Name: generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology
Uploaded: 2017-12-15T13:00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

Bioeconomy bilim merkezi bilimsel faaliyetleri mali NRW-Strategieprojekt BioSC (No. 313/323-400-002 13) çerçevesinde İnovasyon Bakanlığı, bilim ve araştırma tarafından desteklendi. Yazarlar İnovasyon Bakanlığı, bilim ve araştırma Kuzey Ren-Vestfalya ve Heinrich Heine Üniversitesi Düsseldorf Lars Freier CLIB-Graduate küme endüstriyel biyoteknoloji içinde burs için teşekkür ederiz. Daha fazla fon etkinleştirme alanlarda Program "mikrobiyal Biyoproses laboratuvar – A Helmholtz Yenilik Lab" desteklemek için Almanca Helmholtz Derneği "Helmholtz yenilik Labs" alındı.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Çeşitli adaptasyonlar, diğer mikrobiyal ifade ana bilgisayarları9,47,48,49,50, çalışmak için örneğin, sunulan genel doğası sağlar 51, veya diğer özellikleri hedef proteinin glikozilasyon desen veya disülfür bağları gibi optimize etmek için. Protokolü de kullanılabilir laboratuar ekipmanları için adapte gerekebilir. Zamanında büyük tasarruf sağlayan deneysel işlem hacmi, artan bir MBR sistem entegrasyonu sağlar. Ancak, tam olarak belgelenmiş ve kontrol edilebilir Biyoreaktörler MBR sistemleri tarafından değiştirirken,8,37,52,53ölçeklenebilirlik sonuçlarının düşünülmelidir. DOE Metodolojisi ve matematiksel modelleme kullanımını verimli deneysel planlama ve veri modeli tabanlı yorumu15tarafından ölçüm veri okudu objektif54 ile ilgili bilgi içeriği en üst düzeye çıkarmak için yardımcı olur.
Yöntemine yapılan değişiklikler İşleme sistemlerini gibi bu çalışmada kullanılan bir çok amaçlı ve Genişletilebilir robot sıvı yanında, birkaç küçük sıvı işleme sistemlerini piyasada bulunan bu görevi gerçekleştirmek yeteneğine sahiptir ve içine yerleştirilen vardır belirtilmelidir laminar akım çalışma tezgahları. Hiçbir otomatik pipetting sistemi varsa, farklı medya besteleri DOE planına göre tek ve/veya çok kanallı Pipetler kullanarak el ile pipetting tarafından da gerçekleştirilebilir. El ile hazırlık hataya daha ve çok odaklı iş oldukça uzun bir süre için gerektirecektir olduğundan daha düşük bir sayı farklı medya kompozisyon hazırlamak için önerilir.
İstihdam MBR sistem özelliklerine bağlı olarak, ilgili ekimi iletişim kuralı değişir. Örneğin, herhangi bir online ölçü biyokütle oluşumu varsa, biyokütle konsantrasyonu büyüme deney tamamlanmasından sonra ölçmek yeterli olabilir. Online izleme ile birlikte pH ve birkaç MBR sistemlerinde uygulanır, çözünmüş oksijen büyüme doygunluk güvenli bir şekilde tespit edilebilir. Prensip olarak, yalnız İnkübatörler, MBR sistemi kullanmaya gerek kalmadan sallayarak içine yerleştirilen MTPs içinde büyüme deneyler yapılabilir. Bu durumda, uygun yetiştirme koşulları sağlanmış olur zorunda: (1) oksijen sınırlı arazisi kaçınılması MTPs uygun frekansları sallayarak ve sallayarak çapları, örneğin, 96 veya derin 24 kare ile birlikte uygun geometrileri ile kullanarak iyi tabak 1000 devirde 3 mm atmak veya 250 devir / dakikada 25 mm atmak, sırasıyla işletilmektedir. Önemlisi, düşük ulaşılabilir maksimal oksijen transfer oranları, alt ana karbon kaynağı konsantre olmalıdır. Bu çalışmada, yukarıda belirtildiği gibi 10 g/M glikoz kullanımını oksijen sınırlama istihdam yetiştirme koşulları için önlemek uygun; (2) örnekleme biyokütle