Name: generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

Den vetenskapliga verksamheten på bioekonomi Science Center stöddes ekonomiskt av ministeriet för Innovation, vetenskap och forskning inom ramen för den NRW-Strategieprojekt BioSC (nr 313/323-400-002 13). Författarna vill tacka de ministeriet för Innovation, vetenskap, och forskning av norr Rhine-Westphalia och Heinrich Heine universitetet Düsseldorf för ett stipendium till Lars Freier inom CLIB-examen kluster industriell bioteknik. Ytterligare finansiering mottogs från programmet aktivera Spaces ”Helmholtz Innovation Labs” tyska Helmholtz Association att stödja den ”mikrobiell Bioprocess Lab – A Helmholtz Innovation Lab”.

Författarna har något att avslöja.

Den generiska typen av presenterade protokollet tillåter olika anpassningar, t.ex., för att studera andra mikrobiella uttryck värdar9,47,48,49,50, 51, eller att optimera andra egenskaper hos målproteinet, som glycosylation mönster eller disulphide obligationer. Protokollet kan också behöva anpassas till de tillgängliga labbutrustning. Integreringen av en MBR-systemet gör öka experimentella genomströmning, vilket möjliggör stora besparingar i tid. Dock när du byter fullt instrumenterade och kontrollerbar bioreaktorer av MBR systems, måste skalbarhet av resultaten anses8,37,52,53. Användning av DOE metoder och matematisk modellering hjälper till att maximera mätdata med avseende på den studera objektiva54 datainnehåll genom effektiv experimentell planering och modell-baserade data tolkning15.
Ändringar till metoden Bredvid flera syften och utbyggbart robotic vätskehanterande system som det som används i denna studie, bör det nämnas att det finns flera mindre vätskehanterande system kommersiellt tillgängliga som är kapabel att utföra denna uppgift och kan placeras inuti laminärt flöde arbete bänkar. Om ingen automatiserad pipettering system är tillgängliga, kan olika medier kompositioner enligt DOE planen också förverkligas genom manuell pipettering med enstaka eller flera kanaler pipetter. Eftersom manuell beredning är mer felbenägna och kommer kräva mycket fokuserat arbete för ganska lång tid, rekommenderas att förbereda ett lägre antal olika medier kompositioner.
Beroende på funktionerna i det sysselsatta MBR-systemet, kommer att motsvarande odling protokollet variera. Till exempel om ingen online mätning av biomassa bildandet är tillgänglig, kan det räcka att mäta biomassa koncentration efter avslutad tillväxt experimentet. I kombination med online-övervakning av pH och löst syre, som implementeras i flera MBR system, tillväxt mättnaden kan fastställas säkert. I princip kan de tillväxt-experiment genomföras i Mbps ensam placeras inuti skakar inkubatorer, utan användning av en MBR-systemet. I det här fallet korrekt odling villkor måste säkerställas: (1) syre-begränsad odlingar kan undvikas genom att använda Mbps med lämplig geometrier, i kombination med ordentlig skakar frekvenser och skakar diametrar, t.ex., torget 96 eller 24 djup plattor med drivs vid 1000 rpm på 3 mm throw eller vid 250 rpm på 25 mm throw, respektive. Ännu viktigare, ju lägre uppnås maximal syre överföringshastighet, desto lägre den huvudsakliga kolkälla bör koncentreras. Som nämnts ovan, för denna studie, var användningen av 10 g/L glukos lämplig för att förhindra att syre begränsning för de sysselsatta odling villkor; (2) provtagning av MTP kulturerna för biomassa och produkten kvantifiering bör minskas till ett minimum. Varje gång MTP tas bort från skakningar inkubatorn, syretransporten kommer omedelbart breaken-down som kan resultera i unfavorable odling villkor; (3) enligt författarna rekommenderas inte användning av MTP läsare som odling enheter som dessa enheter inte har utvecklats för detta ändamål. Till exempel skakningar mekanik byggdes för tillfällig blandning av mikroplattor efter reagens tillägg och således saknar ofta robusthet för långa serier av kontinuerlig skakningar varar i dagar. Dessutom kan inte tillräcklig ineffekt behövs för mikrobiell odlingar realiseras i dessa läsare. Integrationen av Absorbansavläsningar kort tidsintervall kräver stopp av skakningar rörelse, vilket resulterar i upprepade perioder av syre begränsning. Dessutom kommer avdunstning i sådana system över lång odling perioder snedvrida resultaten. För mer information om överraskande komplexa ämnet på att använda Mbps för mikrobiell odlingar, hänvisas till den citerade litteraturen22,23,24,25,26 och referenser däri.
Ytterligare överväganden Speed-up iterativ optimering steg, är det klokt att noga välja den analytiska metoden för produkten kvantifiering. Snabba och enkla metoder att föredra på bekostnad av precision och noggrannhet, som strategin iterativ experimentell design tål experimentella felaktighet. Dock måste de slutliga resultaten verifieras mot tillräckligt precisa och korrekta produkten kvantifiering metoder som kan vara mer komplicerat. I allmänhet noggrann utvärdering och beslutsfattande om studien förfaranden kräver ansträngning i början av studien, men betalar på sikt, efter rutinmetoder har fastställts.
Det rekommenderas starkt att definiera ett referens-experiment som jämförs till alla experiment under optimeringen. Det vill säga är den tillämpad medium komponent koncentrationer samt uppmätta utdata normaliserade via divideras med referensvärden. På så sätt varje tillämpas och uppmätta värdet kan tolkas som x-luckan av referensvärdet. För att ta in i konto variationer mellan plattorna, utförs fem referens experiment på varje tallrik. Medelvärdet för de uppmätta resultatet används för normalisering.
Det kan generellt inte garanteras att det utveckla mediet är också optimal för andra stammar. Det förbättra mediet kommer troligen också dock lämpliga för odling uttrycket stammar med små genetiska skillnader, t.ex., när producerar enzymet varianter med enda aminosyra substitutioner erhållits från mutagenes studier ( även om ens enda punktmutationer har beskrivits att effekt cellulär metabolism och heterologa uttryck prestanda55,56). I detta fall kan presenteras protokollet vara ett första steg, följt av protokoll för hög genomströmning uttryck filmvisningar57. Om protokollet används för medium utveckling med efterföljande skala upp till fed-batch odlingar, bör optimerad medium kontrolleras för motsvarande bioprocess villkor, som klon screening kampanjer på den hur provtagningsutrustningen skall identifieras olika topp Artister för olika utfodring strategier och odling media52,58. Dessutom kan den introducerade KriKit36 generellt bidra till förbättrad holistisk bioprocess optimering.Nyligen utvidgades verktyg förmåga att också stödja flera mål optimering40, som kan vara viktiga för att optimera både uppströms och nedströms processer59,60.

