Name: a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy
Uploaded: 2018-01-17T10:45:00
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Ringraziamo sinceramente Shigeo Kita per i suoi preziosi suggerimenti e discussione. Ringraziamo anche John e Sumire Eckstein per loro lettura critica del manoscritto.

Nota: I campioni utilizzati in questo studio sono stati microrganismi, rapidamente congelati con propano in azoto liquido, congelare sostituiti in acetone contenente 2% tetrossido di osmio e incorporati in resina epossidica resina1,2,3, 4,5,6,7,8,</su...

<ol>
	<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+duplicates+in+early+G1+phase+in+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+an+ultrastructural+study.">The spindle pole body duplicates in early G1 phase in a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: an ultrastructural study.</a> Exp. Cell Res. 279, 71-79 (2002).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+to+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Exophiala dermatitidis: variation in morphology and positional relationship to the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> Eur. J. Cell Biol. 82, 531-538 (2003).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+dynamic+ultrastructure+of+yeast+cells+by+electron+microscopy.">Quantitative and dynamic ultrastructure of yeast cells by electron microscopy.</a> Recent Res. Dev. Microbiology. 8, 219-243 (2004).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Ohkusu, M., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans+examined+by+freeze-substitution+electron+microscopy.">Dynamics of the spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans examined by freeze-substitution electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 296, 257-265 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+of+the+pathogenic+yeast+Cryptococcus+neoformans:+variation+in+morphology+and+positional+relationship+with+the+nucleolus+and+the+bud+in+interphase+cells.">The spindle pole body of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans: variation in morphology and positional relationship with the nucleolus and the bud in interphase cells.</a> J. Electron Microsc. 59, 165-172 (2010).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Exophiala+yeast+cells+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Exophiala yeast cells determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> Curr. Trends Microbiol. 2, 1-12 (2006).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+of+Saccharomyces+cerevisiae+determined+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+electron+microscopy.">Structome of Saccharomyces cerevisiae determined by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning electron microscopy.</a> J. Electron Microsc. 60, 321-335 (2011).</li><li>Biswas, S. K., Yamaguchi, M., Naoe, N., Takashima, T., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+three-dimensional+structural+analysis+of+Exophiala+dermatitidis+yeast+cells+by+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning.">Quantitative three-dimensional structural analysis of Exophiala dermatitidis yeast cells by freeze-substitution and serial ultrathin sectioning.</a> J. Electron Microsc. 52, 133-143 (2003).</li><li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+Escherichia+coli.+cells+by+serial+ultrathin+sectioning+reveals+the+precise+cell+profiles+and+the+ribosome+density.">Structome analysis of Escherichia coli. cells by serial ultrathin sectioning reveals the precise cell profiles and the ribosome density.</a> Microscopy. 66, 283-294 (2017).</li><li>Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structome+analysis+of+virulent+Mycobacterium+tuberculosis,+which+survives+with+only+700+ribosomes+at+density+per+0.1+fl+cytoplasm.">Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes at density per 0.1 fl cytoplasm.</a> PLoS ONE. 10, e0117109 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-voltage+electron+microscopy+tomography+and+structome+analysis+of+unique+spiral+bacteria+from+the+deep+sea.">High-voltage electron microscopy tomography and structome analysis of unique spiral bacteria from the deep sea.</a> Microscopy. 65, 363-369 (2016).</li><li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryote+or+eukaryote?