ve ürün miktar MTP kültürler minimumda azaltılmalıdır. MTP sallayarak kuluçka makinesi kaldırılır her zaman oksijen transfer hemen break-olumsuz yetiştirme koşullarında neden olabilir aşağı; (3) bu cihazlar bu amaçla geliştirilen değil gibi yazarlar görüşüne MTP okuyucular ekimi aygıtları olarak kullanımı tavsiye edilmez. Örneğin, titreyen mekaniği ara sıra Mikroplaka reaktif eklenmesinden sonra karıştırma için inşa edildi ve böylece, genellikle gün boyunca sürekli sallayarak kalıcı uzun ishal için sağlamlık eksikliği. Ayrıca, mikrobiyal arazisi için gereken yeterli güç girişini bu okuyucular fark edemez. Optik yoğunluk okuma entegrasyonu kısa zaman aralıkları gerektirir tekrarlanan oksijen sınırlama dönemlerinde ortaya çıkan sallayarak hareket durdurma. Ayrıca, uzun yetiştirme süreleri üzerinden bu tür sistemlerde buharlaşma sonuçları bozar. Şaşırtıcı karmaşık konu MTPs mikrobiyal arazisi için kullanma hakkında daha fazla ayrıntı için atıf edebiyat22,23,24,-25,26 okuyucu denir ve orada başvuruyor.
Daha fazla dikkat edilmesi gereken noktalar Hızlandırmak yinelemeli optimizasyonu adımları için bu dikkatli bir şekilde ürün miktar için analitik yöntem seçmek için tavsiye edilir. Yinelemeli deneysel tasarım stratejisi deneysel yanlışlık'in tolerans göstereceği gibi hızlı ve basit yöntemler hassasiyet ve doğruluk, pahasına tercih edilmelidir. Ancak, kesin sonuçları daha karmaşık olabilir yeterince hassas ve doğru ürün miktar yöntemleri karşı kontrol edilmelidir. Genel olarak, dikkatli değerlendirme ve karar verme çalışma prosedürleri hakkında çalışma başlangıcı çaba gerektirir, ama olağan yöntemleri kurduk sonra uzun vadede ödemek.
Karşılaştırıldığında bir başvuru deneyi tüm deneyler için en iyileştirme sırasında tanımlamak için önerilir. Diğer bir deyişle, ölçülen çıkış yanı sıra uygulamalı orta bileşen konsantrasyonları referans değerleri tarafından bölünmesi ile normalleştirilmiş. Bu şekilde, her uygulanmasını ve ölçülen değeri referans değeri x-kat yorumlanabilir. Tabakalar arasında farklılıklar hesap içine almak, beş başvuru deneyler her plaka üzerinde gerçekleştirilir. Ölçülen sonuç ortalama değerini normalleştirme için kullanılır.
Bu genellikle gelişmiş orta aynı zamanda diğer suşlar için en uygun olduğunu garanti edilemez. Ancak, gelişmiş orta büyük ihtimalle de tek amino asit kısaltmaları ile enzim çeşitleri üreten elde zaman mutagenesis çalışmalar () ifade suşları ile küçük genetik farklılıklar, örneğin, yetiştirilmesi için uygun olacaktır Her ne kadar) etkisi hücre metabolizması ve kapaklı ifade performans55,56bile tek nokta mutasyonlar açıklanmıştır. Bu durumda, sunulan protokolü protokolleri için yüksek üretilen iş ifade gösterimleri57ardından bir ilk adım olabilir. Protokol sonraki ölçek-up için beslenen-toplu arazisi ile orta geliştirme için kullanılırsa, farklı üst microscale kampanyaları eleme clone tanımlandığı şekilde en iyi duruma getirilmiş orta ilgili Biyoproses koşulları için doğrulanması gerekir sanatçılar için farklı beslenme stratejileri ve yetiştirme medya52,58. Ayrıca, tanıtılan KriKit36 genel olarak geliştirilmiş bütünsel Biyoproses optimizasyonu için katkıda bulunabilir.Ancak son zamanlarda, aracı yeteneklerini de çok objektif optimizasyonu40, hangi-ebilmek var olmak hem de akış yukarı ve aşağı akım işlemleri59,60en iyi duruma getirme için önemli destek uzatılmıştır.