Modern rekombinant genteknik möjliggör en omfattande användning av tekniska enzymer för olika applikationer i läkemedelsindustrin, djurfoder, organisk kemi, och livsmedelsbearbetning1,2,3. Produktionen av tekniska enzymer i stora kvantiteter är ett stort ämne för industriell bioteknik och optimerad rekombinant proteinproduktion, och både stam och bioprocess teknik behövs. För generationen av effektivt konstruerade produktion stammar, det finns olika genetiska bibliotek, t.ex., för balanserad gene expression4 eller ökad utsöndring effektivitet5.
Corynebacterium glutamicum är en stor producent av aminosyror på industriell skala6,7 och utgör en attraktiv icke-konventionella uttryck värd för sekretoriska produktion av rekombinanta proteiner8 ,9. Både allmänna sekretoriska (Sec) och twin-arginin translokation (Tat) väg finns i C. glutamicum och tillämpades för rekombinant protein sekretion10. Lång erfarenhet av bioprocess engineering angående aminosyra produktion i industriell skala, liksom förmågan att utsöndra proteiner till redov belopp11 och stor robusthet om bioprocess inhomogeneities Funna i stor skala odlingar12,13, göra C. glutamicum en lovande organism som plattform för sekretoriska produktionen av heterologa proteiner i industriell skala.
Nutrition medium optimering är känt att förbättra rekombinant proteinproduktion med mikrobiella system14,15,16,17 och följaktligen justeringen av medium sammansättningen är ett givande steg i bioprocess utveckling med avseende på optimal produktivitet18,19,20,21. Intensiv forskning om tillämpningen av mikrotiter plattor (Mbps) för mikrobiell odling22,23,24 banade väg för utveckling och design av Mbps för mikrobiell odling25 ,26 och utvecklingen av MTP-baserade microbioreactor (MBR) system med online-övervakning och kontroll27,28. MBRs möjliggör en betydande ökning av experimentell odling genomströmning. Dessutom finns MBR system som härrör från andra typer av bioreaktorer, t.ex., bubbla kolumner eller stirred tank reaktorer, tillgängliga för mikrobiell bioprocess optimering29,30,31, 32.
I allmänhet gynnas optimering studier av ökad experimentella genomströmning, som blir ännu mer kraftfull i kombination med DOE metoder, såsom att bedöma samspelet mellan design variabler eller minska högdimensionella Sök utrymmen. Den kombinerade användningen av MBR system, lab automation och DOE har följaktligen visat sig vara en kraftfull metod i bioteknik8,16,33,34,35.
Ett protokoll för medier optimering presenteras kombinerar state-of-the-art lab automation, MBR teknik med online processövervakning och Kriging-baserade data analys/experimentell design. Kriging metoden är implementerad i en MATLAB verktygslåda (”KriKit”) som kan laddas ner och användas utan kostnad36. Som exempel på tillämpning exempel visas maximering av sekretoriska grönt fluorescerande protein (GFP) produktion med C. glutamicum genom att optimera sammansättningen av CgXII minimalmedium. GFP titer valdes som optimering målet eftersom det kan kvantifieras enkelt och det är allmänt tillämpas som modell protein för studier på MBR system37,38,39.
Presenterade ramen är uppdelad i fyra steg, som illustreras i figur 1. Stegen indikeras av rutan bildrutor och motsvarar delar av protokollet. Det första steget (figur 1A) är att definiera projektmålen och bestämma de nödvändiga metoderna. Kombinationen av DOE metoder, MBR teknik och lab automation möjliggör en ökad experimentella genomströmning som kräver kraftfull databehandling. Det andra steget (figur 1B) syftar till att identifiera känsliga design variabler (dvsmedelstora komponenter) med hög påverkan på syftet optimering. Detta leder till ett minskat antal design variabler av intresse. Det tredje steget (figur 1 c) består av en iterativ optimering för en mer detaljerad undersökning av det funktionella sambandet mellan variablerna återstående design och målet av intresse. Metoden med Kriging används för att förutsäga den experimentella resultaten på ouppmätta platser och använder successivt utökade datauppsättningen. Den iterativa cykeln stannar så snart Kriging modellen förutspår en optimal eller platå med tillräcklig noggrannhet. I det fjärde steget (figur 1 d), börjar med en ytterligare känslighetsanalys runt den identifiera optimaln verifieras resultatet. Om inledningsvis okänsliga komponenter befinns vara okänsliga också i regionen optimalt, är det rimligt att anta att detta gäller under det iterativa optimering förfarandet i det tredje steget. Efteråt, det rekommenderas att kontrollera optimering resultatet av tillämpningen av ortogonala metoder, som en aktivitet assay eller SDS-Page.
Generisk beskaffenhet presenteras protokollet möjliggör enkel anpassning till olika labbutrustning, andra uttryck värdar och målproteiner för val, liksom ytterligare bioprocess variabler som pH värde eller odling temperatur.Dessutom kan andra optimering mål som protein produktionstakt, viss avkastning eller produktkvalitet vara utvalda för att passa omfattningen av andra optimering studier.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
Figur 1 : Arbetsflöde för optimering studie. Rutorna fyra ram motsvarar delar av protokollet, ”att bli gravid den studien och Definition av metoder” (avsnitt 1), ”känslighetsanalys” (avsnitt 2), ”iterativ optimering” (avsnitt 3) och ”validering” (avsnitt 4). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioLector</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>G-BL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowerplate</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>MTP-48-BOH</td>
			<td>For cultivation in the BioLector device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing foil</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>F-GP-10</td>
			<td>Sterile sealing for Flowerplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>2016b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KriKit</td>
			<td>Forschungszentrum J&#252;lich</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Freely available, MATLAB installation required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus pipetting robot</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Includes &#34;WinPrep&#34; software installation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-column deep well microplate</td>
			<td>E&#38;K Scientific</td>
			<td>EK-2034</td>
			<td>Container for medium stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplates, transparent, F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td>For Bradford protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;clear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655087</td>
			<td>For flourescence measurement in cell-free supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Research&#160;plus multi-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Facilitates manual liquid handling with microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruPAG&#160;Precast Gels</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCG2002</td>
			<td>For SDS-Page analysis of cell-free supernantants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&#8211;42 (2007)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology

En kärnverksamhet i industriell bioteknik med mikrobiell produktion cell fabriker är iterativa processen av stam ingenjörskonst och optimering av bioprocess villkor. En viktig aspekt är förbättring av odling medium att ge en optimal miljö för mikrobiell bildandet av produkten av intresse. Det är väl accepterat att media sammansättning kan dramatiskt påverka bioprocess prestanda. Nutrition medium optimering är känt att förbättra rekombinant protein produktion med mikrobiella system och således, detta är en givande steg i bioprocess utveckling. Dock är mycket ofta standardmedia recept hämtade från litteraturen, eftersom skräddarsydda design av odling medium är en mödosam uppgift som kräver microbioreactor teknik för tillräcklig odling genomströmning, snabb produkt analytics, samt stöd av lab robotics aktivera tillförlitlighet i vätskehantering steg. Dessutom krävs avancerade matematiska metoder för att rationellt analysera mätdata och effektivt designa parallella experiment såsom för att uppnå optimal informationsinnehåll.
Generisk beskaffenhet presenteras protokollet möjliggör enkel anpassning till olika labbutrustning, andra uttryck värdar och målproteiner av intresse, liksom ytterligare bioprocess parametrar. Dessutom kan andra optimering mål som protein produktionstakt, viss avkastning eller produktkvalitet vara utvalda för att passa omfattningen av andra optimering studier. Verktygslådan för tillämpad Kriging (KriKit) är ett generellt verktyg för Design av experiment (DOE) som bidrar till förbättrad holistisk bioprocess optimering. Det stöder också flera mål optimering som kan vara viktiga i att optimera både uppströms och nedströms processer.