+A+unique+microorganism+from+the+deep-sea.">Prokaryote or eukaryote? A unique microorganism from the deep-sea.</a> J. Electron Microsc. 61, 423-431 (2012).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+sectioning+of+the+Myojin+parakaryote+discovered+in+the+deep+sea.">Ultrathin sectioning of the Myojin parakaryote discovered in the deep sea.</a> Cytologia. 78, 333-334 (2013).</li><li>Yamaguchi, M., Worman, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep-sea+microorganisms+and+the+origin+of+the+eukaryotic+cell.">Deep-sea microorganisms and the origin of the eukaryotic cell.</a> Jpn. J. Protozool. 47, 29-48 (2014).</li><li>Yamaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electron+microscopic+study+of+microorganisms:+from+influenza+virus+to+deep-sea+microorganisms.">An electron microscopic study of microorganisms: from influenza virus to deep-sea microorganisms.</a> JSM Mycotoxins. 65, 81-99 (2015).</li><li>Yamaguchi, M., Okada, H., Namiki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+specimen+preparation+for+freeze-substitution+and+serial+ultrathin+sectioning+of+yeast+cells.">Smart specimen preparation for freeze-substitution and serial ultrathin sectioning of yeast cells.</a> J. Electron Microsc. 58, 261-266 (2009).</li><li>Yamaguchi, M., Biswas, S. K., Suzuki, Y., Furukawa, H., Takeo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+a+pathogenic+yeast+Exophiala+dermatitidis+cell+by+freeze-substitution+and+serial+sectioning+electron+microscopy.">Three-dimensional reconstruction of a pathogenic yeast Exophiala dermatitidis cell by freeze-substitution and serial sectioning electron microscopy.</a> FEMS Microbiol. Lett. 219, 17-21 (2003).</li><li>Kozubowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+kinetochore+assembly+in+the+human+pathogenic+basidiomycetous+yeast,+Cryptococcus+neoformans.">Ordered kinetochore assembly in the human pathogenic basidiomycetous yeast, Cryptococcus neoformans.</a> mBio. 4, e00614-e00613 (2013).</li><li>Yamaguchi, M., Adachi, K., The Japanese Society of Microscopy, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specimen+support.">Specimen support.</a> Guide Book for Electron Microscopy. , 52-57 (2011).</li><li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+films.">Support films.</a> Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Application. , 216 (2000).</li><li>Yamaguchi, M., Kita, S., The Japanese Society of Microscopy, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+sectioning.">Ultrathin sectioning.</a> Guide Book for Electron Microscopy. , 40-52 (2011).</li><li>Yamaguchi, M., Aoyama, T., Yamada, N., Chibana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+hydrophilicity/hydrophobicity+of+the+plasma-polymerized+naphthalene+film+(Super+support+film)+and+other+support+films+and+grids+in+electron+microscopy.">Quantitative measurement of hydrophilicity/hydrophobicity of the plasma-polymerized naphthalene film (Super support film) and other support films and grids in electron microscopy.</a> Microscopy. 65, 444-450 (2016).</li><li>Kita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+method+for+obtaining+serial+ultrathin+sections+using+new+small+tools.">Reliable method for obtaining serial ultrathin sections using new small tools.</a> Kenbikyo. 46, 253-257 (2011).</li><li>Yamaguchi, M., Shimizu, M., Yamaguchi, T., Ohkusu, M., Kawamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+use+of+uranyl+acetate+solution+in+section+staining+in+transmission+electron+microscopy.">Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy.</a> Plant Morphology. 17, 57-59 (2005).</li><li>Hayworth, K. J., Kasthuri, N., Schalek, R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automating+the+collection+of+ultrathin+serial+sections+for+large+volume+TEM+reconstructions.">Automating the collection of ultrathin serial sections for large volume TEM reconstructions.</a> Microsc. Microanal. 12, 86-87 (2006).</li><li>Hildebrand, D. G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+serial-section+electron+microscopy+in+larval+zebrafish.">Whole-brain serial-section electron microscopy in larval zebrafish.</a> Nature. 545, 345-349 (2017).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2, e329 (2004).</li><li>Heymann, J. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> J. Struct. Biol. 155, 63-73 (2006).</li></ol>