Modern rekombinant gen teknolojisi ilaç endüstrisi, hayvan besleme, organik kimya ve gıda işleme1,2,3çeşitli uygulamalarda teknik enzimler geniş kullanımını etkinleştirir. Endüstriyel Biyoteknoloji ve en iyi duruma getirilmiş rekombinant protein üretimi, önemli bir konunun teknik enzimler toplu miktarlarda yapımıdır ve her ikisi de strain ve Biyoproses Mühendisliği gereklidir. Verimli bir şekilde tasarlanmış üretim suşları üretimi için farklı genetik kitaplık mevcuttur örneğin, dengeli gen ifade4 veya artmış salgı verimliliği5.
Corynebacterium glutamicum amino asitler endüstriyel ölçekte6,7 büyük bir üretici ve rekombinant proteinler8 salgı üretimi için bir çekici konvansiyonel olmayan ifade ana temsil eden ,9. Genel salgı (sn) ve standart-arginin translocation (Tat) yolu C. glutamicum içinde varsa ve rekombinant protein salgılanması10için başarıyla uygulandı. Biyoproses mühendislik endüstriyel ölçekte, hem de protein g/L tutarları11 ve büyük ölçekli yılında bulundu Biyoproses inhomogeneities ilgili büyük sağlamlık salgılar yeteneği amino asit üretimle ilgili kapsamlı deneyim arazisi12,13, endüstriyel ölçekte Contegra proteinler salgı üretimi için umut verici bir platform organizma C. glutamicum olun.
Beslenme orta optimizasyonu rekombinant protein üretimi ile mikrobiyal sistemleri14,15,16,17 ve sonuç olarak, Orta ayarını artırmak için bilinen kompozisyon ise Biyoproses ödüllendirici bir adımda geliştirme ile ilgili en iyi verimlilik18,19,20,21. Uygulama mikrobiyal ekimi22,23,24 (MTPs) microtiter plakaların üzerinde yoğun araştırma geliştirme ve MTPs tasarımını mikrobiyal ekimi25 açtı ,26 ve MTP tabanlı microbioreactor (MBR) sistemleri ile online izleme ve çevresel gelişimi kontrol27,28. MBRs deneysel ekimi üretilen iş önemli bir artış sağlar. Ayrıca, reaktörler, biyoreaktörler, örneğin, kabarcık sütunlar veya karıştırılmış tank diğer türlerinden kaynaklanan MBR sistemleri mevcuttur mikrobiyal Biyoproses optimizasyonu29,30,31için, 32.
Genel olarak, en iyi duruma getirme çalışmaları DOE metodolojileri, tasarım değişkenleri arasındaki etkileşimler değerlendirmek veya yüksek boyutlu arama alanlarda azaltmak gibi ile birlikte daha da güçlü hale gelir artan deneysel işlem hacmi faydalanın. Sonuç olarak, MBR sistemleri, laboratuvar otomasyon ve DOE kombine kullanımı biyoteknoloji8,16,33,34,35içinde güçlü bir yöntem olduğunu kanıtlamıştır.
Bir iletişim kuralı medya optimizasyonu için state-of--art laboratuvar otomasyon, MBR teknolojisi online işlem izleme ve Kriging tabanlı veri analizi/deneysel tasarım ile birleştirerek sunulur. Kriging metodoloji bir MATLAB indirilen ve kullanılan araç kutusunda ("KriKit") uygulanan ücret36ücretsiz. Uygulama örnek olarak, CgXII en az orta bileşimi optimize ederek maksimizasyonu salgı yeşil ﬂuorescent protein (GFP) üretim C. glutamicum ile gösterilir. GFP titresi kolayca sayılabilir ve MBR sistemleri37,38,39üzerinde çalışmalar için modeli protein olarak yaygın olarak uygulanan en iyi duruma getirme amacı seçildi.
Sunulan çerçeve şekil 1' de gösterildiği dört adım bölünür. Adımları kutusu kareler tarafından belirtilir ve protokol bölümlerine karşılık gelir. Proje hedefleri tanımlamak ve gereken yöntemleri belirlemek için ilk adım (şekil 1A) olduğunu. DOE metodolojisi, MBR teknolojisi ve laboratuvar otomasyon kombinasyonu güçlü veri işleme talepleri artan bir deneysel üretilen iş sağlar. İkinci adım (şekil 1B) hassas tasarım değişkenleri (Yani, orta bileşenleri) en iyi duruma getirme amacı yüksek etkisi ile tespit amaçlamaktadır. Bu tasarım değişkenleri ilgi azaltılmış bir dizi yol açar. Üçüncü adım (şekil 1 c) kalan tasarım değişkenleri ve faiz amacı fonksiyonel ilişkisi daha ayrıntılı incelenmesi için yinelemeli bir optimizasyon oluşmaktadır. Gittikçe genişletilmiş veri kümesi kullanarak, Kriging yaklaşım ölçüsüz yerlerinde deneysel sonucunu tahmin etmek için uygulanır. Kriging modeli bir optimum veya Yaylası yeterli doğrulukta tahmin en kısa zamanda yinelemeli döngüsü durdurur. Sonuçları tespit optimum etrafında daha fazla duyarlılık analizi ile başlayan Dördüncü adımda (şekil 1 d) doğrulanır. Başlangıçta, büyük küçük harf duyarlı bileşenleri de en uygun bölgede büyük küçük harf duyarlı olmak tespit edilirse, bu üçüncü adımda yinelemeli en iyi duruma getirme işlemi sırasında geçerlidir olduğunu varsaymak makul. Daha sonra bu optimizasyon sonuçları doğrulamak için bir faaliyet tahlil veya SDS-sayfa gibi dik yöntemlerden uygulama tarafından tavsiye edilir.
Sunulan genel doğası pH değeri veya yetiştirme sıcaklığı gibi değişkenler farklı laboratuar ekipmanları, diğer ifade ana bilgisayarları ve hedef proteinler seçim yanı sıra daha fazla Biyoproses kolay adaptasyon için izin verir.Ayrıca, diğer en iyi duruma getirme hedefleri protein üretim hızı, belirli verim veya ürün kalitesi gibi diğer optimizasyon çalışmaları kapsamında sığdırmak için seçilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig1.jpg" style="font-size: 14px;"> 
Resim 1 : İş akışı en iyi duruma getirme çalışmanın. Dört çerçeve kutuları iletişim kuralı, "Hamile kalma çalışma ve tanımı yöntemleri" (Bölüm 1), "Duyarlılık analizi" (Bölüm 2), "Yinelemeli optimizasyonu" (Bölüm 3) ve "Doğrulama" (Bölüm 4) bölümlerine karşılık gelir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioLector</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>G-BL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowerplate</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>MTP-48-BOH</td>
			<td>For cultivation in the BioLector device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing foil</td>
			<td>m2p-labs</td>
			<td>F-GP-10</td>
			<td>Sterile sealing for Flowerplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>2016b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KriKit</td>
			<td>Forschungszentrum J&#252;lich</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Freely available, MATLAB installation required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janus pipetting robot</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Includes &#34;WinPrep&#34; software installation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-column deep well microplate</td>
			<td>E&#38;K Scientific</td>
			<td>EK-2034</td>
			<td>Container for medium stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplates, transparent, F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655101</td>
			<td>For Bradford protein assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;clear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655087</td>
			<td>For flourescence measurement in cell-free supernatants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Research&#160;plus multi-channel pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Facilitates manual liquid handling with microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruPAG&#160;Precast Gels</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PCG2002</td>
			<td>For SDS-Page analysis of cell-free supernantants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633&#8211;42 (2007)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generic protocol for optimization of heterologous protein production using automated microbioreactor technology