Introducerade protokollet tillämpades för att maximera antikroppnivåns på utsöndrade GFP. Särskilt god Jordbrukarsed titern efter 17 h odling valdes som syftet optimering. Online fluorescens detektion av GFP tillåtna enkel produkt kvantifiering. Normalisering av GFP signal med data från en referens-odling är dock nödvändigt att säkerställa reproducerbarhet och resultaten kan jämföras. Ett första urval av mediekomponenter utfördes på rationell grund som beskrivs i avsnitt 1. Experimenten utfördes enligt anvisningarna i avsnitt 1: parametrarna för de våta labb förfaranden definieras för hela studien säkerställa samstämmighet och reproducerbarheten av resultaten.
Som beskrivs i avsnitt 2, utfördes en inledande screening för att identifiera relevanta komponenter visar en betydande inverkan på optimering målet för ytterligare och mer detaljerade studier. MTP-baserade MBR systemet tillåter 48 experiment kan utföras parallellt. 11-6 fraktionerad tar hänsyn till det maximala antalet möjliga parallella experiment på en MTP (48) och det totala antalet media komponenter (11) gör det 2IVoch utforma ett lämpligt val. Denna experimentella design består av 32 experiment och tillåter skattning av den huvudsakliga effekten för samtliga undersökta media komponenter. Återstående odling brunnarna (16) användes för flera replikat av experiment med referens mediet för att bedöma reproducerbarheten och positionella effekter. Det vill säga varje experiment utförs en gång (inget replikat), utom referens experimentet (fem replikat).
Tabell 1 sammanfattar resultaten av screening analysen. I den ansedda koncentrationsintervall visade varierande majoriteten av mediekomponenter inte en märkbar effekt på målet. Komponenten NH4+ visar starkt negativt, medan Ca2 + och Mg2 + visar den starkaste positiva tendensen. Effekten av Mg2 + för den aktuella koncentrationsintervall är inte betydande men kan vara för en bredare koncentration. Det beslutades därför att utelämna NH4+ från medlet och att undersöka effekten av Ca2 + och Mg2 + i ytterligare experiment.
Avsnitt 3 beskriver hur iterativ optimering som används för att maximera GFP fluorescens signalen samtidigt varierande koncentrationerna av Ca2 + och Mg2 +. I iteration 1 testades hypotesen att NH4+ kan utelämnas. Koncentrationsintervall för Ca2 + och Mg2 + antogs av screening-analysen. Den lägsta koncentrationen av NH4+ sattes till noll och maximikoncentrationer antogs från screening experiment. I de följande experiment distribuerades komponent koncentrationerna över ett 3 x 3 x 3 rutnät inuti den definierat koncentrationsintervall, vilket resulterar i 27 experiment. Under alla odlingar, det ingick fem replikat av referens medium, som tjänade som intern standard och att säkerställa att inga positionella effekter över MTP uppstått. För de återstående 16 brunnarna distribuerades slumpmässigt koncentrationerna av NH4+, Ca2 +och Mg2 + släpper de givna intervall.
Figur 5 A visualiserar resultaten av de första iterationerna. Axeletiketterna avse de komponent-koncentrationer som används i det ursprungliga referens mediet, anges av x Ref. De blå ytorna representera de Kriging interpolationer som beräknades med hjälp av KriKit programvara. Varje yta är associerade med en relativ koncentrationsnivå för NH4+ (mörkblå: 0 x Ref, rutig: 1 x Ref, ljusblå: 2 x Ref). Denna visuella representation avslöjar att det är gynnsamt att utelämna NH4+. Interpolation ytor visar också de positiva effekterna av både Mg2 + och Ca2 +, alla flygplan stiger med ökande koncentrationer.
Baserat på resultaten av iteration 1, beslutades det att expandera den koncentration utbud av Ca2 + och Mg2 + genom att fördubbla de maximala koncentrationerna och skiftande experimentell design-fönstret till det övre högra hörnet, se figur 5 B. inuti detta intervall, koncentrationerna distribuerades på ett 6 x 6-rutnät. Detta säkerställer en jämn fördelning över intervallet full koncentration, vilket leder till optimal Kriging interpolation resultat. Figur 5 B visar Kriging interpolation tomten baserat på kombinerade data mäts i båda iterationer (röda prickar och gula rutor). För båda, Ca2 + och Mg2 +, fortsätter den positiva effekten av ökande deras koncentrationer. Följaktligen proceduren upprepades genom att fördubbla den maximala koncentrationen och således fönstret experimentell design flyttades till utforska gränserna för det övre högra hörnet.