Il metodo qui presentato non richiede costose attrezzature. Richiede solo un rack di alluminio (Figura 3), tre-fessura griglie (Figura 6C), tenuta di sezione loop (Figura 10a), acqua di superficie-sensibilizzazione loop (Figura 11a) e un tubo di colorazione (Figura 13). Ci sono molte caratteristiche del presente metodo. La gran parte del campione viene utilizzata per regola...

Tecnica di sezionamento ultrasottile seriale corretta è indispensabile per lo studio di cellule e componenti cellulari tridimensionalmente a livello microscopico dell'elettrone. Abbiamo studiato la dinamica del corpo del mandrino palo nel ciclo cellulare delle cellule di lievito e ha rivelato i cambiamenti morfologici delle loro ultrastruttura durante il ciclo cellulare ed il tempo di duplicazione1,2,3, 4,5. Nel 2006, abbiamo coniato una nuova parola 'structome' combinando 'struttura' e '-ome' e l'ha definita il 'informazioni strutturali quantitative e tridimensionale di una cella intera a livello microscopico dell'elettrone' 6,7.
Dall'analisi di structome, che richiede tecnica seriale di sezionamento ultrasottile, si è constatato che una cellula di lievito Saccharomyces cerevisiae e Exophiala dermatitidis ha circa 200.000 ribosomi7,8, un Escherichia coli cella aveva 26.000 ribosomi9, una cella di tubercolosi del micobatterio avuto 1.700 ribosomi10 e batteri a spirale Myojin avevano solo 300 ribosomi11. Queste informazioni sono utili nella stima non solo il tasso di crescita in ogni organismo, ma anche nell'identificazione di specie9.
Inoltre, analisi di structome ha portato alla scoperta di un nuovo organismo; Parakaryon myojinensis è stato trovato nel mare profondo al largo delle coste del Giappone, la cui struttura di cella erano un intermedio tra quelli dei procarioti e negli eucarioti12,13,14,15. Allo stato attuale, tecnica di sezionamento ultrasottile seriale è considerato essere così difficile che ci vorrebbe molto tempo per master. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo affidabile in cui chiunque può eseguire il sezionamento seriale ultrasottile senza difficoltà.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Formvar making apparatus</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>652</td>
			<td>W 180 x D 180 x H 300 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Matsunami Co. Ltd., Osaka</td>
			<td>-</td>
			<td>76 x 26 x 1.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum rack with 4-mm holes</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>658</td>
			<td>W 30 x D 25 x H 3 mm, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>SMZ 645</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for stereomicroscope</td>
			<td>Nikon Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>SM-LW 61 Ji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Tilting mechanism equipped, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination for trimming stage</td>
			<td>Sunmag Co.Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic trimming blade</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>5240</td>
			<td>EM-240, Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for trimming</td>
			<td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td>
			<td>-</td>
			<td>45&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife for ultrathin sectioning</td>
			<td>Diatome Co. Ltd., Switzerland</td>
			<td>-</td>
			<td>45&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>-</td>
			<td>Ultracut S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesa cut</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna</td>
			<td>-</td>
			<td>Mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Neoprene W solution</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special 3-slit nickel grid</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2458</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special 3-slit copper grid</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>2459</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Section-holding loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>526</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-surface-raising loop</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>527</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining tube</td>
			<td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>463</td>
			<td>Refer to this paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-specimen holder</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>EM-11170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEM-1400</td>
			<td>JEOL Co. Ltd., Tokyo</td>
			<td>-</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy

Osservazione di cellule e componenti delle cellule in tre dimensioni ad alto ingrandimento in microscopia elettronica di trasmissione richiede la preparazione di sezioni ultrasottili di serie dell'esemplare. Anche se la preparazione di sezioni ultrasottili seriale è considerato essere molto difficile, è piuttosto facile se viene utilizzato il metodo corretto. In questa carta, indichiamo una procedura dettagliata per ottenere in modo sicuro seriale sezioni ultrasottili di microrganismi. I punti chiave di questo metodo sono: 1) per utilizzare la gran parte dell'esemplare e regolare il bordo di superficie e coltello di esemplare affinché siano paralleli tra loro; 2) per tagliare le sezioni di serie in gruppi ed evitare difficoltà di separare sezioni usando un paio di ciocche di capelli durante il recupero di un gruppo di sezioni di serie sulle griglie a fessura; 3) utilizzare un 'sezione-holding loop' e evitare di confondere l'ordine dei gruppi di sezione; 4) per utilizzare un ciclo di acqua di superficie-sensibilizzazione e assicurarsi che le sezioni siano posizionate all'apice dell'acqua e che toccano la griglia in primo luogo, al fine di metterli nella posizione desiderata sulle griglie; 5) per utilizzare il film di supporto su un rack di alluminio e rendere più facile per recuperare le sezioni sulle griglie ed evitare grinze della pellicola supporto; e 6) utilizzare un tubo di colorazione ed evitare accidentalmente rompere il film di supporto con le pinzette. Questo nuovo metodo permette di ottenere sezioni ultrasottili seriale senza difficoltà. Il metodo permette di analizzare la struttura cellulare dei microrganismi ad alta risoluzione in 3D, che non può essere realizzato utilizzando il metodo ultramicrotomo raccolta nastro automatico e blocco-faccia seriale o fascio ionico focalizzato, microscopia elettronica a scansione.

In questo protocollo, tre-fessura griglie sono stati utilizzati per raccogliere le sezioni di serie. Le griglie sono costituite di nichel o rame. Le sezioni di serie vengono inserite nella fessura centrale. Le fessure su entrambi i lati sono necessari per visualizzare le sezioni quando raccoglierli con la griglia. Per mantenere le griglie parallele con le sezioni di serie quando li raccogliendo con le pinzette (Figura 11d), la maniglia è piegata (<strong cla...

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A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Questo studio presenta procedure affidabili e facili per ottenere sezioni ultrasottili seriale di un microorganismo senza costose attrezzature in microscopia elettronica di trasmissione.

Un metodo per ottenere il seriale sezioni ultrasottili di microrganismi in microscopia elettronica a trasmissione

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

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JoVE Journal

Engineering

Revealing Dynamic Processes of Materials in Liquids Using Liquid Cell Transmission Electron Microscopy

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