Bir çekirdek endüstriyel biyoteknoloji mikrobiyal üretim hücre fabrikaları kullanarak yinelemeli işlem zorlanma mühendislik ve optimizasyon Biyoproses koşullardan ilgilendirir. Bir önemli yönü ilgi mikrobiyal ürün oluşumu için en uygun bir ortam sağlamak için yetiştirme ortamının gelişmedir. İyi medya kompozisyon genel Biyoproses performansını önemli ölçüde etkileyebilir kabul edilir. Beslenme orta optimizasyonu rekombinant protein geliştirmek için bilinen üretim mikrobiyal sistemler ve böylece, bu Biyoproses geliştirme ödüllendirici bir adımdır. Özel tasarım yetiştirme ortamının yeterli ekimi üretilen iş, hızlı ürün analytics gibi destek için microbioreactor teknoloji talepleri sıkıcı bir görev olduğundan Ancak, edebiyat, çok sık standart medya tarifleri alınır sıvı güvenilirlik sağlamak için laboratuvar robot tarafından adımlar işleme. Ayrıca, gelişmiş matematiksel yöntemler rasyonel ölçüm verileri analiz ve verimli bir şekilde en iyi bilgi içerik elde etmek gibi paralel deney tasarlama için gereklidir.
Sunulan genel doğası farklı laboratuar ekipmanları, diğer ifade ana bilgisayarları ve hedef proteinler ilgi, hem de daha fazla Biyoproses parametreleri kolay uyum sağlar. Ayrıca, diğer en iyi duruma getirme hedefleri protein üretim hızı, belirli verim veya ürün kalitesi gibi diğer optimizasyon çalışmaları kapsamında sığdırmak için seçilebilir. Uygulamalı Kriging araç kutusu (KriKit) için tasarım, deneyler (geliştirilmiş bütünsel Biyoproses optimizasyonu için katkıda bulunan DOE) genel bir araçtır. Aynı zamanda akış yukarı ve aşağı akım işlemleri en iyi duruma getirme içinde önemli olabilen çok objektif optimizasyon destekler.