Figur 6 A ger en översikt över återstående optimering förfarandet. Analysen av insamlade data set upp till iteration 3 visade en begränsning av den positiva effekten av Mg2 +, dvs, en optimal koncentration utbud av Mg2 + identifierades. Det beslutades därför att ytterligare utöka koncentrationsintervall endast för Ca2 + (iteration 4). Denna procedur upprepades två gånger (iteration 5 och 6) tills en mättnad av GFP signal hittades. Denna mättnad förklaras av utfällning av Ca-salter för tillämpad koncentrationerna av Ca2 +, som inte är tillgängliga för cellerna.
Som experimentella resultat är alltid oroad över buller, den resulterande Kriging interpolation visas oregelbundna och okulärbesiktning kan leda till falska avslutningar. Dock kan det optimala koncentrationen utbudet av media-komponenter för mättade GFP signalen identifieras tillförlitligt med statistiska z -test, som genomförs också i KriKit. Z -testet använder direkt inneboende statistiska uppgifter från Kriging metod, dvs., förutsägelse värden och förutsägelse osäkerheter. Figur 6 B visar identifierade platån, som beslutsamt och visualiseras med hjälp av verktygslådan KriKit.KriKit verktygslådan är fritt tillgängliga36 och kommer med en utförlig handledning som förklarar hur till använda dess funktioner.
Om fler än två relevanta komponenter finns, når 3D-visualisering sin gräns. KriKit innehåller flera andra möjliga visuella representation metoder såsom filmer eller ”screening tomt”. Om den optimala potentialen ligger innanför det definierat koncentrationsintervallet, konstruerade nya experiment automatiskt med den förväntade förbättring40,46. Experimentell design baserat på den förväntade förbättringen är integrerad i verktygslådan KriKit. Mer detaljerad information finns i dokumentationen till programvaran.
Efter förfarandet för iterativ genomfördes en verifiering av resultaten, som beskrivs i del D. Giltigheten av grundantaganden kontrollerades genom att utföra en ytterligare känslighetsanalys med den optimala medium sammansättningen. Det vill säga alla ursprungliga media komponenter av intresse var varierade, men Ca2 + och Mg2 + sattes till sin optimala koncentrationsnivåer. I denna studie, de optimala koncentrationerna <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 x Ref och <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6,8 x Ref valdes. Tabell 2 visar resultatet av valideringen screening. Liknar den ursprungliga känslighet screening (Se tabell 1), NH4+ fortfarande har en betydande negativ inverkan och återstående effekter är fortfarande försumbar.
På grund av enkel åtkomst användes GFP fluorescens signalen från odling suspensionen att kvantifiera den extracellulära GFP-titern under alla experiment. För verifiering skäl validerades GFP fluorescens mot andra mätningar. Eftersom god Jordbrukarsed utsöndras via Tat-vägen, inte kan fluorescens signalen diskriminera mellan intra- och extracellulära GFP. Således, odlingar reproducerades använder referens mediet och optimerad medium. Förutom fluorescens mätningen från cellfria odling supernatanterna, kvantifierades proteininnehåll av Bradford assay och (semi)-kvalitativ god Jordbrukarsed förbättring visualiseras av SDS-Page15. Alla resulterande mätning signaler var ungefär fördubblats för odlingar med optimerad medium jämfört med referens medium och validerade den ungefärligt 100% förbättring av sekretion prestanda optimerad medium. Följaktligen, GFP specifika fluorescens odling suspension kan anses vara ett lämpligt mått för optimering målet, dvsden extracellulära GFP-titern.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
Figur 2 : Skärmdump från volymlistan pipettering för känslighetsanalys. Poster i den första kolumnen tilldela en unik identifierare för alla volymer av en rad; identifieraren är den väl antal mål odling MTP på den flytande handler arbetsbord, jfr figur 4CMTP. Återstående kolumner koda volymer för olika lösningar (”Sln-01” till ”Sln-15”) för att vara pipetteras. Kumulativa volymen av en rad motsvarar den slutliga odling volymen av motsvarande väl. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
Figur 3 : Skärmdump från den vätskehantering styrprogram ”WinPREP”. Vänster: Rad-beställt kommandon, inklusive ett överföring-kommando för varje stamlösningen till vara pipetteras. Före sista kommandot för inokulum tillägg infogas en användaren prompt för att säkerställa utsäde kulturen är placerad vid bordet precis i tid. Höger: Schematisk bild av den arbetsbord, inklusive den källa labware för Variation lager (två djupt plattor med 12 kolumn-liknande brunnar), reagens dalvärdet för resten lager, vatten och inokulum och media förberedelse målet odling MTP. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
