шаг в Биопроцесс развития относительно оптимальной производительности18,19,,2021. Интенсивные исследования по применению микротитровальных пластин (ССП) для культивирования микроорганизмов22,,2324 проложили путь для разработки и проектирования ССП для культивирования микроорганизмов25 ,26 и развитие систем microbioreactor на основе ССП (MBR) с онлайн мониторинга и экологического контроля27,28. MBRs позволяют значительное увеличение пропускной способности экспериментального выращивания. Кроме того системы MBR, вытекающих из других видов биореакторов, например, Пузырьковые колонны или перемешивают танк реакторов, доступны для микробной Биопроцесс оптимизации29,,3031, 32.
В целом оптимизации исследований выгоду от расширения экспериментальной пропускной способности, которая становится еще более мощным в сочетании с Доу методологий, таких, как оценки взаимодействия между переменными дизайн или сокращению высокой мерный поиск пространства. Следовательно совместное использование систем MBR, лаборатории автоматизации и НОО оказался мощным методом в биотехнологии8,16,33,34,35.
Протокол для оптимизации средств массовой информации представлены сочетания современных лаборатории автоматизации, технологии MBR с онлайн процесса мониторинга и данных на основе кригинга анализ/экспериментальный дизайн. Кригинга методологии реализуется в MATLAB элементов («KriKit»), который может быть загружен и использоваться бесплатно бесплатно36. В качестве примера приложения максимизация производства секреторную зеленый ﬂuorescent белка (ГПУП) с C. glutamicum показано путем оптимизации состава минимальный средний CgXII. GFP титр был выбран в качестве цели оптимизации, как она может быть легко количественно и широко применяется в качестве модели белка для исследования на MBR систем37,,3839.
Представлены рамки делится на четыре шага, которые приведены на рисунке 1. Шаги обозначаются поле кадры и соответствуют разделам протокола. Первый шаг (рис. 1A) является определение целей проекта и определить необходимые методы. Сочетание Доу методики, технологии MBR и лаборатории автоматизации позволяет повысить экспериментальной пропускную способность, которая требует мощной обработки данных. Второй шаг (рис. 1B) стремится обнаружить чувствительных дизайн переменные (например, компонентов среды) с высоким влиянием на цели оптимизации. Это приводит к уменьшение количества дизайн переменные, представляющие интерес. Третий этап (рис. 1 c) включает в себя итеративной оптимизации для более детального исследования функциональных связей между остальные переменные дизайн и цели интерес. С помощью последовательно расширенного набора данных, кригинга подход применяется для предсказания экспериментальный результат на неизмеримое местах. Итерационный цикл останавливается, как только модель кригинга предсказывает оптимальный или плато с достаточной точностью. Результаты проверяются на четвертом шаге (рис. 1 d), начиная с дальнейшего анализа чувствительности вокруг определены оптимальные. Если первоначально, нечувствительным компоненты оказались нечувствительны также в регионе оптимального, это разумно предположить, что это справедливо во время процедуры итеративной оптимизации на третьем шаге. После этого рекомендуется проверить результаты оптимизации, применение ортогональных методов, как assay деятельности или SDS-Page.
Общий характер представленных протокола позволяет легко адаптации различных лабораторное оборудование, других хранилищ выражений и белков-мишеней выбор, а также дальнейшие Биопроцесс переменные как pH значение или выращивания температуры.Кроме того другие цели оптимизации как темп производства белка, конкретных урожайности или качество продукта может быть выбран для охвата других оптимизации исследований.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
Рисунок 1 : Рабочий процесс оптимизации исследования. Четыре рамка коробки соответствуют разделам протокола, «Зачатие и определения из методы изучения» (раздел 1), «Анализ чувствительности» (раздел 2), «Итеративной оптимизации» (раздел 3) и «Проверки» (раздел 4). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioLector</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>G-BL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowerplate</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>MTP-48-BOH</td>
			<td>For cultivation in the BioLector device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing foil</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>F-GP-10</td>
			<td>Sterile sealing for Flowerplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>2016b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KriKit</td>
			<td>Forschungszentrum J&#252;lich</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Freely available, MATLAB installation required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus pipetting robot</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Includes &#34;WinPrep&#34; software installation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-column deep well microplate</td>
			<td>E&#38;K Scientific</td>
			<td>EK-2034</td>
			<td>Container for medium stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplates, transparent, F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td>For Bradford protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;clear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655087</td>
			<td>For flourescence measurement in cell-free supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Research&#160;plus multi-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Facilitates manual liquid handling with microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruPAG&#160;Precast Gels</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCG2002</td>
			<td>For SDS-Page analysis of cell-free supernantants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&#8211;42 (2007)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology

Основной бизнес в промышленной биотехнологии с помощью микробных клеток заводов является итеративный процесс деформации инженерии и оптимизацию биопроцессов условий. Одним из важных аспектов является улучшение среды культивирования обеспечить оптимальные условия для микробной формирования продукта интерес. Также признается, что состав СМИ резко может повлиять на общую производительность Биопроцесс. Средний оптимизации питания, как известно, улучшения Рекомбинантный белок производства микробных систем и, таким образом, это является полезным шагом в развитии Биопроцесс. Однако очень часто стандартные СМИ рецепты взяты из литературы, так как индивидуальный дизайн среды выращивания является утомительной задачей, которая требует microbioreactor технологии для достаточно выращивания пропускную способность, быстрый продукт Google analytics, а также поддержка в лаборатории робототехники для включения надежность в жидкости обработка шаги. Кроме того расширенные математические методы необходимы для рационально анализа данных измерений и эффективно проектирования параллельных эксперименты, такие как добиться оптимального информационного содержания.
Общий характер представленных протокола позволяет легко адаптации различных лабораторное оборудование, других хранилищ выражений и белков-мишеней интерес, а также дальнейшего Биопроцесс параметров. Кроме того другие цели оптимизации как темп производства белка, конкретных урожайности или качество продукта может быть выбран для охвата других оптимизации исследований. Прикладной кригинга Toolbox (KriKit) является общий инструмент для дизайна из экспериментов (МЭ), способствует более целостный Биопроцесс оптимизации. Он также поддерживает многоцелевых оптимизации, которые могут иметь важное значение для оптимизации процессов вверх и вниз по течению.

Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Общий протокол для оптимизации производства гетерологичных белка с использованием автоматизированной технологии Microbioreactor

Эта рукопись описывается общий подход для индивидуальный дизайн микробной культивирования СМИ. Это обеспечивается итеративный процесс, сочетая кригинг-экспериментальный дизайн и microbioreactor технологии для достаточно культивирования пропускной способности, которая поддерживается в лаборатории робототехники для повышения надежности и скорости в жидкости, обработка СМИ подготовка.

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Разработка пользовательских яичника китайского хомячка, клетки-хозяина белка Анализы использованием Акустические технологии, микрочастицы Мембранные

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: Автоматизированная платформа для биомассы Открытие ферментов и коктейль-оптимизации

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

Высокая пропускная способность, автоматизированное извлечение ДНК и РНК из клинических образцов TruTip использованием технологий на общей жидкостной обработки Роботы

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Человека хрящевой ткани Изготовление с использованием трехмерных струйных технологии печати

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Использование Tomoauto: протокол для высокой пропускной автоматизированной Cryo-электронной томографии

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Полностью автоматизированный центробежный Микрожидкостных Устройство для сверхчувствительного обнаружения белка из цельной крови

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Производство химических веществ<em&gt; Флейм</em&gt; Использование бамбукового гидролизата в качестве исходного сырья

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Использование высокопроизводительного автоматизированная система Microbioreactor для производства модель IgG1 в клетках Чо

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Очистка и аналитика моноклонального антитела от китайских яичников хомяка с помощью автоматизированной системы микробиореактора

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Оптимизация процесса с использованием высокой пропускной связи Автоматизированные микро-биореакторы в китайском Хомстер яичников культивирования клеток

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...