Salgılanan GFP titresi en üst düzeye çıkarma tanıtılan Protokolü uygulandı. 17 h ekiminin en iyi duruma getirme amacı seçildi sonra özellikle, GFP titresi. GFP tespiti Online Floresans basit ürün miktar izin. Ancak, GFP sinyal bir başvuru işleme alınan verilerle normalleştirme tekrarlanabilirlik ve karşılaştırılabilir sonuçlar sağlamak için vazgeçilmezdir. Ortam bileşenleri bir ön seçim Bölüm 1'de açıklanan bir rasyonel olarak gerçekleştirildi. Deneyler gerçekleştirilen Bölüm 1 talimatları: ıslak laboratuvar yordamlar parametrelerini tutarlılık ve tekrarlanabilirlik sonuçlarının tüm çalışma için tanımlı değil.
Bölüm 2'de anlatıldığı gibi bir başlangıç tarama daha fazla, daha ayrıntılı çalışma için en iyi duruma getirme amacı üzerinde önemli bir etkiye gösterilen ilgili bileşenleri tanımlamak için gerçekleştirildi. MBR MTP tabanlı sistem paralel olarak gerçekleştirilecek 48 deneyler sağlar. Bir MTP (48) üzerinde paralel deneyler mümkün olan maksimum sayıda ve ortam bileşenleri (11) yapar 2IVtoplam sayısı dikkate alınarak11-6 kesirli tasarım uygun bir seçim. Bu deneysel tasarım 32 deneyler oluşur ve incelenen medya bileşenlerinin her biri için temel etkisi tahmin sağlar. Kalan ekimi wells (16) başvuru orta ile deneyler birden çok çoğaltır tekrarlanabilirlik ve konumsal etkileri değerlendirmek için kullanılan. Diğer bir deyişle, her deney bir kez yapılır (hiçbir çoğaltır), hariç başvuru deneme (beş çoğaltır).
Tablo 1 tarama analizi sonuçlarını özetler. Kabul konsantrasyon aralığında, ortam bileşenleri çoğunluğu değişen amaç üzerinde belirgin bir etkisi yoktu. CA2 + ve Mg2 + en güçlü pozitif eğilimi gösterirken bileşen NH4+ güçlü bir negatif etki gösterir. Etkisi Mg2 + geçerli konsantrasyon aralığı için önemli olmayan ancak daha geniş bir konsantrasyon aralığı için olabilir. Sonuç olarak, NH4+ orta üzerinden atlamak için ve Ca2 + ve Mg2 + daha fazla deneylerde etkisini araştırmak için karar verildi.
Bölüm 3 GFP Floresans sinyal Ca2 + ve Mg2 +konsantrasyonları değişen sırasında en üst düzeye çıkarma için kullanılan yinelemeli en iyi duruma getirme yordamı açıklar. Yineleme 1, NH4+ atlanabilir hipotez test edildi. Ca2 + ve Mg2 + için konsantrasyon aralığı tarama analizinden kabul edilmiştir. NH4+ en düşük konsantrasyon sıfır olarak ayarlayın ve maksimum konsantrasyon tarama deneyden kabul edildi. Aşağıdaki denemelerinde bileşen konsantrasyonları üzerinde 3 x 3 x 3 ızgara 27 deneyler sonucunda tanımlanmış konsantrasyon aralığı içinde dağıtıldı. Tüm arazisi sırasında başvuru orta beş çoğaltır, içerdiği iç standart olarak ve MTP üzerinde konumsal hiçbir etkisi oluştuğunu emin olmak için hangi servis edilir. Kalan 16 kuyular için NH4+, Ca2 +ve Mg2 + konsantrasyonları belirli aralıkları içinde rastgele dağıtıldı.
Şekil 5 A ilk yineleme sonuçlarını görüntüler. Eksen etiketlerini bakın orijinal başvuru ortamda kullanılan bileşen konsantrasyonları Ref x tarafından belirtilen. Mavi yüzeyler KriKit yazılımı kullanılarak hesaplanan Kriging ilişkilendirmeye temsil eder. Her yüzey NH4+ için bir göreli yoğunlaşmasını düzeyi ile ilişkilidir (koyu mavi: 0 damalı hakem, x: 1 x hakem, açık mavi: 2 Ref x). Bu görsel temsili NH4+atlamak için olumlu olduğunu ortaya koymaktadır. İlişkilendirme yüzeyler Mg2 + ve hem Ca2 +, olumlu etkileri artan konsantrasyonları ile tüm uçaklar artış olarak da göster.
Yineleme 1 sonuçlarına göre bu konsantrasyon aralığı Ca2 + ve Mg2 + en yüksek konsantrasyonları ikiye katlayarak genişletmek ve deneysel tasarım penceresinin sağ üst köşesinde, değişen şekil 5 görmek için karar verildi B. içindeki bu aralıkta, 6 x 6 kılavuz üzerinde konsantrasyonları dağıtıldı. Bu tam konsantrasyon aralığında en iyi Kriging ilişkilendirme sonuçlar için önde gelen bir hatta dağıtım sağlar. Şekil 5 B gösterir Kriging ilişkilendirme Arsa olarak birleştirilmiş verileri üzerinde her iki yineleme (kırmızı noktalar ve sarı kareler) ölçülür. Her ikisi için Ca2 + ve Mg2 +, onların konsantrasyonlarının artması olumlu etkisi devam eder. Sonuç olarak, yordamı maksimum konsantrasyon ikiye katlayarak tekrar edilmiş ve böylece, deneysel tasarım penceresinin sağ üst köşesinde sınırlarını keşfetmek için taşındı.
Şekil 6 A kalan en iyi duruma getirme yordamı genel bir bakış verir. Yineleme 3 kadar toplanan veri küme analizi bir sınırlama Mg2 +, Yani, bir en iyi konsantrasyon aralığı Mg2 + pozitif etkisi tespit edilmiştir ortaya koydu. Bu nedenle sadece için Ca2 + (yineleme 4) konsantrasyon aralığı daha da genişletmeye karar verildi. Bu yordamı iki kez tekrarlandı (yineleme 5 ve 6) bir doygunluk GFP sinyal bulana. Bu doygunluk Ca-tuzu yağış, Ca2 +, hücrelere bulunmayan uygulanan konsantrasyonlarının için tarafından açıklanmıştır.