Figur 4 : Sammanställning av detaljerade skärmdumpar för inställning av pipettering av en stamlösning. (A) oöppnade kommando för pipettering av Fe lager. Källa labware och källa väl markeras inom på arbetsbord av Läs ram och röd kolumn av motsvarande djup väl plattan. Destination labware och destination brunnar inom markeras av blå ram runt och blå brunnar i målet odling MTP. (B) detaljerade exempel Visa på uppdrag för pipettering av volymer för det här steget (Fe stamlösning). Antal resmål läses från listan pipettering, som har 48 rader. Dispensering volymer för alla destination brunnar för Fe stamlösning finns i kolumn 4 i listan pipettering. Observera att den första kolumnen i listan pipettering innehåller identifierare och inte volymer som ska överföras, se figur 2. (C) information om destination väl numrering. Volymer som skriven i raden #1 för motsvarande pipettering lista kommer vara pipetteras i brunn som markerats som #1, och så vidare. Wells #01, #08, #41 och #48 motsvarar brunnar A01, A08, F01 och F08 för Alfa-numeriska kodning, som trycks också in i odlingen MTP själv. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
Figur 5 : Detaljerade resultat från den första upprepningen. (A) Kriging interpolation baserat på experimentella data av iteration 1. Röda prickar indikerar datauppsättningen. För jämförelse, alla tre interpolation ytor är overlayed i en komplott (mörkblå: 0 x Ref, rutig: 1 x Ref, ljusblå: 2 x Ref). En alternativ representation av resultaten kan hittas någon annanstans15. (B) Kriging interpolation baserat på experimenten utförs i iteration 1 (röda prickar) och iteration 2 (gula rutor).Delar av de data som presenteras i denna siffra har varit tidigare publicerade15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
Figur 6 : Skildring av iterativt insamlade optimering resultat. (A) slutliga Kriging modell förutsägelse. (B) statistiska identifiering av optimal område (röd) baserat på statistiska z-testet, som tillhandahålls av KriKit. Rutorna ange successiva steg iterativ design och genomförande av experiment. Delar av de data som presenteras i denna siffra har varit tidigare publicerade15. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Normaliserade koefficient medelvärdet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FE2 +</td>
			<td>-0,08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mn2 +</td>
			<td>-0,05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0,21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0,21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>-0,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0,10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0,03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>0,06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2 +</td>
			<td>1,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2 +</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 1: resultaten av känslighetsanalysen. Värden på adsorptionskoefficienten som representerar den genomsnittliga effekten när öka respektive media komponent koncentrationen från dess centrum värde till sitt maximala värde. För optimal experimentell design, som finns i standard litteraturen och används här, den standardavvikelse representerar direkt experimentell variation på grund av replikering av referens experiment. Värden på adsorptionskoefficienten var normaliserade av maxium värde (0.0422 för komponenten Ca2 +). Normaliserat och absolut koefficienten standardavvikelsen är 0,54 och 0.0226, respektive.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Normaliserade koefficient medelvärdet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FE2 +</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mn2 +</td>
			<td>1,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>0,69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 2: resultat av den slutliga känslighetsanalysen. Värden på adsorptionskoefficienten som representerar den genomsnittliga effekten när öka respektive media komponent koncentrationen från dess centrum värde till sitt maximala värde. En optimal experimentell design användes, beror standardavvikelsen bara på experimentell variation med den optimerade medium sammansättningen. Experimentell variation ökade något jämfört med variationen med referens medium. Värden på adsorptionskoefficienten var normaliserade av maxium värde (0.0106 för komponenten Mn2 +). Normaliserat och absolut koefficienten standardavvikelsen är 3,63 och 0.0385, respektive.

Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generiskt protokoll för optimering av heterologa proteinproduktion med hjälp av automatiserad Microbioreactor teknik

Detta manuskript beskrivs en allmän metod för skräddarsydda design av mikrobiell odling medier. Detta är aktiverat genom en iterativ arbetsflöde som kombinerar Kriging-baserade experimentell design och microbioreactor teknik för tillräcklig odling genomströmning, vilket stöds av lab robotics att öka tillförlitlighet och snabbhet i vätskehantering media beredning.

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Utveckla anpassade kinesisk hamster-host cellprotein analyser med hjälp av akustisk teknik Membran mikropartikelenzymimmunoassay

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: en automatiserad plattform för biomassa Enzyme Discovery och Cocktail optimering

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

Hög genomströmning, automatiserat rena fram DNA och RNA från kliniska prover med TruTip Technology om gemensamma Vätskehantering Robotar

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human Brosk Tissue Fabrication Använda Tredimensionell Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Använda Tomoauto: Ett protokoll för hög kapacitet Automatiserad Cryo-elektron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Helautomatiska centrifugala mikroflödessystem enhet för Ultraproteindetektion från helblod

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Produktion av kemikalier av<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Användning av bambuhydrolysat som råvara

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Användning av High-Throughput automatiserat Microbioreactor System för produktion av modell IgG1 i CHO-celler

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rening och analys av en monoklonal antikropp från äggstocksceller från kinesisk hamster med hjälp av ett automatiserat Mikrobioreaktor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Processoptimering med hög genomströmning Automatiserad Mikro-Bioreaktorer i kinesisk hamster äggstockscellodling

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...