Deneysel sonuçlar her zaman gürültü ile tedirgin, elde edilen Kriging ilişkilendirme düzensiz görünür ve görsel denetleme yanlış sonuçlara neden olabilir. Ancak, ortam bileşenleri doymuş GFP sinyal için en iyi konsantrasyon aralığı da KriKit içinde uygulanan istatistiksel z -testi ile güvenilir bir şekilde tanımlanabilir. Z -test doğrudan Kriging yöntemi, Yani, tahmin değerleri ve tahmin belirsizlikler tarafından sağlanan iç istatistik bilgilerini kullanır. Şekil 6 B kararlı ve görüntülenmeyecektir KriKit araç olarak tanımlanan Plato gösterir.KriKit araç serbestçe kullanılabilir36 ve özellikleri kullanımını açıklar detaylı bir öğretici ile birlikte gelir.
İkiden fazla ilgili bileşenleri bulunursa, 3D görselleştirme sınırına ulaşır. KriKit film ya da "arsa eleme" gibi çeşitli diğer olası görsel temsili yöntemler sağlar. Eğer potansiyel en iyi tanımlanmış konsantrasyon aralığı içinde yatıyor, yeni deneyler beklenen geliştirme40,46kullanarak otomatik olarak tasarlanmıştır. Beklenen geliştirme üzerinde dayalı deneysel tasarım KriKit araç kutusunda entegre edilmiştir. Daha ayrıntılı bilgi yazılım belgelerinde bulunabilir.
Yinelemeli işlem sonrası, bir doğrulama sonuçları, bölüm D'de açıklandığı gibi yapılmıştır İlk varsayımlar geçerliliğini en iyi orta kompozisyon kullanarak ek duyarlılık analizi gerçekleştirerek kontrol edildi. Yani, tüm ilk ortam bileşenleri ilgi çeşitli ama Ca2 + ve Mg2 + onların en iyi konsantrasyon seviyeleri için kuruldu. Bu çalışmada en yüksek konsantrasyonları <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq8v2.jpg"> = 32 x Ref ve <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56234/56234eq9v2.jpg"> = 6.8 x Ref seçildi. Tablo 2 doğrulama tarama sonuçlarını gösterir. (Bkz. Tablo 1), NH eleme ilk duyarlılık benzer4+ hala önemli bir olumsuz etkiye sahiptir ve kalan etkileri hala yok denecek kadar azdır.
Kolay erişim nedeniyle ekimi süspansiyon GFP Floresans sinyalini ekstraselüler GFP titresi tüm deneyler sırasında ölçmek için kullanıldı. Doğrulama nedeniyle, GFP Floresans diğer ölçümler karşı doğrulandı. GFP Tat-yolu salgılanan, Floresans sinyal içi ve hücre dışı GFP arasında ayırımcılık değil. Böylece, arazisi başvuru orta ve en iyi duruma getirilmiş orta kullanarak çoğaltılamaz. Boş hücre ekimi supernatants floresan ölçüm yanı sıra, Bradford tahlil ve (yarı) tarafından protein içeriği sayısal-nitel GFP iyileştirme SDS-sayfa15tarafından görüntülenmiştir. Tüm elde edilen ölçüm sinyalleri yaklaşık iki katına arazisi için başvuru Orta olarak karşılaştırıldığında ve doğrulanmış en iyi duruma getirilmiş orta ile yaklaşık % 100 iyileşme salgı performansı en iyi duruma getirilmiş orta. Sonuç olarak, GFP belirli Floresans ekimi süspansiyon, en iyi duruma getirme amacı, Yani, hücre dışı GFP titresi için uygun bir ölçü kabul edilebilir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig2.jpg"> 
Resim 2 : Screenshot duyarlılık analizi için birim pipetting listeden. İlk sütundaki girdiler bir satır tüm birimleri için benzersiz bir tanımlayıcı ata; MTP de sıvı işleyicisi bkz. şekil 4Cworktable üzerinde hedef ekimi MTP sayısı tanımlayıcısıdır. Kalan sütunları birimleri için farklı çözümler ("Sln-01" için "Sln-15") pipetted için kodlayın. Bir satır toplu hacmi de buna karşılık gelen son ekimi birime karşılık gelen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig3.jpg"> 
Şekil 3 : Kontrol yazılımı "WinPREP" işleme sıvı ekran. Sol: bir aktarım komutu pipetted stok her çözüm için de dahil olmak üzere satır sipariş komutları. Daha önce son komutu inoculum ek için bir kullanıcı istemi tohum kültür masada tam zamanında yerleştirilir sağlamak için eklenir. Sağ: Kaynak aygıtlar varyasyon stokları (12 sütun benzeri wells ile iki derin kuyu tabak), reaktif yalak için dinlenme hisse senedi, su ve inoculum ve medya hazırlık hedef ekimi MTP dahil worktable, şeması. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig4.jpg"> 
Şekil 4 : Hisse senedi bir çözüm pipetting, kurulum için detaylı ekran görüntüleri derlenmesi. (A)Fe stokunun pipetting için komut açalım. İçinde kaynak aygıtlar ve kaynak iyi worktable üzerinde okuma çerçeve ve kırmızı sütun karşılık gelen derin kuyu plaka tarafından işaretlenir. Hedef aygıtlar ve hedef kuyu içinde etrafında mavi çerçeve ve hedef ekiminin MTP mavi wells tarafından işaretlenir. (B) detaylı örnek görünüm için bu adımı (Fe stok çözelti) pipetting birimlerin atamasında. 48 satır olan pipetting listeden okunan yerler sayısı. Besleme birimleri Fe hisse senedi çözüm için tüm hedef kuyuları için sütun 4 pipetting listesinde bulunur. Pipetting listedeki ilk sütun tanımlayıcıları ve transfer edilebilir, bkz: Şekil 2için birimlere içerdiğini unutmayın. (C) Ayrıntılar hedef Eh numaralandırma. #1 vb. işaretlenmiş kuyuya satır #1 karşılık gelen pipetting listesi yazılı birimleri pipetted. Wells #01, #08, #41 ve #48 karşılık gelir wells A01, A08, F01 ve F08 alfa-sayısal kodlama için hangi Ayrıca ekimi MTP kendisi yazdırılır. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig5.jpg"> 
Şekil 5 : Ayrıntılı ilk yineleme sonuçlarından. (A)Kriging ilişkilendirme Yineleme 1 deneysel verilere dayalı. Kırmızı noktalar onların veri kümesi gösteriyor. Karşılaştırma için tüm üç ilişkilendirme yüzeyleri bir mezarlığına yerleştirilmiştir (koyu mavi: 0 damalı hakem, x: 1 x hakem, açık mavi: 2 Ref x). Sonuçları bir alternatif temsil başka bir yerde15bulunabilir. (B) üzerinde deneyler dayalı Kriging ilişkilendirme gerçekleştirilen Yineleme 1 (kırmızı nokta) ve Yineleme 2 (sarı kareler).Bu şekilde sunulan veri bölümlerini önceden yayınlanmış15olmuştur. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56234/56234fig6.jpg"> 
Şekil 6 : Yinelemeli olarak toplanan optimizasyon sonuçları tasviri. (A)son Kriging tahmin modeli. (B) en uygun alan (kırmızı) istatistiksel tanımlaması tabanlı üzerinde istatistiksel z-testi, hangi KriKit tarafından sağlanır. Kutuları birbirini izleyen adımları yinelemeli tasarım ve yürütme deneyler gösterir. Bu şekilde sunulan veri bölümlerini önceden yayınlanmış15olmuştur. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56234/56234fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bileşen</td>
			<td>Normalleştirilmiş katsayısı ortalama değeri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>-0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-2.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>-0.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>0,06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA2 +</td>
			<td>1,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MG2 +</td>
			<td>0,45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: duyarlılık analizi sonuçlarını. Katsayısı değerleri ortalama etkisi maksimum değerine ilgili medya bileşeni konsantrasyon Merkezi değerinden artan zaman temsil eden. En iyi deneysel tasarımlar için gibi standart literatürde buldu ve burada, standart sapmayı temsil kullanılan doğrudan referans deney çoğaltılması nedeniyle deneysel varyasyon. Katsayısı değerleri maxium değeri (için bileşeni Ca2 +0.0422) tarafından normalleştirilmiş. Normalleştirilmiş ve mutlak katsayısı standart sapma 0.54 ve 0.0226, anılan sıraya göre.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bileşen</td>
			<td>Normalleştirilmiş katsayısı ortalama değeri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2 +</td>
			<td>-1.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MN2 +</td>
			<td>1,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zn2 +</td>
			<td>-3.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu2 +</td>
			<td>-0.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4+</td>
			<td>-15.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni2 +</td>
			<td>0,69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 +</td>
			<td>-0.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoO42-</td>
			<td>-0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BO33-</td>
			<td>-1.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2: son duyarlılık analizi sonuçlarını. Katsayısı değerleri ortalama etkisi maksimum değerine ilgili medya bileşeni konsantrasyon Merkezi değerinden artan zaman temsil eden. İsteğe bağlı bir deneysel tasarım kullanılan gibi standart sapma sadece en iyi duruma getirilmiş orta kompozisyon kullanarak deneysel varyasyonu bağlıdır. Deneysel varyasyon başvuru orta kullanarak varyasyon ile karşılaştırıldığında biraz arttı. Katsayısı değerleri maxium değeri (için bileşen Mn2 +0.0106) tarafından normalleştirilmiş. Normalleştirilmiş ve mutlak katsayısı standart sapma 3.63 ve 0.0385, anılan sıraya göre.

Watch this Scientific Journal Video about Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology at JoVE.com

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Otomatik Microbioreactor teknolojisini kullanarak Contegra Protein üretim duruma getirilmesi için genel iletişim kuralı

Bu el yazması mikrobiyal yetiştirme ortamının terzi tasarımı için genel bir yaklaşımı açıklar. Bu güvenilirlik ve sıvı ortam işleme hızı artırmak için laboratuvar robot tarafından desteklenen yeterli ekimi verimi için deneysel tasarım ve microbioreactor teknoloji Kriging tabanlı birleştiren yinelemeli bir iş akışı tarafından etkin hazırlık.

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Akustik Membran mikropartikül Teknoloji Geliştirme Özel Çin Hamsteri Yumurtalık-host Hücre Proteini Tahliller

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: Biyokütle Enzim Discovery ve Kokteyl Optimizasyonu Otomatik Platform

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

Ortak Liquid Handling Robotlar TruTip Teknoloji kullanarak Klinik Örneklerden DNA ve RNA yüksek verimlilik, Otomatik Ekstraksiyon

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Üç boyutlu Mürekkep Püskürtmeli Baskı Teknolojisi Kullanımı İnsan Kıkırdak Doku Fabrikasyon

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Tüm Blood adlı ultrasensitive Protein Algılama için Tam Otomatik Santrifüj mikroakışkan Cihazı

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Kimyasalların Üretimi<emKlebsiella pneumoniae</em&gt; Bambu Hidrolizatını Hammadde Olarak Kullanma

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Otomatik bir Mikrobioreactor sistemi kullanılarak Çin hamster yumurtlama hücrelerinden bir monoklonal antikor arıtma ve analitik

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Çin Hamster Yumurtalık Hücre Yetiştiriciliğinde Yüksek İş-İş BulaMetli Otomatik Mikro-Biyoreaktörler Kullanılarak Proses Optimizasyonu

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...